一种可用于神经修复的干细胞凝胶及其制备方法和应用

文档序号：121107 发布日期：2021-10-22 浏览：32次 >En<

阅读说明：本技术 一种可用于神经修复的干细胞凝胶及其制备方法和应用 (Stem cell gel for nerve repair and preparation method and application thereof ) 是由曹毓琳滕睿頔程世翔白志惠于 2021-06-18 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种可用于神经修复的干细胞凝胶的制备方法,该制备方法具体包括以下步骤：(1)合成质粒序列：将G-CSF基因序列与2A串联合成G-CSF-2A片段,再与SDF-1基因序列串联合成G-CSF-2A-SDF-1片段,再将G-CSF-2A-SDF-1片段克隆到pRRLSIN.cPPT病毒表达载体上,即得质粒序列；(2)构建病毒：将质粒序列与psPAX2和PMD2.G采取三质粒包装系统进行病毒包装,即得携带表达G-CSF、SDF-1蛋白的慢病毒；(3)感染细胞：将步骤(2)制得的慢病毒加入P2代MSC细胞中进行感染,即得表达G-CSF和SDF-1的间充质细胞；(4)制备凝胶材料,将表达G-CSF和SDF-1的间充质细胞重悬于海藻酸钠水溶液中,再将重悬有细胞的海藻酸钠水溶液与氯化钙水溶液混合均匀,即得；该干细胞凝胶对神经损伤有很好的治疗效果。(The invention provides a preparation method of stem cell gel for nerve repair, which specifically comprises the following steps: (1) plasmid sequence synthesis: connecting the G-CSF gene sequence with 2A in series to synthesize a G-CSF-2A fragment, connecting the G-CSF-2A-SDF-1 fragment with the SDF-1 gene sequence in series to synthesize a G-CSF-2A-SDF-1 fragment, and cloning the G-CSF-2A-SDF-1 fragment to a pRRLSIN. cPPT virus expression vector to obtain a plasmid sequence; (2) constructing a virus: carrying out virus packaging on the plasmid sequence, psPAX2 and PMD2.G by adopting a three-plasmid packaging system to obtain lentivirus carrying expression G-CSF and SDF-1 proteins; (3) infecting the cells: adding the lentivirus prepared in the step (2) into MSC (mesenchymal stem cell) of P2 generation for infection to obtain mesenchymal cells for expressing G-CSF (granulocyte-colony stimulating factor) and SDF-1; (4) preparing a gel material, namely resuspending the mesenchymal cells expressing G-CSF and SDF-1 in a sodium alginate aqueous solution, and uniformly mixing the sodium alginate aqueous solution with the resuspended cells with a calcium chloride aqueous solution to obtain the gel material; the stem cell gel has good therapeutic effect on nerve injury.)

技术领域

本发明属于细胞技术领域，具体涉及一种可用于神经修复的干细胞凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

治疗神经损伤疾病依然是世界疑难疾病之一，就目前而言，在我们国家治疗神经损伤，要想完全治愈是比较困难的，神经损伤在医学上是不可再生的一种疾病，也就是说当神经当中的细胞受到损伤后，很难让细胞再生，导致治疗困难。

干细胞移植被认为是修复神经损伤最有前景的方法之一，但具有修复神经损伤的药物和成分有很多，其治疗效果不尽相同，如何选择具体的成分使其组合后发挥更好的技术效果以及如何对其进行局部高效运用尚缺乏有效手段。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种可用于神经修复的干细胞凝胶及其制备方法。

该制备方法具体包括以下步骤：

(1)合成质粒序列：将G-CSF基因序列与2A串联合成G-CSF-2A片段，再与SDF-1基因序列串联合成G-CSF-2A-SDF-1片段，再将G-CSF-2A-SDF-1片段克隆到pRRLSIN.cPPT病毒表达载体上，即得质粒序列；

(2)构建病毒：将质粒序列与psPAX2和PMD2.G采取三质粒包装系统进行慢病毒包装，使用HEK-293T细胞作为慢病毒的包装细胞，即得携带表达G-CSF、SDF-1蛋白的慢病毒；

(3)感染细胞：将步骤(2)制得的携带表达G-CSF、SDF-1蛋白的慢病毒加入P2代间充质干细胞中进行感染，即得表达G-CSF和SDF-1的间充质细胞；

(4)制备凝胶材料：将表达G-CSF和SDF-1的间充质细胞重悬于海藻酸钠水溶液中，制得重悬有细胞的海藻酸钠水溶液，再将重悬有细胞的海藻酸钠水溶液与氯化钙水溶液混合均匀，即得干细胞凝胶。

进一步地，步骤(1)将G-CSF-2A-SDF-1片段克隆到pRRLSIN.cPPT病毒表达载体上，选取的酶切位点是NheI和XbaI。

进一步地，步骤(1)中的质粒序列的结构如下：

pLenti-CMV-G-CSF-2A-SDF-1-EGFP-3FLAG-PGK-Puro。

进一步地，步骤(2)中质粒序列与psPAX2和PMD2.G在体系中的质量比如下：质粒序列:psPAX2:PMD2.G＝4:2-5:1-3。

进一步地，步骤(3)感染细胞中，感染后48小时后，SDF-1的阳性比例为58.2％，通过嘌呤霉素筛选12天，SDF-1阳性细胞比例提升至92.2％。

进一步地，步骤(4)制备凝胶材料中，海藻酸钠水溶液的浓度为0.1g/L，氯化钙水溶液的浓度为0.1g/L。

进一步地，步骤(4)制备凝胶材料中，每10ml海藻酸钠水溶液中重悬于1×10⁸个细胞。

进一步地，步骤(4)中，氯化钙水溶液与重悬有细胞的海藻酸钠水溶液等体积混合。

本发明还提供了一种可用于神经修复的干细胞凝胶，由以上方法制备而成。

本发明还体供了可用于神经修复的干细胞凝胶在治疗神经损伤的药物中的应用。

本发明提供的培养方法具有以下技术效果：本发明提供的可用于神经修复的干细胞凝胶对神经损伤有很好的治疗效果。

附图说明

图1.为携带表达G-CSF、SDF-1蛋白的慢病毒加入P2代间充质干细胞中进行感染通过嘌呤霉素筛选前后SDF-1阳性细胞比例；

图2为携带表达G-CSF、SDF-1蛋白的慢病毒加入P2代间充质干细胞中进行感染通过嘌呤霉素筛选前后G-CSF阳性细胞比例；

图3.为实施例1制备的干细胞凝胶的显微镜下观察图；

图4.为各组对大鼠术后2、4、8、12周时测定的SFI值统计图；

图5.为各组对大鼠术后2、4、8、12周时测定的BBB分值统计图；

其中，图4和图5的横坐标均为时间，纵坐标均为评分。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供了一种可用于神经修复的干细胞凝胶的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)合成质粒序列：G-CSF-2A-SDF-1片段由北京睿博兴科生物技术有限公司提供，通过如下方法合成：将G-CSF基因序列(如SEQ ID NO:1所示)与2A(2A是来自一点褐翅蛾病毒(TaV)的2A元件，以2A连接的基因在转入细胞后能正常翻译和表达，可作为一种构建多顺反子载体的有效工具用于基因转移)串联合成G-CSF-2A片段(如SEQ ID NO:2所示)，再与SDF-1基因序列(如SEQ ID NO:3所示)串联合成G-CSF-2A-SDF-1片段(如SEQ ID NO:4所示)，需要说明的是，本发明实施例对G-CSF-2A-SDF-1片段的合成方法不做具体限定，符合本发明构思的已知技术均在本发明实施例的选择范围之内。再将G-CSF-2A-SDF-1片段克隆到pRRLSIN.cPPT病毒表达载体上，选取的酶切位点是NheI和XbaI，即得质粒序列；

其中，质粒序列的结构如下：

pLenti-CMV-G-CSF-2A-SDF-1-EGFP-3FLAG-PGK-Puro；

将G-CSF-2A-SDF-1片段克隆到pRRLSIN.cPPT病毒表达载体上的方法如下：

所使用的连接酶为Solution I连接酶(Solution I连接酶为DNA连接酶，购自TAKARA公司)；

①连接体系：

pRRLSIN.cPPT病毒表达载体与G-CSF-2A-SDF-1片段共使用5ul，pRRLSIN.cPPT病毒表达载体:G-CSF-2A-SDF-1片段＝1:3-1:10；

Solution I 5ul

②温度条件(Pcr仪)：

65° 3min

4° 3min

16° 35min

Solution I时间控制在30min-60min；

胶分离

③跑胶

0.70g琼脂糖，90ml 1*TAE，4ulGoodView，跑胶电压为120V，Maker和样品各一个；

其中，琼脂糖购自赛默飞，TAE缓冲液(TAE Buffer)是由三羟甲基氨基甲烷、乙酸和乙二胺四乙酸组成的缓冲液；

50×TAE Buffer配制方法：

称量Tris 242克，EDTA18.612克于1升的烧杯中；

向烧杯中加入约800毫升去离子水，充分搅拌均匀；

加入57.1毫升的冰乙酸，充分溶解；

用NaOH调pH至8.3，加去离子水定容至1升后，室温保存，使用时稀释100倍即1*TAE；

GoodView核酸染料，购自北京赛百盛基因技术有限公司；

Maker(DNA标志物)，DL2000 Plus，购自赛默飞公司；

①切胶

切跑的最慢的条带，用1.5ml离心管分装，称重，每个在0.2g到0.3g之间；

胶回收(Gel Extraction Kit)

①加入三倍体积QG(0.1g＝300ul)，55度10min，隔3min涡旋助溶或至胶溶解；

②加入一倍样品体积的异丙醇，轻轻涡旋或颠倒混匀；

③过柱，将溶液分次加入柱中，静置3-5分钟，12000rmp，2min；一般胶回收效率低，可以经量用一个柱子回收；

④洗涤，加入750ul PE，静置3-5分钟，12000rmp，2min；

⑤重复上一步骤；

⑥12000rmp，空转5分钟，开盖晾5-10min，使乙醇挥发完全；

⑦向膜中央，滴30ul EB，静置5min，12000rmp，3-5min，收集溶液，即得质粒序列；

其中，胶回收试剂盒购自Sigma-Aldrich公司；QG、PE和EB均为试剂盒中的试剂的名称；

(2)构建病毒：将质粒序列与psPAX2和PMD2.G采取三质粒包装系统进行慢病毒包装，包装慢病毒所用的DNA总质量为30μg，使用HEK-293T细胞作为慢病毒的包装细胞，转染的方法为磷酸钙转染，质粒序列与psPAX2和PMD2.G在体系中的质量比如下：质粒序列:psPAX2:PMD2.G＝4:3:2，即得携带表达G-CSF、SDF-1蛋白的慢病毒；

(3)感染细胞：将10μl步骤(2)制得的慢病毒加入总数为1.5×10⁵的P2代间充质干细胞中进行感染，在感染后48小时后，通过嘌呤霉素进行筛选；即得表达G-CSF和SDF-1的间充质细胞；其中，筛选前后的SDF-1阳性细胞比例见图1，筛选前后的G-CSF阳性细胞比例见图2，慢病毒感染后SDF-1阳性比例为58.2％，G-CSF阳性比例为48.4％，通过嘌呤霉素筛选12天，未成功感染的细胞死亡，SDF-1阳性比例提升至92.2％，G-CSF阳性比例提升至97.2％。；

(4)制备凝胶材料：将1g海藻酸钠溶解于100ml纯水中，搅拌至溶解，高压灭菌，制得海藻酸钠水溶液，将1×10⁸个表达G-CSF和SDF-1的间充质细胞重悬于10ml海藻酸钠水溶液中，制得重悬有细胞的海藻酸钠水溶液，将1g氯化钙溶解于100ml纯水中，高压灭菌，制得氯化钙水溶液，将以上的氯化钙水溶液与重悬有细胞的海藻酸钠水溶液混合均匀，即得干细胞凝胶；

本发明所有实施例、对照例和试验例所使用的间充质干细胞均为脐带间充质干细胞，脐带间充质干细胞是通过脐带分离培养得到，脐带来源为长春中医药大学附属医院，脐带间充质干细胞的制备方法如下：

原代细胞制备：

取出脐带，保存液仍留于采集瓶中；

洗涤脐带：无菌有齿镊转移脐带至10cm无菌培养皿中，加入75％酒精浸没整根脐带，时间不超过2min消毒灭菌后，转入新的平皿中，加入20mlDPBS/PBS冲洗，重复3次，去除血渍；

无菌组织剪将脐带剪成约3cm数段，加入20mlDPBS/PBS洗涤血凝块，重复洗涤3次直至基本去除血渍，洗涤液较清澈；

剔除血管：用无菌有齿镊将脐带小段转移至空的无菌培养皿中，在脐带小段一端脐静脉和脐动脉间的位置撕开一小口，将静脉剪开，剔除静脉血管壁，使华通氏胶体层完全裸露在表面；

分离华通氏胶：用有齿镊将华通式胶撕下(注意不要带动脉血管)，放入无菌平皿中，加入20mlDPBS/PBS，洗涤胶体。

洗涤胶体：将获得的胶体转移至另一培养皿，加20ml的DPBS/PBS，洗去血细胞，重复1次；

组织匀浆：用无菌组织剪，将组织剪切成组织匀浆块；

将组织匀浆块分为两部分，一部分用于培养原代细胞，一部分用于组织冻存，(可以先将需要冻存的组织块按4.3.12离心)；

用于培养原代细胞的组织匀浆块中加入适量培养液，吹打均匀，平均接种至T75培养瓶中，每T75培养瓶接种约30块组织匀浆块，补足5ml培养液培养；

平置培养瓶，轻轻晃动几下，使组织块尽量均匀分布于整个底面，将培养瓶放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱，培养条件：37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2％；

补液：

脐带华通氏胶培养至第3天观察培养瓶，根据情况进行补液，若液体变黄或瓶底变干，补液2ml(保证组织块不飘起)，继续培养；

换液：

培养至第8天左右进行一次全量换液，倒掉旧的培养基，补足10ml新鲜培养基，放置二氧化碳恒温恒湿培养箱继续培养；

原代收集：

脐带华通氏胶培养的第12天，取2个培养瓶在倒置显微镜下观察细胞形态有无异常，细胞有无污染，如观察到细胞融合度达到70％-80％时，即可进行消化收获；

收集旧的培养基：轻轻摇晃培养瓶，使贴壁未牢的组织块脱落，开盖，将旧的培养基与脱落的组织块一并转移至50ml离心管，2-3瓶合并到1管中；

DPBS/PBS轻轻冲洗细胞培养瓶2遍；

消化：往洗涤后的培养瓶中加入0.125％胰酶-EDTA，每瓶1ml，轻摇叠加培养瓶，使每个培养瓶的消化液都能浸润培养瓶底面。在超净台中静置1min后，取出培养瓶轻轻拍打，取一培养瓶到倒置显微镜下观察，待见镜下细胞变圆，大部分细胞脱落即表示消化可终止；

终止消化：往可终止消化的培养瓶中加入消化终止液(原代细胞用完全培养基终止)，每个5ml，进行消化终止，再将消化终止后培养瓶中细胞和组织块的悬液转移至50ml的离心管中，然后用10ml的DPBS/PBS洗涤粘附在培养瓶中的细胞残余，并将洗涤后的细胞悬液一并转移至50ml的离心管中(加入胰酶到终止消化，时间不超过5min)；

离心洗涤：将离心管配平后放入离心机，1500rpm离心5min；

合并离心后的细胞沉淀：离心后将洗涤上清弃去，用适量完全培养基重悬细胞，轻轻吹打混匀，最终将重悬后的细胞悬液合并到1个50ml离心管中；

细胞传代：

传代数量：原代细胞按1个T75瓶传1个或2个T175瓶进行传代(依据细胞数量)；

根据最终传代T175培养瓶数量，及洁净工作台一次能放置T175培养瓶的容量，将所需T175培养瓶排成一排，竖直摆放在洁净工作台内，在瓶壁上标注细胞编码、细胞代数与培养时间等信息后，开盖，用25ml移液管加入培养基，每个23ml；

种瓶：将细胞吹打均匀后分别往每个加了23ml培养基的T175培养瓶中加入2ml细胞悬液，使每个T175培养瓶中的细胞及培养基的最终体积为25ml；盖盖、平置并摇匀：加完细胞悬液后将T175培养瓶盖盖并拧紧，以最多4个为一摞将培养瓶平置，匀速摇晃10sec，使加入细胞悬液能均匀分布整个培养瓶底面。第一次传代记作P1；

放入CO2培养箱培养：将种瓶摇匀后的T175培养瓶以3个为一摞叠加平稳放入CO2培养箱，37.0±0.5℃的温度、5.0±0.2％的CO2浓度、饱和湿度条件下培养至细胞融合度达到85-90％，即得；

将制得的干细胞凝胶放置于电镜下观察，结果见图3，由下图可观察到载体中的孔道远小于1μm，包裹在里面的细胞不会爬出该生物材料，将会在原位发挥旁分泌效果。

实施例2

本实施例提供了一种可用于神经修复的干细胞凝胶的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)合成质粒序列：与实施例1相同；

(2)构建病毒：将质粒序列与psPAX2和PMD2.G采取三质粒包装系统进行慢病毒包装，包装慢病毒所用的DNA总质量为30μg，使用HEK-293T细胞作为慢病毒的包装细胞，转染的方法为磷酸钙转染，质粒序列与psPAX2和PMD2.G在体系中的质量比如下：质粒序列:psPAX2:PMD2.G＝4:5:1，即得携带表达G-CSF、SDF-1蛋白的慢病毒；

(3)感染细胞：将10μl步骤(2)制得的慢病毒加入总数为1.5×10⁵的P2代间充质干细胞中进行感染，在感染后48小时后，通过嘌呤霉素进行筛选；即得表达G-CSF和SDF-1的间充质细胞；

实施例3

本实施例提供了一种可用于神经修复的干细胞凝胶的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)合成质粒序列：与实施例1相同；

(2)构建病毒：将质粒序列与psPAX2和PMD2.G采取三质粒包装系统进行慢病毒包装，包装慢病毒所用的DNA总质量为30μg，使用HEK-293T细胞作为慢病毒的包装细胞，转染的方法为磷酸钙转染，质粒序列与psPAX2和PMD2.G在体系中的质量比如下：质粒序列:psPAX2:PMD2.G＝4:2:3，即得携带表达G-CSF、SDF-1蛋白的慢病毒；

对照例1

该对照例提供了一种干细胞凝胶的制备方法，与实施例1的不同之处在于，合成质粒序列步骤如下：通过基因合成的方法得到G-CSF基因序列，将G-CSF基因序列片段克隆到pRRLSIN.cPPT病毒表达载体上，即得质粒序列，G-CSF基因序列片段由北京睿博兴科生物技术有限公司提供。

对照例2

该对照例提供了一种干细胞凝胶的制备方法，与实施例1的不同之处在于，合成质粒序列步骤如下：通过基因合成的方法得到SDF-1基因序列，将SDF-1基因序列克隆到pRRLSIN.cPPT病毒表达载体上，即得质粒序列，SDF-1基因序列片段由北京睿博兴科生物技术有限公司提供。

对照例3

该对照例提供了一种干细胞凝胶的制备方法，与实施例1的不同之处在于，对照例3使用神经生长因子基因序列(如SEQ ID NO:5所示)代替G-CSF-2A-SDF-1的片段克隆到pRRLSIN.cPPT病毒表达载体上，其中，神经生长因子基因序列从武汉大学人民医院风湿免疫科谢萍老师处获取。

试验例1对大鼠坐骨神经缺损治疗试验

取100只3月龄SD大鼠，分为健康对照组和模型组，除健康对照组取10只外，其余90只为模型组，将模型组的大鼠用钳夹法建立大鼠坐骨神经损伤模型，操作方法：腹腔注射10％水合氯醛麻醉，固定，常规备皮、消毒后，钝性分离左大腿肌肉，显露坐骨神经，在大腿根部用动脉瘤夹钳夹坐骨神经，钳夹10s，反复3次，造成3mm的损伤区，手术过程中，显微镜观察到其外膜连续而神经轴突中断，含抗生素盐水清洁伤口后，缝合组织，术后，以大鼠左下肢反应迟钝，屈伸力量明显减弱，为造模成功的标准，健康对照组大鼠仅暴露坐骨神经，而不用夹钳损伤神经，随后缝合组织；剔除造模不合格的个体，在剩余合格的大鼠中取80只，按照随机数字表法将其分为损伤组、实施例1-3组、对照例1-3组和普通细胞组，每组10只。

术后用微量注射器将实施例1-3组的干细胞凝胶和对照例1-3组的干细胞凝胶、未做转基因修饰的间充质干细胞分别植入实施例1组、对照例1-3组和普通细胞组的大鼠坐骨神经损伤处，健康对照组和损伤组分别注入等量生理盐水，注射3min，留针5min，注射完成后，继续饲养12周。

坐骨神经功能指数(SFI)评估方法如下：

自制一长60cm、宽10cm、高10cm的两端开口木槽，将70g白纸裁成与木槽等长等宽后铺于槽底，大鼠双后肢用颜料浸于双踝关节着色后，将大鼠放于槽的一端，使其自行向槽的另一方行走，每侧后肢各留下5-6个足印，选择印迹清晰的足印分别测量正常足(N)和伤侧足(E)的3个指标：A、PL(足印长度)；B、TS(足趾宽度)；C、IT(中间足趾宽度)，将上述指数代入Bain公式，计算出坐骨神经功能指数。Bain公式：

SFI＝109.5(ETS-NTS)/NTS-38.3(EPL—NPL)/NPL+13.3(EIT—NIT)/NIT-8.8，坐骨神经功能指数SFI＝0为正常，-100为完全损伤。采集各组2、4、8、12周(细胞移植后)大鼠足印进行计算、统计结果如图4。

大鼠运动功能评估如下：

采用BassoBeattieBresnahan(BBB)运动功能评分法评估大鼠运动功能，自大鼠造模后2、4、8、12周(细胞移植后)对大鼠模型进行盲法评分，BBB分值介于0(完全失去神经支配功能)-21分(运动正常)，试验结果如图5。

由图4和图5可知，整体比较各组大鼠SFI组间、时间差异较大。三组干细胞凝胶组治疗效果最佳，恢复程度最接近健康对照组，对照例1-3组和普通细胞组治疗效果依次递减，根据BBB运动功能评分法评估也能得到近似结果，故本发明提供的方法制备的干细胞凝胶对神经损伤治疗效果可观。

综上，仅为本发明之较佳实施例，不以此限定本发明的保护范围，凡依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆为本发明专利涵盖的范围之内。

序列表

<120> 一种可用于神经修复的干细胞凝胶及其制备方法和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tctagagcca ccatggattt tcaggtgcag attttcagct tcctgctaat cagtgcctca 60

gtcataatgt ccagaggaga tataatgatg agccagagcc ccagcagcct gaccgtgagc 120

gtgggcgaga aagtgacagt gagctgtaag agcagccagt ctctgctgta tacatctagc 180

cagaagaatt atctggcttg gtatcagcag aaacctggcc agtctcctaa actgcttatc 240

tattgggcct ctactaggga gagcggcgtg ccagatagat tcacaggaag cggatctgga 300

acagatttta cactgacaat tacatctgtg aaagccgacg atctggccgt gtactattgt 360

cagcagtatt acgcttatcc ttggacattt ggcggcggca ccaagctgga gatcaagggc 420

ggcggaggca gcggcggcgg cggcagcggc ggaggcggca gccaggtgca gctgcagcag 480

agcggccccg agctggtgag acccggcgcc tccgtgaaga tgagctgcag ggccagcggc 540

tacaccttca ccggagaggg cagaggaagt ctgctaacat gcggtgacgt cgaggagaat 600

<210> 3

<211> 3

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

<210> 4

<211> 851

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4