阅读说明：本技术 一种凝结芽孢杆菌高产抑菌多肽物质的发酵工艺及其应用 (Fermentation process for high-yield antibacterial polypeptide substance of bacillus coagulans and application of fermentation process ) 是由 方曙光 严涛 陈珂可 朱建国 冯胜鹏 程文 于 2020-06-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种凝结芽孢杆菌高产抑菌多肽物质的发酵工艺及其应用,涉及芽孢杆菌发酵技术领域,发酵工艺包括如下步骤：将凝结芽孢杆菌种子液接种至基础培养基中,40-45℃,150-250rpm条件下,培养20-30h；其间,在所述凝结芽孢杆菌菌株发酵生长的对数期中期添加氨基酸类物质；在凝结芽孢杆菌菌株发酵生长的稳定期添加醇类物质。本发明通过对基础培养基进行优化,优化碳、氮比,确保菌株在最适的培养基环境中生长,多代谢多肽类物质。抑菌多肽含量由原来的1710μg/mL提高至3940μg/mL,抑菌活性物质主要为蛋白类的细菌素,安全无毒,可以应用于食品防腐剂,保鲜剂或医药保健领域。(The invention discloses a fermentation process for high-yield antibacterial polypeptide substances of bacillus coagulans and application thereof, relating to the technical field of bacillus fermentation, wherein the fermentation process comprises the following steps: inoculating the bacillus coagulans seed liquid into a basic culture medium, and culturing for 20-30h at 40-45 ℃ under the conditions of 150-; meanwhile, amino acid substances are added in the middle logarithmic phase of the fermentation growth of the bacillus coagulans strain; adding alcohol substances in the stationary phase of the fermentation growth of the bacillus coagulans strain. The invention optimizes the basic culture medium, optimizes the carbon-nitrogen ratio, ensures that the bacterial strain grows in the most suitable culture medium environment, and metabolizes polypeptide substances. The content of the antibacterial polypeptide is increased from 1710 mu g/mL to 3940 mu g/mL, and the antibacterial active substance is mainly protein bacteriocin, is safe and nontoxic, and can be applied to the fields of food preservatives, preservatives or medical health care.)

一种凝结芽孢杆菌高产抑菌多肽物质的发酵工艺及其应用

技术领域

本发明涉及芽孢杆菌发酵技术领域，特别涉及一种凝结芽孢杆菌高产抑菌多肽物质的发酵工艺及其应用。

背景技术

乳酸菌的代谢产物有乳酸、有机酸、不饱和脂肪酸和细菌素等，可抑制某些病原微生物的生长，对宿主有益生作用。但乳酸菌抗逆性较差，对酸、胆盐敏感；抗生素对某些致病菌具有很好的抑菌效果，能减少于某些疾病的发生，但是由于抗生素的滥用，造成某些微生物产生耐药性，形成“超级细菌”，更难防治。

凝结芽孢杆菌又称为芽孢乳酸菌，为革兰氏阳性菌，兼性厌氧，能产生芽孢，抗逆性强，其芽孢在100℃高温下10min存活率能达到96.4％；在pH2.0的酸性条件下，6h存活率达到48.2％；在0.9％胆盐条件下24h存活率达78.3％。又能产生乳酸、细菌素等抑菌物质，2016年被国家收录于可用于食品菌株名单目录当中，其安全性有保障，不产生耐药性。但是凝结芽孢杆菌产生的抑菌物质受培养基成份、生长条件的影响，其含量较低，缺乏高抑菌的凝结芽孢杆菌相关成熟产品。提高凝结芽孢杆菌的抑菌活性物质的产量，制备成相应产品，促进其广泛应用有极大的必要性。授权公告号为：CN106191178B，名称为：一种凝结芽孢杆菌产抑菌活性物质的方法的发明专利公开了提高凝结芽孢杆菌多肽类抑菌物质的培养基成份，但没有具体提到菌体在发酵过程中的优化控制。

发明内容

本发明提供一种凝结芽孢杆菌高产抑菌多肽物质的发酵工艺及其应用，解决现有的凝结芽孢杆菌抑菌代谢产量普遍偏低的问题。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

一种凝结芽孢杆菌高产抑菌多肽物质的发酵工艺，包括如下步骤：

将凝结芽孢杆菌种子液接种至基础培养基中，40-45℃，150-250rpm条件下，培养20-30h；其间，在所述凝结芽孢杆菌菌株发酵生长的对数期中期添加氨基酸类物质；在凝结芽孢杆菌菌株发酵生长的稳定期添加醇类物质。

优选的，所述基础培养基包括糖蜜10-40g/L、酵母浸粉10-30g/L、玉米浆干粉5-30g/L、牛肉浸粉10-30g/L、氯化钠1-10g/L、乙酸钠2-10g/L、硫酸镁0.1-1g/L、硫酸锰2-15mg/L和吐温80 0.5-2g/L。

优选的，所述基础培养基包括糖蜜40.00g/L、酵母浸粉20g/L、玉米浆干粉10g/L、牛肉浸粉20g/L、氯化钠5g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰10mg/L和吐温80 2g/L。

优选的，所述基础培养基pH为7.0。

优选的，步骤(1)中接种量是以2-7mL种子液/100mL基础培养基进行接种。

优选的，所述凝结芽孢杆菌种子液是以将凝结芽孢杆菌单菌落接种到PCA液体培养基，40-45℃，150-200rpm，培养20-30h获得。

优选的，所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌BC99，所述凝结芽孢杆菌BC99命名为凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans，保藏编号为：CGMCC No.19487。

优选的，所述氨基酸类物质为丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸或脯氨酸中的一种或多种。

优选的，所述醇类物质为乙醇、乙二醇或正丁醇中的一种或多种。

一种所述的凝结芽孢杆菌高产抑菌多肽物质的发酵工艺的应用，其特征在于：将通过凝结芽孢杆菌高产抑菌多肽物质的发酵工艺制备得到的凝结芽孢杆菌的抑菌多肽物质应添加于食品、保健品、添加剂或防腐剂内。

采用上述技术方案，本发明通过对基础培养基进行优化，优化碳、氮比，确保菌株在最适的培养基环境中生长，多代谢多肽类物质；抑菌的多肽类物质主要成份单体是氨基酸，通过添加特定氨基酸作为多肽合成的前体物质，在菌体生长的特定时候添加，促进多肽抑菌物质的产量最大化提升；菌体产生的多肽类物质，在生长的对数期末期或者稳定期，由于营养物质消耗殆尽，菌体会产生分解多肽物质的酶，将其分解成氨基酸，供菌体生长，因此通过添加特定物质，阻止酶类分解代谢出来的抑菌多肽，确保抑菌多肽类物质产量不下降。

本发明通过对培养基的优化筛选及发酵工艺的优化，使得凝结芽孢杆菌产生抑菌多肽含量提升2倍，进行以金黄色葡萄糖作为指示菌，测定抑菌效价，其抑制效果与抗生素作效果相当，其抑菌物质主要为蛋白类的细胞素类物质，经过抑菌效价的测定，发现含有3940μg/mL抑菌多肽发酵液的抑菌效价效果与同等抑菌效价的0.6mg/mL的氨苄青霉素以及0.06mg/mL的硫酸卡那霉素作用效果相当，安全无毒副作用，不产生耐药性，在食品防腐及食品、保健品领域有良好的作用效果。

附图说明

图1为不同碳源对凝结芽孢杆菌BC99的抑菌效价及抑菌多肽含量的影响图；

图2为糖蜜添加量对凝结芽孢杆菌BC99的抑菌效价及抑菌多肽含量的影响图；

图3为不同氮源对凝结芽孢杆菌BC99的抑菌效价及抑菌多肽含量的影响图；

图4为吐温与乙二醇对凝结芽孢杆菌BC99抑菌效价及抑菌多肽含量的影响图；

图5为温度对凝结芽孢杆菌BC99抑菌效价及抑菌多肽含量的影响图；

图6为在不同生长时期添加氨基酸对凝结芽孢杆菌BC99抑菌效价及抑菌多肽含量的影响图；

图7为在不同生长时期添加醇类物质对凝结芽孢杆菌BC99抑菌效价及抑菌多肽含量的影响图；

图8为不同pH值对代谢产物抑菌能力的影响图；

图9为不同温度对代谢产物抑菌能力的影响图；

图10上清液和菌体对代谢产物抑菌能力的影响图；

图11不同酶对抑菌物质抑菌能力的影响图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

应当说明的是，下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1

基础培养基的优化确定

1、碳源种类影响

配制对照组基础培养基：将蛋白胨20.00g、葡萄糖20.00g、氯化钠5g、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.58g和硫酸锰10mg溶于1L蒸馏水，调节pH值至7.0，待用；

配制PCA培养基：胰蛋白胨5.0g，酵母浸粉2.5g，葡萄糖1.0g溶于1L蒸馏水中，调节pH至7.0，待用；

配制实验组基础培养基：分别以乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、糖蜜替代对照组基础培养基中的葡萄糖，添加量均为20gL，其余参数不变，配制待用；

挑取凝结芽孢杆菌BC99单菌落接种至PCA培养基中，42℃，180rpm培养24h获得凝结芽孢杆菌BC99种子液，再将凝结芽孢杆菌BC99种子液分别接种至对照组基础培养基、实验组基础培养基中，42℃，180rpm条件下，培养24h，得到发酵液。其中，凝结芽孢杆菌BC99保藏单位代码：CGMCC-中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；所述凝结芽孢杆菌BC99检测结果为：存活；保藏日期为：2020年03月18日；保藏编号为：CGMCC No.19487；分类命名：凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans。

对发酵液采用牛津杯法，以金黄色葡萄球菌作为指示菌，其产生抑菌效价进行测定：

抑菌圈测量：外圈抑菌圈直径与内圈牛津杯直径(8cm)差值为最终抑菌圈直径，单位mm。

多肽含量的测定：采用双缩脲法，取离心好的发酵液上清液1mL，准确添加4mL的双缩脲试剂，混合摇匀后，于室温下反应30min，测定其在540nm处的吸光值。根据标准曲线计算发酵液中多肽含量。

抗菌活性的分析：以效价来表示，单位AU/mL，具体如下：将发酵液上清液用无菌生理盐水进行二倍梯度稀释，各个稀释梯度取样100uL加入到牛津杯中检测抗菌活性，出现抑菌圈的最高稀释倍数定义为一个活性单位，其倒数乘以稀释倍数即为原液的抗菌活性效价(AU/mL)。

其中，对照组基础培养基的抑菌效价平均值为2300AU/mL，抑菌多肽含量为1710μg/mL；乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖和糖蜜代替葡萄糖的实验组基础培养基的抑菌效价和抑菌多肽含量结果如图1所示，可以看到糖蜜的实验组基础培养基的抑菌效价和抑菌多肽含量最佳。

继续优化的糖蜜的添加量：对糖蜜的添加量以10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L进行试验，考察其最佳的抑菌添加量效果，结果如图2所示，可见，糖蜜的添加量在10-40g/L都有不错的效果，但在40.00g/L处达到最佳状态。

2、氮源种类影响

分别以氯化铵、硫酸铵、酵母浸粉、黄豆饼粉、玉米浆干粉、大豆蛋白胨、牛肉浸粉替代蛋白胨，添加量均为2g/100mL，采用牛津杯法，以金黄色葡萄球菌作为指示菌，测定抑菌效价和抑菌多肽含量，结果如图3所示，其中，酵母浸粉、玉米浆干粉、牛肉浸粉对抑菌效果差异不显著。

3、吐温和乙二醇的影响

分别以2g/L的添加量加入吐温20、吐温60、吐温80、乙二醇，用牛津杯法，以金黄色葡萄球菌作为指示菌，测定抑菌效价和抑菌多肽含量，结果如图4所示，可见吐温和乙二醇对抑菌效果差异不显著。

4、温度影响

分别在30℃、37℃、42℃、45℃、50℃下进行培养，其它条件相同，考察不同的温度对凝结芽孢杆菌BC99抑菌能力的影响。发酵结束，采用牛津杯法，以金黄色葡萄球菌作为指示菌，测定上清液抑菌效价和抑菌多肽含量，结果如图5所示，可见在42℃效果最佳。

5、氮源正交实验

采用以上最佳的培养基成份：糖蜜40.00g/L、吐温80 2g/L、氯化钠5g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰10mg/L为培养基成份，对氮源：酵母浸粉、玉米浆干粉、牛肉浸粉进行正交试验，在42℃下进行发酵，如表1所示：

表1培养基成份优化的正交因素与水平

水平	A酵母浸粉(g/L)	B玉米浆干粉(g/L)	C牛肉浸粉(g/L)
				1	10	5	15
2	20	10	20
				3	30	20	25

以金色葡萄球菌作为指示菌，测定抑菌效价和抑菌多肽含量，结果如表2所示：

表2培养基成份的正交试验结果

正交试验结果表明，氮源(酵母浸粉、玉米浆干粉、牛肉浸粉)对凝结芽孢杆菌的影响主次为C>A>B，最优组合为C₂A₂B₂。通过单因素试验及正交试验得出的最佳培养基成份为：糖蜜40.00g/L、酵母浸粉20g/L、玉米浆干粉10g/L、牛肉浸粉20g/L、吐温80 2g/L、氯化钠5g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰10mg/L。

实施例2

发酵工艺的优化确定

以实施例1中得出的最佳配比为基础培养基，在发酵的生长对数期前期、中期、末期分别添加氨基酸类(丝氨酸、苏氨酸)物质，其中，氨基酸类物质单独灭菌，添加量为5-20g/L；发酵结束，采用牛津杯法，以金黄色葡萄球菌作为指示菌，测定上清液抑菌效价和抑菌多肽含量，结果如图6所示，可见，在对数中期添加氨基酸类物质，发酵后测得的抑菌效价最大。

以实施例1中得出的最佳配比为基础培养基，在发酵生长的对数期中期、对数期末期、稳定期初期分别添加醇类(乙醇、乙二醇、正丁醇中的一种或多种)物质，其浓度为20-50％；发酵结束，采用牛津杯法，以金黄色葡萄球菌作为指示菌，测定上清液抑菌效价和抑菌多肽含量，结果如图7所示，可见，在稳定期初期添加醇类物质，发酵后测得的抑菌效价最大。

以实施例1中得出的最佳配比为基础培养基，本实施例得出的最佳发酵工艺进行发酵，发酵结束后，采用牛津杯法，以金黄色葡萄球菌作为指示菌，测定上清液抑菌效价；采用双缩脲法测定多肽含量，凝结芽孢杆菌产生的抑菌效价最大为5690AU/mL；抑菌多肽含量为3940μg/mL。

实施例3

抑菌活性物质特性

以实施例1中得出的最佳配比为基础培养基，以实施例2中得出的最佳工艺制备得到的凝结芽孢杆菌发酵上清液，用0.5mol/L HCl和0.5mol/L NaOH调节凝结芽孢杆菌的上清液的pH值，pH值梯度为：2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，在37℃下处理1h后再回调pH值至6.0，做牛津杯抑菌实验，以金黄色葡萄球菌作为指示菌进行试验，测定抑菌效价(AU/mL)的大小，考察不同酸性条件下对其抑菌能力的影响，结果如图8所示。

以实施例1中得出的最佳配比为基础培养基，以实施例2中得出的最佳工艺制备得到的凝结芽孢杆菌发酵上清液，分别在不同温度梯度(4℃、25℃、37℃、45℃、80℃、121℃)条件下处理30min后测定抑菌能力，以金黄色葡萄球菌为指示菌进行试验，测定抑菌效价的大小，考察不同温度条件下对凝结芽孢杆菌抑菌能力的影响，结果如图9所示。

以实施例1中得出的最佳配比为基础培养基，以实施例2中得出的最佳工艺制备得到的凝结芽孢杆菌发酵液上清液与其发酵菌液进行抑菌能力的比较，以金黄色葡萄球菌为指示菌进行试验，测定抑菌效价的大小，考察凝结芽孢杆菌的菌体对抑菌能力的影响，结果如图10所示。

以实施例1中得出的最佳配比为基础培养基，以实施例2中得出的最佳工艺制备得到的凝结芽孢杆菌发酵液上清液用0.5mol/L盐酸和0.5mol/L氢氧化钠调节上清液pH值至胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和过氧化氢酶的最适pH值，将凝结芽孢杆菌的发酵上清液与各种酶分别在37℃水浴条件下反应30min后，再调节pH至6.0，研究不同蛋白酶处理凝结芽孢杆菌抑菌代谢物质，以未经酶处理的凝结芽孢杆菌上清液为对照组。通过测定对照组和试验组抑菌效价大小，考察凝结芽孢杆菌抑菌物质，结果如图11所示，结果显示凝结芽孢杆菌BC99代谢物质是为蛋白类细菌素物质。

采用氨苄青霉素和硫酸卡那霉素进行对照实验，选取浓度为50mg/mL的两种抗生素作为母液，分别稀释为原来的10，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6倍，以金黄色葡萄球菌作为指示菌进行抑菌实验，以实施例1中得出的最佳配比为基础培养基，以实施例2中得出的最佳工艺制备得到的凝结芽孢杆菌发酵液上清液的抑菌圈大小进行比较，经过抑菌效价的测定，发现含有3940μg/mL抑菌多肽发酵液的抑菌圈效果与同等抑菌圈大小的0.6mg/mL的氨苄青霉素以及0.06mg/mL的硫酸卡那霉素作用效果相当。

选取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、志贺氏菌、产气荚膜梭菌、酿酒酵母为指示菌，使其菌浓度都控制在10⁹CFU/mL，采用实施例1中得出的最佳配比为基础培养基，以实施例2中得出的最佳工艺制备得到的凝结芽孢杆菌发酵液上清液进行抑菌谱试验，发现该株凝结芽孢杆菌抑菌产物对革兰氏阳性菌有较好的抑菌效果，对真菌酵母无明显抑菌效果。

表3凝结芽孢杆菌BC99对不同指示菌的抑菌效果

注：抑菌效价5000-6000AU/mL相当于抑菌圈25-30mm；抑菌效价4000-5000AU/mL相当于抑菌圈20-25mm；抑菌效价3000-4000AU/mL相当于抑菌圈15-20mm；抑菌效价2000-3000AU/mL相当于抑菌圈10-15mm

以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。