具体实施方式

除非另行定义，在本说明书中使用的所有技术术语及科学术语的含义与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。通常，在本说明书中使用的命名法在本技术领域周知且通常用于本技术领域。

本发明的双靶向抗体更有效地抑制作为炎症性细胞因子的肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-17A，由此具有抑制自身免疫疾病的功效，具有对于肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-17A各个靶的结合能力。尤其，示出完全不会与非靶抗原蛋白结合且仅与人肿瘤坏死因子-α和人白细胞介素-17A或白细胞介素-17A/F特异性结合地优异的特异性，与仅单独靶向肿瘤坏死因子-α的抗体(修美乐)、仅单独靶向白细胞介素-17A的抗体(苏金单抗)及现有的肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-17A双抗体(LY3114062)相比示出优秀的功效。

因此，在本发明的一方面中，涉及与白细胞介素-17A及肿瘤坏死因子-α特异性结合的双靶向抗体，包含与白细胞介素-17A特异性结合的抗体或其抗原结合片段及与肿瘤坏死因子-α特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，与上述白细胞介素-17A特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含：(i)，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：8的重链互补决定区1，选自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：11组成的组中的重链互补决定区2，以及选自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：10组成的组中的重链互补决定区3；以及(ii)，SEQ ID NO：12的轻链互补决定区1、SEQ IDNO：13的轻链互补决定区2及SEQ ID NO：14的轻链互补决定区3。

本发明中的术语“双靶向抗体”是指对于一个以上的靶具有结合能力或拮抗能力的抗体，是指对于两个互不相同的靶具有结合能力或拮抗能力的多个抗体结合的形态或者对于一个靶具有结合能力的抗体与对于另一个靶具有拮抗能力的物质结合的抗体。

作为本发明的双靶向抗体的一个靶的“白细胞介素-17A”蛋白可源自所有种，例如，可源自人、猴等的灵长类或者源自小鼠、大鼠等的啮齿类。白细胞介素-17与和类风湿性关节炎(RA，Rheumatoid arthritis)、银屑病(PsA，Psoriasis)、红斑狼疮、克罗恩病、多发性硬化症、系统性硬化症、白塞病等的自身免疫疾病相关的免疫系统的非正常表达相关。

本发明中的术语“抗体”包含多克隆抗体及单克隆抗体，不仅包含具有两个全长轻链及两个全长重链的完整形态，还包含抗体分子的片段。

完整形态的抗体为具有两个全长轻链及两个全长重链的结构，各个轻链通过二硫键与重链连接。重链的恒定区具有γ、μ、α、δ及ε型，且具有γ1、γ2、γ3、γ4、α1及α2的亚类。轻链的恒定区具有κ及λ型。基本4链抗体单位为由两个相同的轻链(L)及两个相同的重链(H)组成的异四聚糖蛋白。轻链在N-末端具有可变区(VL)，接着在其另一端部具有恒定区。重链在N-末端具有可变区(VH)，接着分别对α链及γ链具有三个恒定区(CH)及对于μ及ε异构体具有4个恒定区。术语“可变”表示可变区的特定部分的序列在抗体之间大大不同。可变区介导抗原结合，规定对于特定抗原的特定抗体的特异性。可变性在轻链可变区及重链可变区均聚集在高变区(HVR，hypervariable reg ion)，即，聚集在称为互补决定区(CDR，complementarity determini ng region)的三个片段。将可变区的更高度保存的部分称为骨架区(FR，framework region)。重链可变区及轻链可变区从N-末端抽象C-末端具有骨架区1、互补决定区1、骨架区2、互补决定区2、骨架区3、互补决定区3及骨架区4结构。

在本说明书中使用的“重链”是指包含具有足以对于抗原赋予特异性的可变区序列的氨基酸序列的可变区结构域重链可变区及三个恒定区结构域重连恒定区1、重连恒定区2及重连恒定区3的全长重链及其片段。

并且，在本说明书中使用的术语“轻链”是指包含具有足以对于抗原赋予特异性的可变区序列的氨基酸序列的可变区结构域轻链可变区及包含恒定区结构域轻链恒定区(CL)的全长轻链及其片段。

抗体的抗原结合片段或抗体片段是指具有抗原结合功能的片段，包含Fab、F(ab')₂及Fv等。

“Fv”片段是指包含完整的抗体识别及结合位点的抗体片段。这种区域由一个重链可变结构域和一个链可变结构域组成，例如，由利用scFv坚固地事实上共价结合的二聚体组成。

“Fab”片段包含轻链的可变结构域及恒定结构域以及重链的可变结构域及第一恒定结构域(CH1)。F(ab')₂抗体片段通常包含通过铰链半胱氨酸在它们的羧基端附近共价连接的一对Fab片段。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的重链可变区及轻链可变区结构域，这些结构域存在于单一多肽链内。Fv多肽还可在重链可变区结构域与轻链可变区结构域之间包含多肽连接子，使得scFv为了抗原结合而形成所目的的结构。

在一实施例中，本发明的抗体为Fv形态(例如，scFv)或完整的抗体形态。并且，重链恒定区可选自γ、μ、α、δ或ε中的一亚型。例如，恒定区为γ1(免疫球蛋白G1(IgG1))、γ3(免疫球蛋白G3(IgG3))或γ4(免疫球蛋白G4(IgG4))。轻链恒定区可以为κ型或λ型。

本发明的抗体包含单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链Fvs(scFV)、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、双硫键Fvs(sdFV)及抗独特型(anti-Id)抗体或上述抗体的表位结合片段等，但并不限定于此。

上述单克隆抗体是指从实质上同质的抗体组中获取的抗体，即，除占据组的各个抗体能够以微量存在的可能的天然产生的突变之外相同的抗体。单克隆抗体高度特异性，对抗单一抗原部位而诱导。

上述“人源化”形态的非-人(例：小鼠)抗体为包含源自非-人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在大部分的情况下，人源化抗体为将受体的高变区的残基取代为具有所目的的特异性、亲和性及能力的如小鼠、大鼠、兔或非-人灵长类等的非-人物种(供体抗体)的高变区的残基的人免疫球蛋白(受体抗体)。

上述“人抗体”是指利用源自人免疫球蛋白的分子构成包含互补决定区、结构区的抗体的所有氨基酸序列由人的免疫球蛋白构成。人抗体包含噬菌体展示文库，可通过本领域公知的各种技术来制备。将人抗体修饰为与抗原试验接种反应来生产抗体，可向如免疫处理的转基因鼠(xenomouse)的其内源性基因座不起作用的转基因动物给药抗原来制备。与现有的依克珠单抗(ixekizumab)为人源化抗体相比，本发明的抗体为人抗体。

重链和/或轻链的一部分与源自特殊物种或术语特殊抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或与其同源，相反，剩余(多个)链包含源自其他物种或属于其他抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或与其同源的“嵌合”抗体(免疫球蛋白，还包含表示所目的的生物学活性的上述抗体的片段。

如在本说明书中使用的“抗体可变结构域”是指包含互补决定区及骨架区的氨基酸序列的抗体分子的轻链及重链部分。重链可变区是指重链的可变结构域。轻链可变区是指轻链的可变结构域。

“互补决定区”是指作为为了抗原结合而所需的存在的抗体可变结构域的氨基酸残基。各个可变结构域通常具有确认为互补决定区1、互补决定区2及互补决定区3的三个互补决定区。

在根据一实施例的本发明的双靶向抗体或其抗原结合片段中，与上述白细胞介素-17A特异性结合的抗体或其抗原结合片段可包含：SEQ ID NO：1的重链互补决定区1、SEQID NO：2的重链互补决定区2、SEQ ID NO：3的重链互补决定区3；SEQ ID NO：1的重链互补决定区1、SEQ ID NO：4的重链互补决定区2、SEQ ID NO：5的重链互补决定区3；SEQ ID NO：1的重链互补决定区1、SEQ ID NO：4的重链互补决定区2、SEQ ID NO：6的重链互补决定区3；SEQID NO：1的重链互补决定区1、SEQ ID NO：4的重链互补决定区2、SEQ ID NO：7的重链互补决定区3；SEQ ID NO：8的重链互补决定区1、SEQ ID NO：9的重链互补决定区2、SEQ ID NO：10的重链互补决定区3；或者SEQ ID NO：8的重链互补决定区1、SEQ ID NO：11的重链互补决定区2、SEQ ID NO：10的重链互补决定区3。

“骨架区”为除互补决定区残基之外的可变结构域残基。各个可变结构域通常具有确定为骨架区1、骨架区2、骨架区3及骨架区4的四个骨架区。

在根据一实施例的本发明的双靶向抗体或其抗原结合片段中，与上述白细胞介素-17A特异性结合的抗体或其抗原结合片段可包含选自由SEQ ID NO:15至SEQ ID NO：26组成的组中的重链可变区骨架区。具体地，可包含：选自由SEQ ID NO:15的骨架区1、SEQ IDNO:16的骨架区2、SEQ ID NO:17的骨架区3及SEQ ID NO：18的骨架区4组成的组中的重链可变区骨架区；选自由SEQ ID NO：19的骨架区1、SEQ ID NO:16的骨架区2、SEQ ID NO:20的骨架区3及SEQ ID NO:21的骨架区4组成的组中的重链可变区骨架区；选自由SEQ ID NO:22的骨架区1、SEQ ID NO:23的骨架区2、SEQ ID NO:24的骨架区3及SEQ ID NO:25的骨架区4组成的组中的重链可变区骨架区；以及选自由SEQ ID NO:22的骨架区1、SEQ ID NO:26的骨架区2、SEQ ID NO:24的骨架区3及SEQ ID NO:25的骨架区4组成的组中的重链可变区骨架区。

在根据另一实施例的本发明的双靶向抗体或其抗原结合片段中，与上述白细胞介素-17A特异性结合的抗体或其抗原结合片段可包含选自由SEQ ID NO：27至SEQ ID NO:33组成的组中的轻链可变区骨架区。具体地，可包含：SEQ ID NO:27的骨架区1、SEQ ID NO:28的骨架区2、SEQ ID NO:29的骨架区3及SEQ ID NO：30的骨架区4；或者SEQ ID NO:31的骨架区1、SEQ ID NO:32的骨架区2、SEQ ID NO:33的骨架区3及SEQ ID NO:30的骨架区4的轻链可变区骨架区。

在包含上述互补决定区1至互补决定区3及骨架区的本发明的双靶向抗体或其抗原结合片段中，与上述白细胞介素-17A特异性结合的抗体或其抗原结合片段可包含如选自由SEQ ID NO:34至SEQ ID NO:39组成的组中的重链可变区。并且，本发明的抗体或其抗原结合片段可包含如SEQ ID NO：40或SEQ ID NO:41的轻链可变区。

在根据一实施例的本发明的双靶向抗体或其抗原结合片段中，与上述白细胞介素-17A特异性结合的抗体或其抗原结合片段可包含如下的重链可变区和轻链可变区：(i)，SEQ ID NO:34的重链可变区及SEQ ID NO：40的轻链可变区；(ii)，SEQ ID NO:35的重链可变区及SEQ ID NO:41的轻链可变区；(iii)，SEQ ID NO:36的重链可变区及SEQ ID NO：41的轻链可变区；(iv)，SEQ ID NO:37的重链可变区孔SEQ ID NO：41的轻链可变区；(v)，SEQ IDNO:38的重链可变区及SEQ ID NO：40的轻链可变区；或者(vi)，SEQ ID NO:39的重链可变区及SEQ ID NO：41的轻链可变区。

作为本发明的双靶向抗体的一个靶的“肿瘤坏死因子-α”为在活化的巨噬细胞和CD4+T细胞、NK细胞等的免疫细胞中生产的炎症性细胞因子，起到通过调节免疫细胞来调节炎症反应的作用。上述肿瘤坏死因子-α蛋白可源自所有物种，例如，可源自如人、猴等的灵长类动物，或者可源自如小鼠、大鼠等的啮齿类动物。肿瘤坏死因子-α的免疫激活介导类风湿性关节炎(RA，Rheumatoid arthritis)、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)、炎症性肠病(inflammatory bowel disease,psoriasis)等的自身免疫疾病。

在本发明的双靶向抗体中，与肿瘤坏死因子-α特异性结合的抗体或其抗原结合片段可无限制地使用具有与肿瘤坏死因子-α结合来抑制肿瘤坏死因子-α活性的特性的抗体，优选为选自由阿达木单抗(产品名：修美乐)、戈利木单抗(产品名：欣普尼)、赛妥珠单抗(产品名：希敏佳)及英夫利西单抗(产品名：瑞米凯德)组成的组中的一种或其变异体，但并不限定于此。

在本发明的双靶向抗体中，优选地，与肿瘤坏死因子-α特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含：(i)，SEQ ID NO:54的重链互补决定区1、SEQ ID NO：55的重链互补决定区2及SEQ ID NO:56的重链互补决定区3，以及SEQ ID NO:57的轻链互补决定区1、SEQ ID NO:58的轻链互补决定区2及SEQ ID NO:59的轻链互补决定区3；(ii)，SEQ ID NO:60的重链互补决定区1、SEQ ID NO:61的重链互补决定区2及SEQ ID NO：62的重链互补决定区3，以及SEQ ID NO:63的轻链互补决定区1、SEQ ID NO:64的轻链互补决定区2及SEQ ID NO：65的轻链互补决定区3；(iii)，SEQ ID NO：66的重链互补决定区1、SEQ ID NO:67的重链互补决定区2及SEQ ID NO:68的重链互补决定区3，以及SEQ ID NO:69的轻链互补决定区1、SEQ IDNO：70的轻链互补决定区2及SEQ ID NO：71的轻链互补决定区3；或者(iv)，SEQ ID NO：72的重链互补决定区1、SEQ ID NO：73的重链互补决定区2及SEQ ID NO：74的重链互补决定区3，以及SEQ ID NO：75的轻链互补决定区1、SEQ ID NO：76的轻链互补决定区2及SEQ ID NO：77的轻链互补决定区3。更优选地，包含：(i)，SEQ ID NO：78的重链可变区及SEQ ID NO：79的轻链可变区；(ii)，SEQ ID NO：80的重链可变区及SEQ ID NO：81的轻链可变区；(iii)，SEQID NO：82的重链可变区及SEQ ID NO：83的轻链可变区；或者(iv)，SEQ ID NO：84的重链可变区及SEQID NO：85的轻链可变区，但并不限定于此。

与肿瘤坏死因子-α特异性结合的抗体地序列如下述表1(重链互补决定区及重链可变区)及表2(轻链互补决定区及轻链可变区)所记载。

表1

表2

在本发明的一实施例中，在抗肿瘤坏死因子-α抗体重链的核酸序列(SEQ ID NO：86)的3'-末端引入连接子，接着连接利用通过优化获取的抗白细胞介素-17A重链可变区及轻链可变区的scFv核酸序列(SEQ ID NO：87)，之后利用其来表达了在HEK293F细胞中同时抑制肿瘤坏死因子-α及白细胞介素-17A的活性的双靶向抗体。

上述双抗体为可与互不相同的两种抗原(靶蛋白)结合的抗体，可以为通过遗传工学或任意方法制备的形态。本发明的双抗体可以为多个抗体通过连接子连接的形态。

上述连接子是指可利用氢键、静电相互作用、范德华力、二硫键、盐桥、疏水相互作用、共价键等来连接两个互不相同的融合配偶体(例如，生物学高分子等)的连接体，具体地，可在生理学条件或其他标准肽条件(例如，肽纯化条件、肽储存条件)下具有能够参与至少一个二硫键的至少一个半胱氨酸，除了简单的连接各个融合配偶体的作用之外，还可执行在融合配偶体之间赋予规定大小的间隔的作用或者执行向融合体提供柔韧性或强直性的铰链(hinge)的作用。上述连接子可以为非肽连接子或肽连接子，还可包含所有通过肽键、二硫键等直接连接的连接子。

上述肽连接子可包含多个氨基酸序列或基序重复的形态的氨基酸序列。

上述非肽连接子可以为如聚乙二醇(PEG，polyethylene glycol)均聚物、聚丙二醇均聚物、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多聚糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚的生物降解高分子、脂质聚合物、甲壳素、透明质酸或它们的组合。具体地，可以为聚乙二醇均聚物，在本领域周知的它们的衍生物及能够以本领域的技术水平容易制备的衍生物也包含在本发明的范围内。

通过上述连接子直接连接或间接连接的部位并无特殊限制，但可以为Fc部分、Fab'、F(ab')₂、Fab、Fv等。

在本发明中，上述双靶向抗体包含：与白细胞介素-17A特异性结合的抗体的重链及轻链；以及与肿瘤坏死因子-α特异性结合的抗体的重链及轻链，优选地，与上述白细胞介素-17A特异性结合的抗体及与肿瘤坏死因子-α特异性结合的抗体的重链恒定区C-末端相互连接，优选地，与上述肿瘤坏死因子-α特异性结合的抗体的重链恒定区C-末端和与白细胞介素-17A特异性结合的抗体的抗原结合片段连接，但并不限定于此。

在本发明的双靶向抗体中，上述抗体-抗体之间的连接或上述抗体-片段之间的连接可通过连接子结合、化学直接结合或基因融合(ge netic fusion)等的各种方法连接，优选地，通过连接子(linker)(SEQ ID NO：88)结合，但并不限定于此。

同时，本发明的特征在于，上述抗体的片段为单链可变片段(scFv，Single-chainvariable fragment)。

在本发明的具体实施例中，本发明人通过克隆白细胞介素-17A基因来制备了白细胞介素-17A抗原蛋白，使其与文库噬菌体进行反应来获取了与白细胞介素-17A特异性结合的scFv-噬菌体，重复三次将其感染在大肠杆菌来扩增的淘选过程来执行。

并且，本发明人从结合能力大的第三轮淘选的多克隆噬菌体抗体组中筛选了单克隆抗体，对其进行酶联免疫吸附测定分析来再一次筛选了单克隆抗体。对通过如上所述的方式筛选的单克隆噬菌体进行序列分析来确认了6种单克隆抗体的重链可变区及轻链可变区的互补决定区的模式及多肽序列(表4及表5)。

在作为抗-肿瘤坏死因子-α单抗体的修美乐重链核酸序列的3’-末端克隆筛选的上述6种单克隆噬菌体中的7H3C11FW的scFv来制备了与白细胞介素-17A及肿瘤坏死因子-α双特异性抗体的SDA-0070。在通过如上所述方式制备的双靶向抗体中，通过酶联免疫吸附测定分析来确认了仅与肿瘤坏死因子-α和人白细胞介素-17A或白细胞介素-17A/F结合的结合特异性，确认了与白细胞介素-17A或肿瘤坏死因子-α单靶向抗体及现有的肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-17A双抗体(LY3114062)相比具有显著优秀的特异性结合能力及中和能力。

因此，确认了与本发明的白细胞介素-17A及肿瘤坏死因子-α特异性结合的双靶向抗体同时对白细胞介素-17A及肿瘤坏死因子-α具有强的抗原结合能力。

只要保持本发明的抗体或抗体片段的特性，可变区内的发生突变的抗体或抗体片段也包含在本发明的发明要求保护范围内。作为这种例，可例举在可变区发生氨基酸的保守置换(conservative substitution)的抗体。保守置换是指被具有与原来的氨基酸序列相似的特性的其他氨基酸残基所置换。例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸因具有碱基侧链而具有相似的特性，天冬氨酸和谷氨酸因具有酸侧链而具有相似的特性。并且，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸因具有非电荷极性侧链而具有相似的特性，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸因具有非极性侧链而具有相似的特性，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸因具有芳香族侧链而具有相似的特性。因此，即使在如上所述的具有相似的特性的组内发生氨基酸取代，也不会示出不同的特性变化，这对普通技术人员来说是显而易见的，因此，只要保持本发明的抗体的特性，通过可变区内的保守置换而发生变异的抗体也包含在本发明的发明要求保护范围内。

若考虑如上所述的具有生物学等同活性的变异，则本发明的抗体或抗体片段的多肽序列包含示出与在序列号中记载的序列实质性相同性(substantial identity)的序列。如上所述度实质性相同性的含义如下：比对如上所述的本发明的序列与任意其他序列来使其最大限度地对应，当使用在本领域通常所利用的算法分析比对的序列时，至少具有61％的同源性，更优选地，具有70％的同源性，更加优选地，具有80％的同源性，最优选地，具有90％的同源性，优选为95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上相同的序列。用于序列比较的比对方法已在本领域公知。美国国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(BLAST，Basic Local Alignment Search Tool)可在美国国家生物技术信息中心等访问，在互联网上，可与如blastp、blasm、blastx、tblastn及tblastx的序列分析程序联动来利用。基本局部比对搜索工具可在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/访问。可在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html确认利用该程序的序列同源性比较方法。

在再一方面，本发明涉及编码上述双靶向抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。

可分离编码本发明的双靶向抗体或其抗原结合片段的多核苷酸来重组生产抗体或其抗原结合片段。分离多核苷酸并将其插入至可复制的载体内来追加克隆(脱氧核糖核酸(DNA)的扩增)或追加表达。基于此，在另一方面，本发明涉及包含上述多核苷酸的载体。

“多核苷酸”具有包含多种核酸，如包括脱氧核糖核酸(基因组脱氧核糖核酸(gDNA)及互补脱氧核糖核酸(cDNA))及核糖核酸(RNA)分子的含义，核酸中的基本组成单位的核苷酸不仅包括天然核苷酸，还包含修饰糖或碱基部位的类似物(analogue)。可修饰本发明的编码重链可变区及轻链可变区的多核苷酸的序列。上述修饰包括核苷酸的追加、缺失或非保守置换或保守置换。

在一实施例中，本发明的编码双靶向抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，例如编码与白细胞介素-17A特异性结合的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的多核苷酸可选自由SEQ ID NO：42至SEQ ID NO：47组成的组中，编码轻链可变区的多核苷酸可以为SEQ IDNO：48或SEQ ID NO：49，编码与肿瘤坏死因子-α特异性结合的抗体或其抗原结合片段的重链去的多核苷酸可以为SEQ ID NO：86，编码轻链区的多核苷酸可以为SEQ ID NO：89。

应解释的是，本发明的核酸还包含对于上述核苷酸序列示出实质性相同性的核苷酸序列。实质性相同性的含义如下：比对本发明的核苷酸序列与任意其他的序列来使其最大限度地对应，当使用在本领域通常利用的算法分析比对的序列时，至少具有80％的同源性，更优选地，至少具有90％的同源性，最优选地，至少具有95％的同源性，优选为示出95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上的同源性的核苷酸序列。

编码上述抗体的脱氧核糖核酸可通过使用常规过程(例如，使用编码抗体的重链可变区和轻链可变区的脱氧核糖核酸和可以特异性结合的寡核苷酸探针)来容易分离或合成。为了追加克隆或表达上述脱氧核糖核酸，可利用各种载体。载体成分通常包含如下中的一种以上，但并不局限于此：信号序列、复制起点、一种以上的标记基因、增强因子元件、启动子及转录终止序列。

在本本说明书中使用的术语“载体”为用于在宿主细胞表达目的基因地手段，包括质粒载体、粘粒载体、细菌噬菌体载体以及如腺病毒载体、逆转录病毒载体及腺相关病毒载体的载体等。在上述载体编码抗体的核酸与启动子可操作地连接。

“可操作地连接”是指核酸表达调节序列(例：启动子、信号序列或转录调节因子结合位点的阵列)与其他核酸序列之间的功能结合，由此，上述调节序列调节上述其他核酸序列的转录和/或翻译。

当使用原核细胞作为宿主时，通常包含可进行转录的强启动子(例如，tac启动子、lac启动子、lacUV5启动子、lpp启动子、pLλ启动子、pRλ启动子、rac5启动子、amp启动子、recA启动子、SP6启动子、trp启动子及T7启动子等)、用于启动翻译的核糖体结合位点及转录/翻译终止序列。并且，例如，当使用真核细胞作为宿主时，可利用源自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例：金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人血红蛋白启动子及人肌肌酸启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例：腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、单纯疱疹病毒(HSV)的tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人类免疫缺陷病毒(HIV)的长末端重复序列(LTR)启动子、莫洛尼病毒的启动子、EB病毒(EBV)的启动子及劳斯氏肉瘤病毒(RSV)的启动子，通常具有多腺苷酸化序列作为转录终止序列。

根据情况，载体还可与其他序列融合，来容易纯化从该载体表达的抗体。所融合的序列有如谷胱甘肽s-转移酶(Pharmacia，USA)、麦芽糖结合蛋白(NEB，USA)、FLAG(IBI，USA)及六聚组氨酸(6xHis，hexahistidine；Quiagen，USA)等。

上述载体包含在本领域通常利用的抗生素抗性基因作为选择标记，例如，有对于氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素及四环素的抗性基因。

在还有一方面，本发明涉及转化为所提及的上述载体的细胞。为了生成本发明的双靶向抗体而使用的细胞可以为原核生物、酵母或高等真核生物细胞，但并不局限于此。

可利用如大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌及苏云金芽孢杆菌的芽孢杆菌属菌株、如链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida))、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)及葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如，肉葡萄球菌(Staphylocus carnosus))的原核宿主细胞。

并且，动物细胞作为宿主细胞备受关注，有用的宿主细胞株可例举COS-7、BHK、CHO、CHO-S、CHOK1、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL 3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC 5、FS4、3T3、RIN、A549、PC12、K562、PER.C6、SP2/0、NS-0、U20S或HT1080，但并不局限于此。

在又一方面，本发明涉及上述双靶向抗体或其抗原结合片段的制备方法，包括：步骤(a)，培养转化的上述细胞；以及步骤(b)，从所获取的细胞培养液中回收上述双靶向抗体或其抗原结合片段。

可在各种培养基培养上述细胞，培养基可无限制地使用市售的培养基。还可包含适当浓度的对于普通技术人员公知的其他所有必须补充物。如温度、pH值等的培养条件可为了表达而与所筛选的宿主细胞一同使用，这对于普通技术人员而言是显而易见的。

当回收上述抗体或其抗原结合片段时，例如，可对细胞培养液进行离心分离或超滤来去除杂质，可利用如亲和色谱法等来纯化其产物。可利用额外的其他纯化技术，例如阴离子或阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱法、羟基磷灰石柱层析法等。

在本发明的又一方面，本发明涉及包含上述双靶向抗体或其抗原结合片段以及与其结合的药物的抗体-药物缀合物。

上述药物包括化学物质、放射性核素、免疫治疗剂、细胞因子、趋化因子、毒素、生物作用剂及酶抑制物质等。例如，本发明的抗体或其片段可直接或间接与抗癌剂结合，上述抗癌剂可例举阿西维辛、阿柔比星、阿考达唑、山油柑碱、阿多来新、阿拉诺新、阿地白介素、别嘌醇钠、六甲蜜胺、氨鲁米特、氨萘非特、聚肌胞、安吖啶、雄激素、蛇形菌素、氨基乙酸阿非迪霉素、亮氨酸溶肉瘤素、天冬酰胺酶、5-阿扎胞苷、硫唑嘌呤、卡介苗(BCG)、三嗪苯酰胺、β-2-脱氧硫代鸟苷、盐酸比生群、硫酸博来霉素、白消安、丁硫氨酸亚砜、BWA773U82、BW502U83/HCl、BW 7U85甲磺酸盐、ceracemide、卡贝替姆、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、氯喹喔啉-磺酰胺、氯脲菌素、色霉素A3、顺铂、克拉屈滨、皮质类固醇、短小棒状杆菌、CPT-11、克立那托、安西他滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、溴茴丙烯酸钠、dabis maleate、达卡巴嗪、放线菌素D、盐酸柔红霉素、deazauridine、右雷佐生、二脱水卫矛醇、地吖醌、二溴卫矛醇、didemnin B、乙基二硫代氨甲酸盐/酯、二甘醇醛、二氢-5-氮胞苷、多柔比星、棘霉素、依达曲沙、依地福新、依氟鸟氨酸、Elliott溶液、依沙芦星、表柔比星、依索比星、磷酸雌莫司汀、雌激素、依他硝唑、氨磷汀、依托泊苷、法倔唑、法扎拉滨、芬维A胺、非格司亭、非那雄胺、黄酮乙酸、氟尿苷、磷酸氟达拉滨、5'-氟尿嘧啶、Fluosol^TM、氟他胺、硝酸镓、吉西他滨、醋酸戈舍瑞林、hepsulfam、六亚甲基双乙酰胺、高三尖杉酯碱、硫酸肼、4-羟基雄烯二酮、羟基脲、盐酸伊达比星、异环磷酰胺、4-依波米醇、异丙铂、异维A酸、亚叶酸钙、醋酸亮丙立德、左旋咪唑、柔红霉素脂质体、脂质体包囊的多柔比星、洛莫司汀、氯尼达明、美登素、盐酸氮芥、美法仑、美诺立尔、merbarone、6-巯嘌呤、巯乙磺酸钠、卡介苗的甲醇提取物、甲氨蝶呤、N-甲基甲酰胺、米非司酮、米托胍腙、丝裂霉素-C、米托坦、盐酸米托蒽醌、单核细胞/巨噬细胞集落刺激因子、大麻隆、萘福昔定、新制癌菌素、醋酸奥曲肽、奥马铂、奥沙利铂、紫杉醇、pala、喷司他丁、哌嗪二酮、哌泊溴烷、吡柔比星、吡曲克辛、盐酸吡罗蒽醌、PIXY-321、普卡霉素、卟吩姆钠、泼尼莫司汀、丙卡巴肼、孕酮、吡唑呋林、雷佐生、沙格司亭、司莫司汀、螺锗、螺莫司汀、链黑霉素、链佐星、磺氯苯脲、舒拉明钠、他莫昔芬、泰索帝、替加氟、替尼泊苷、对苯二甲脒、替罗昔隆、硫鸟嘌呤、塞替派、胸苷注射剂、噻唑呋林、托泊替康、托瑞米芬、维A酸、盐酸三氟拉嗪、曲氟尿苷、三甲曲沙、肿瘤坏死因子、乌拉莫司汀、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、长春地辛长春瑞滨、长春利定、Yoshi 864、佐柔比星、阿糖胞苷、依托泊苷、美法仑、紫杉特尔和泰素。

在本发明的又一方面，本发明涉及用于预防或治疗自身免疫疾病的组合物，其包含上述双靶向抗体或其抗原结合片段或上述抗体-药物缀合物作为有效成分。例如，本发明可以为用于预防或治疗自身免疫疾病的药剂学组合物，其包含：(a)本发明的双靶向抗体或其抗原结合片段或上述抗体-药物缀合物的药剂学有效量；以及(b)药剂学上可接受的载体。

在本发明的又一方面，本发明涉及自身免疫疾病的预防或治疗方法，其包括向个体给药所需有效量的本发明的双靶向抗体或其抗原结合片段或上述抗体-药物缀合物的步骤。

上述自身免疫疾病可选自由类风湿性关节炎、银屑病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、多发性硬化症、间质性纤维化、红斑狼疮、肾小球肾炎、克罗恩病、炎症性肠病、自身免疫性眼病、儿童关节炎、白塞病、白细胞介素-1受体拮抗剂的缺乏症(DIRA)、肿瘤坏死因子受体相关周期性综合征(TRAPS)、新生儿期多系统炎性疾病(NOMID)、家族性地中海热(FMF)及冷卟啉相关周期性综合征(CAPS)组成的组中，但并不限定于此。

“预防”是指通过给药本发明的组合物来抑制或延迟自身免疫疾病进展的所有行动，“治疗”是指抑制自身免疫疾病的发展、缓解或消除自身免疫疾病。

本发明的组合物中包含的药剂学上可接受的载体是通常用于药剂学组合物的制剂化的载体，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但并不限定于此。除上述成分之外，本发明的组合物还可包括润滑剂、润湿剂、增甜剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂等。

在本发明中，“个体”是指患有可通过给药本发明的双靶抗体来缓解、抑制或治疗的症状或疾病或者处于该风险中的哺乳动物，优选为人。

在本发明中，“给药”是指通过一种合适的方法向个体引物规定的物质，本发明的包含双靶向抗体的组合物的给药途径还可通过可到达目标组织的任何常规途径给药。给药途径可以为腹腔内给药、静脉内给药、肌内给药、皮下给药、皮内给药、口服给药、局部给药、鼻内给药、肺内给药、直肠内给药，但并不局限于此。优选地，但当口服给药时，因蛋白质是可消化的，口服用组合物以包覆活性药剂或者保护其免于在胃中降解的方式剂型化。并且，本发明的药剂学组合物可通过使活性物质移动至靶细胞的任意装置给药。

本发明的组合物的适当的剂量因如制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病理状态、饮食、给药时间、给药凸镜、、代谢速度及反应敏感性的因素而不同，熟练的医生可容易确定及处方对于所期望的治疗或预防有效的剂量。例如，本发明的药剂学组合物的1天剂量为0.0001mg/kg～100mg/kg，例如，能够以1mg/kg至2g/kg的剂量给药。上述抗体或其抗原结合片段可单次给药或数次给药。在本说明书中，术语“药剂学有效量”是指足以预防或治疗自身免疫疾病的量。

本发明的组合物可作为单独治疗剂给药或者与其他治疗剂组合给药，可与现有的治疗剂依次给药或同时给药。

本发明的组合物可根据本发明所属技术领域的普通技术人员容易实施的方法利用药剂学上可接受的载体和/或赋形剂制剂化，由此以单位剂量形态制备或添加至多剂量溶剂内来制备。在此情况下，剂型可以为油性或水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者还可以为提取剂、散剂、栓剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，还可包括分散剂或稳定剂。

实施例

以下，通过实施例更详细地说明本发明。这些实施例仅用于例示本发明，本发明的范围并不局限于这些实施例。

实施例1：白细胞介素-17抗原表达及纯化

1-1：制备白细胞介素-17A蛋白质表达载体

为了克隆白细胞介素-17A的胞外域基因，以人白细胞介素-17AcDNA(北京义翘神州科技股份有限公司(Sinobiological)，中国：SEQ ID NO：50)为模板，利用在表3中记载的引物进行聚合酶链式反应(PCR，polymerase chain reaction)。通过将扩增的聚合酶链式反应产物插入至N293F载体来制备了表达在白细胞介素-17A的C-末端融合多聚组氨酸标签(His-tag)的蛋白质的白细胞介素-17A-N293F载体。利用制备的白细胞介素-17A-N293F载体转化(transformation)DH5α大肠杆菌细胞后，筛选了氨苄青霉素(ampicillin)抗性菌株。通过sfi I和xhoI限制酶的切割及测序来确认了是否插入白细胞介素-17A-His基因(SEQ ID NO：51)。通过相似的方式还制备了表达小鼠白细胞介素-17A-His的载体。

表3

1-2：白细胞介素-17A抗原的表达及纯化

为了生产人白细胞介素-17A-His(hIL-17A-His)或小鼠白细胞介素-17A-His(mIL-17A-His)抗原，以5×10⁵细胞/ml在自由式培养基(freestyle media)(Gibco，cat.A13835)接种HEK293F细胞后培养1天，将在1-1中制备的白细胞介素-17A-N293F载体用聚乙烯亚胺(PEI，polyethylenimine，Aldrich，cat.408727)转染(transfection)至HEK293F细胞。以1∶2(w/w)混合质粒与聚乙烯亚胺来形成人工合成多聚物(polyplex)后转染至细胞。对培养7天的细胞培养液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，利用转移(transfer)至聚偏二氟乙烯薄膜(PVDF membrane)来对抗-His辣根过氧化物酶(HRP)抗体进行处理，由此通过ECL底物确认了表达。

利用Ni-NTA柱(column)分别分离纯化表达的人白细胞介素-17A–His和小鼠白细胞介素-17A-His培养液后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用CBR-250染色来分析蛋白质。

实施例2：白细胞介素-17抗体的筛选

2-1：生物淘选

为了筛选与人白细胞介素-17A特异性结合的抗体候选物质，利用了由噬菌体展示技术和人B细胞的天然互补脱氧核糖核酸(naive cDNA)组成的Ymax-nABL文库(YBiologics，韩国)。

将在实施例1中制备的人白细胞介素-17A-His包被在免疫吸附管(Immuno tube)并添加文库噬菌体后，在室温条件下反应2小时后，利用1×磷酸盐吐温缓冲液(PBST)和1×磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后洗脱与抗原特异性结合的scFv-噬菌体。通过将洗脱的scFv-噬菌体再次感染大肠杆菌并扩增的淘选获取噬菌体的库(pool)，以在第一轮淘选中扩增的噬菌体为对象并增加磷酸盐吐温缓冲液清洗次数，除此之外，通过与第一轮淘选相同的方法重复进行第二轮淘选和第三轮淘选。

当确认通过第一轮淘选至第三轮淘选导出的人白细胞介素-17A噬菌体抗体库的CFU时，确认了第三轮淘选的输出CFU(output CFU)与第一轮淘选至第二轮淘选的输出CFU相比增加约10倍。

2-2：筛选与白细胞介素-17A特异性的抗体

为了确定通过每轮淘选获取的阳性聚ScFv-噬菌体抗体库的抗原特异性，进行多噬菌体酶联免疫吸附测定(ELISA，enzyme linked immunoassay)。对于包被有用于淘选的人白细胞介素-17A-His抗原及用于确认存在与小鼠抗原的交叉结合的小鼠白细胞介素-17A-His抗原的免疫板(immuno-plate)，利用在每轮淘选获取的噬菌体库进行直接酶联免疫吸附测定(direct ELSIA)。结果，对于人白细胞介素-17A-His抗原的结合能力主要在第三轮多ScFv-噬菌体增加，由此确认了第三轮淘选的阳性噬菌体库的抗-白细胞介素-17A噬菌体抗体增加。

从第三轮淘选的阳性噬菌体库随机筛选包含单克隆的大肠杆菌，在经2xYT/C培养液处理的96-深孔板(96-deep well plate)中，在37℃、300rpm的条件下以对数中期(mid-log)培养后，诱导辅助噬菌体感染。在6000rpm的条件下离心分离10分钟来使细胞颗粒化，并仅获取了存在于上清液的洗脱的单scFv-噬菌体。

分别以0.4μg/ml将人白细胞介素-17A-His、牛血清白蛋白包被在Maxisorb 96孔酶联免疫吸附测定板(Nunc，丹麦(Denmark))，利用包含3％的脱脂乳的磷酸盐吐温缓冲液封闭后，将在上文中获取的单scFv-噬菌体加入至各个包被有抗原的孔。上述酶联免疫吸附测定板利用0.05％的磷酸盐吐温缓冲液清洗3次，在0.05％的磷酸盐吐温缓冲液稀释抗-M13-辣根过氧化物酶(Horse Radish Peroxidase)抗体并添加至孔后反应1小时。利用邻苯二胺盐酸盐(OPD，o-phenylenediami ne dihydrochloride)底物处理10分钟来发色后，利用2N H₂SO₄来终止反应。对于发色的板，利用SpectraMax ELISA reader(Moleculardevice，美国)仪在490nm中测定吸光度。结果，筛选了相比于与用作对照抗原的牛血清白蛋白结合的信号，对于人白细胞介素-17A-his的结合信号至少强3倍以上的数十种的单scFv-噬菌体克隆。

对于所筛选的上述单克隆，使用脱氧核糖核酸纯化试剂盒(Qiage n，德国)分离了噬菌粒(phagemid)脱氧核糖核酸。通过分析所分离的脱氧核糖核酸的碱基序列、重链及轻链的序列来确认了序列互不相同的特异性克隆。之后，进行以为了增强亲和力而变更重链为目的的亲和力成熟(affinity maturation)，由此筛选了与白细胞介素-17A特异性的scFv。与白细胞介素-17A特异性的抗体的序列如下述表4(重链互补决定区及重链可变区)及表5(轻链互补决定区及轻链可变区)中的记载。

表4

表5

实施例3：靶向白细胞介素-17A和肿瘤坏死因子-α的双抗体的制备

3-1：生产双抗体

为了制备融合作为抗白细胞介素-17A抗体及抗肿瘤坏死因子-α抗体的修美乐的双抗体，将在上述实施例2中制备的抗白细胞介素-17A抗体单克隆中的7H3C11FW的scFv与修美乐重链核酸序列的3’-末端连接，并将其命名为SDA-0070。

作为抗-肿瘤坏死因子-α抗体的修美乐(阿达木单抗)基于包含重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：90)及包含轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：91)通过合成基因来制备。之后，向作为抗肿瘤坏死因子-α抗体的修美乐重链的核酸序列(SEQ ID NO：86)3'-末端引入连接子，接着连接利用通过优化获取的抗白细胞介素-17A重链可变区及轻链可变区的scFv核酸序列(SEQ ID NO：87)。由SEQ ID NO：92表示通过上述方式制备的双抗体重链氨基酸序列。

为了生产及制备这种双抗体作为蛋白质，利用HEK293F作为生产细胞又到了临时表达。将向命名为N293F的载体内插入上述双抗体的核酸序列来制备的质粒结构体与聚乙烯亚胺混合来形成人工合成多聚物，并在HEK293F细胞处理来转染后，利用自由式(Gibco，美国)培养基培养6天。在8000rpm的条件下离心分离培养液来去除细胞残害，利用瓶盖过滤器(bottle top filter：Millipore，Steritop-GP Filter Unit.Cat.No.SCGPS01RE)获取了纯培养液。

3-2：抗体的纯化

为了分离纯化存在于培养液中的肿瘤坏死因子-α/白细胞介素-17A双抗体，作为第一次纯化，利蛋白A(Protein A)树脂(KANEKA，日本)进行亲和纯化。向空柱(Bio-rad，BR731-1550)加入4ml的蛋白A后，填充及清洗100ml的杜氏磷酸缓冲液(DPBS)(LB001-02))。向填充有树脂的柱内加入培养基并以1ml/分钟的流速流入其(Bio-Rad，EP-1Econo pump，美国(USA))。在利用150ml的杜氏磷酸缓冲液清洗后，利用10ml的0.1M甘氨酸-盐酸(glycine-HCl)(pH值为3.3)洗脱。向洗脱液添加10％的1M三羟甲基氨基甲烷一盐酸(Tris-HCl)(pH值为9.0)来中和pH值，利用Amicon Ultra-15(Millipore，UF C901096)将缓冲溶液更换为杜氏磷酸缓冲液。将该过程约重复3次后，当浓缩为1ml程度时，停止并确认浓度。当测定浓度时，利用Epoch(Biotek，美国)进行了紫外线(UV)定量。

为了去除高分子物质，作为第二次纯化，利用Superdex200树脂(GE healthcare，美国)实施凝胶过滤(Gel filtration)色谱法。利用流动相的杜氏磷酸缓冲液(welgene，韩国)进行2CV平衡化(equilibration)，利用0.22μm的注射器式滤器(Millipore，SLGP033RB)过滤第一次纯化蛋白质后，向样品环(sample loop)上样10ml。向柱加入上样的蛋白质，合并(pooling)与靶分子相对应的分馏。利用Amicon Ultra-15(Millipore，UFC905096)浓缩合并的分馏，利用0.22μm的注射器式滤器(Millipore，SLGP033RB)灭菌过滤。

3-3：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及高效液相色谱法(HPLC)

将纯化的蛋白质与还原或非还原缓冲液混合来准备。为了分离蛋白质，分别以12％制备丙烯酰胺分离凝胶(TransLab，韩国)并安装在馏分收集器(BioRad，美国)，填充1X电泳缓冲液来上样2μg的样品。使分离凝胶分别包含一个包含上样蛋白质大小标记(BioRad，美国)的孔。在上样结束后，以从(-)朝向(+)方向在馏分收集器连接电极，以200V进行电泳直到上样缓冲液的亮蓝(brilliant blue)燃料到达至凝胶末端为止。电泳之后，利用考马斯亮蓝染色剂染色分离凝胶，并利用脱色缓冲液脱色后，利用蒸馏水(Distilledwater，D.W.)去除残留试剂，并分离标记和纯化蛋白分离形态(图1)。在凝胶过滤色谱纯化后，通过尺寸排阻(SE，Size Exclusion)-高效液相色谱法分析并确认抗体。

实施例4：双抗体的结合特异性分析

为了确认双抗体的抗原特异性结合的特异性，执行酶联免疫吸附测定。在37℃的温度下，将人白细胞介素-17A和小鼠白细胞介素-17A(R&D system，美国)、狨猴白细胞介素-17A(北京义翘神州科技股份有限公司，中国)、猕猴白细胞介素-17A、人肿瘤坏死因子-α(Peprotech，美国)、人白细胞介素-17F(R&D system，美国)、人白细胞介素-17A/F(R&Dsystem，美国)、牛血清白蛋白分别以15nM在96孔板进行O/N包被。之后，利用0.05％的3％脱脂乳/磷酸盐吐温缓冲液阻断未包被的部分后，将66nM、6.6nM、0.6nM的白细胞介素-17A抗体添加至板，在37℃的温度下反应1小时，以1∶3000稀释抗人Fc-辣根过氧化物酶(pierce，美国)并反应1小时。之后，将四甲基联苯胺(TMB)底物(BD，美国)处理10分钟并发色后，利用2N H₂SO₄处理来终止反应。对于发色的板，利用Sunrise ELISA reader(TECAN，瑞士)仪在450nm的条件下测定吸光度。

结果，与人肿瘤坏死因子-α单靶向抗体不同地，双抗体不仅与人肿瘤坏死因子-α结合，还与人白细胞介素-17A结合，保持对于狨猴、猕猴种及人白细胞介素-17A/F异质二聚体(heterodimer)的结合(图2a)。并且，未示出对于属于白细胞介素-17配位体家族的白细胞介素-17B、白细胞介素-17C、白细胞介素-17D、白细胞介素-17E及人RAGE-his、人ErbB2-his、人VEGF-his、人CD93-His、人HMGB1-His的非靶抗原蛋白的结合(图2b及图2c)。即，确认了本发明的抗体为仅将与人肿瘤坏死因子-α和人白细胞介素-17A或白细胞介素-17A/F的结合增强的非常特异性的抗体。

实施例5：利用酶联免疫吸附测定评价双抗体的两种抗原时结合能力

为了分析对于作为双抗体的靶的白细胞介素-17A和肿瘤坏死因子-α的同时结合能力，使用包被靶抗原肿瘤坏死因子-α并利用剩余靶抗原白细胞介素-17A来检测的酶免疫分析法。

将肿瘤坏死因子-α(peprotech，美国)在杜氏磷酸缓冲液(welgene，韩国)稀释至0.26μg/ml，在96孔板(corning，美国)以每孔100μl处理后，在4℃的温度下静置16小时来包被。清洗缓冲液使用酸盐吐温缓冲液(PBS-T)(0.1％的吐温20(Tween 20)，将脱脂乳(skimmilk)(BDbiosciences，美国)在酸盐吐温缓冲液稀释至3％来用于阻断。抗体试样从6.6nM到660fM为止每次稀释10倍，共稀释5个点，在96孔板以每孔100μl处理稀释的抗体试样，并在25℃的温度下反应1小时。将白细胞介素-17A-His(ybiologics，S0995)稀释至2.25μg/ml来以每孔100μl处理，并在25℃的温度下反应1小时后，以1∶5000稀释作为二次抗体将抗-His-辣根过氧化物酶(Thermofisher scientific，美国)并以每孔100μl处理，在25℃的温度下反应1小时。使用四甲基联苯胺(sigma aldrich，美国)作为底物，以每孔100μl加入并反应20分钟后，利用2.5N H₂SO₄终止底物反应，并利用Multiskan^TM GO MicroplateSpectrophotometer(thermofisher scientific，美国)在450nm的条件下测定吸光度。

结果，在单抗体中未发生结合反应，双抗体根据浓度提出示出肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-17A的同时结合反应(图3及表6)。

表6

对于肿瘤坏死因子-α及白细胞介素-17A抗原的各个抗体的EC50

实施例6：利用HT-29细胞分析评价SDA-0070阳离子交换色谱(CEX)纯化物的功效

为了试验而使用的HT-29(Homo sapiens colorectal adenocarcinoma)(韩国细胞株银行，韩国)为源自人结直肠腺癌的细胞株，以与白细胞介素-17和肿瘤坏死因子-α反应来分泌各种作为免疫性细胞因子和免疫性趋化因子的CXCL-1(human GRO-α)等而周知。使用通过如下的方式培养的细胞，即，使用包含10％的胎牛血清(Gibco，美国)、1％的抗生素、抗-抗(Anti-anti)(青霉素(penicillin)/链霉素(streptomycin)/抗支原体(anti-mycoplasma)；Gibco，美国)的RPMI1640(hyclone，美国)培养基传代培养3次以上。

中和能力试验执行对于白细胞介素-17A的单独中和能力、对于肿瘤坏死因子-α的单独中和能力、白细胞介素-17A及肿瘤坏死因子-α的同时中和能力三种。单独稀释白细胞介素-17A或肿瘤坏死因子-α或者混合它们来配置稀释物，将抗体试样从736pM到0.36pM为止每次稀释2倍，最终以共12个浓度处理。在96孔板混合各个稀释的抗体和之前制备的抗原稀释物，在37℃的温度下反应1小时。将在抗原-抗体反应结束的板进行胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)处理来回收的HT-29细胞以每孔7.5×10⁴细胞接种(seeding)，在37℃的温度、5％的CO₂环境下培养48小时，48小时后，回收排除细胞的培养液。对于回收的培养液，利用ELISA kit Human CXCL-1(R&D systems，美国)测定培养液中的CXCL-1浓度来评价了对于抗体的抗原的中和能力。

对于SDA-0070的中和能力比较试验结果，与单靶向抗体相比，双抗体对于白细胞介素-17A的中和能力和对于肿瘤坏死因子-α的中和能力较优秀，由此，白细胞介素-17A、肿瘤坏死因子-α同时中和能力也示出优秀的倾向(图4a至图4c及表7)。下述表7为利用HT-29细胞的SDA-0070克隆的抑制能力评价结果。

表7

实施例7：利用报告细胞分析对SDA-0070 CEX纯化物的功效进行评价

使用表达作为白细胞介素-17受体的白细胞介素-17RA及白细胞介素-17RC的HEK-Blue^TM白细胞介素-17细胞株(invivogen，美国)和表达作为肿瘤坏死因子-α受体的肿瘤坏死因子受体I(TNFRI)及肿瘤坏死因子受体II(TNFRII)的HEK-Blue^TM肿瘤坏死因子-α细胞株(invivogen，美国)，评价了对于白细胞介素-17A和肿瘤坏死因子-α的中和能力。当培养HEK-Blue细胞株时，使用包含10％的胎牛血清(Gibco，美国)、1％的抗生素及抗-抗(青霉素/链霉素/抗支原体；Gibco，美国)的DMEM-HG(hyclone，美国)，使用吉欧霉素(zeoci n；invivogen，美国)作为保持各个受体和SEAP表达的选择抗生素。在HEK-Blue^TM白细胞介素-17细胞株中，还使用作为抗生素混合产品的HEK-Blue^TM Selection(invivogen，美国)。用于实验的所有细胞使用传代培养3次以上的细胞，当从培养板回收细胞时，使用细胞消化液(accutase)(Merck Millipore，德国)。以将白细胞介素-17A(R&D，美国)的最终浓度成为0.6ng/ml、肿瘤坏死因子-α(R&D，美国)的最终浓度成为0.4ng/ml的方式分别制备抗原稀释物。各个抗体试样从736pM到0.36pM为止每次稀释2倍，最终以共12个浓度处理。在96孔板混合所稀释的抗体与抗原稀释物并在37℃的温度下反应1小时。在抗原-抗体反应结束的板中，以每孔5×10⁴细胞接种(seeding)利用细胞消化液回收的HEK-Blue^TM白细胞介素-17细胞和HEK-Blue^{T M}肿瘤坏死因子-α细胞，在37℃的温度、5％的CO₂环境下培养24小时，24小时后，回收排除细胞的培养液。向回收的培养液添加QUAN TI-Blue^TM培养基(Invivogen，美国)溶液并在37℃的温度下培养，根据所产生的底物反应速度，在20分钟至60分钟的时间内利用Multi skan^TM GO Microplate Spectrophotometer(Thermofisher scientific，美国)在622nm的条件下测定吸光度。

对于SDA-0070_CEX纯化物的HEK-Blue中和能力的比较试验结果，与作为白细胞介素-17的单靶向抗体的苏金单抗相比，示出优秀的功效，示出与作为肿瘤坏死因子-α的单靶向抗体的修美乐相似的功效(图5a及图5b及表8)。下述表8为利用HEK-Blue细胞株的SDA-0070的IC₅₀结果。

表8

实施例8：通过分析HT-29细胞来评价根据纯化法的物质功效等效性

8-1：阳离子交换色谱纯化

为了改善对于双抗体的纯化工序，除现有的凝胶过滤色谱柱(GE healthcare，英国)之外，利用阳离子交换色谱柱(Thermofisher scientific poros，美国)。

将阳离子交换色谱树脂(Thermo，美国)填充至柱后，利用流动相A的醋酸钠(sodium acetate)缓冲液与平衡化的AKTA Pure L(GE healthcare，美国)连接，并通过流动5CV的流动相A来进行平衡化。利用流动相A透析第一次纯化产物，通过0.22μm的注射器式滤器(Millipore，美国)过滤并注入。通过流动5CV的流动相A来去除非附着蛋白质，流动根据浓度梯度的流动相B(流动相A+1M NaCl)来洗脱上样的蛋白质。将洗脱液加入至透析袋(Spectrumlabs)并利用杜氏磷酸缓冲液(welgene，韩国)与至少4小时为间隔进行2次透析。对于所透析的蛋白质，利用amicon Ultra-15(Millipore，UFC905096)浓缩为20mg/mL以上，并利用0.22μm的注射器式滤器(Millipore，SLGP033RB)灭菌过滤。

8-2：比较根据纯化法的中和能力

对使用凝胶过滤色谱柱(GE healthcare，英国)的抗体试样纯化物与使用阳离子交换色谱柱(Thermofisher scientific poros，美国)纯化的抗体试样纯化物的HT-29细胞中的白细胞介素-17A、肿瘤坏死因子-α同时中和能力进行比较，来执行纯化法的差异是否影响功效的等效性评价。

为了试验，使用在包含10％的胎牛血清(Gibco，美国)、1％的抗生素、抗-抗(青霉素/链霉素/抗支原体；Gibco，美国)的RPMI1640(Hyclone，美国)培养基将HT-29细胞株(人结直肠腺癌(Homo sapiens colorectal adenocarcinoma))(韩国细胞株银行，韩国)传代培养3次以上来培养的细胞。

制备白细胞介素-17A(R&D systems，美国)和肿瘤坏死因子-α(R&D systems，美国)的稀释物，将抗体试样从736pM到0.7pM为止每次稀释4倍，最终以共6个浓度处理。在96孔板混合所稀释的体与抗原稀释物，在37℃的温度下反应1小时。经在抗原-抗体反应结束的板进行胰蛋白酶-乙二胺四乙酸处理来回收的HT-29细胞以每孔7.5×10⁴细胞接种，在37℃的温度、5％的CO₂环境下培养48小时，48小时后，回收排除细胞的培养液。对于回收的培养液，利用ELISA kit Human CXCL-1(R&D，美国)测定培养液中的CXCL-1浓度来评价了对于抗体的各个抗原的中和能力。

对于HT-29细胞的多个抗体试样的白细胞介素-17A、肿瘤坏死因子-α同时中和能力的试验结果，确认了凝胶过滤色谱柱纯化试样与阳离子交换色谱柱纯化试样之间的对于白细胞介素-17A和肿瘤坏死因子-α的同时中和能力以相似的水平保持(图6及表9)。下述表9评价了利用HT-29细胞的凝胶过滤色谱及阳离子交换色谱纯化法的功效。

表9

实施例9：利用HT-29细胞分析的HEK293及CHO-S衍生试样之间的物质功效等效性评价

利用通过HEK293临时表达系统生产的抗体试样SDA-0070_CEX和通过CHO-S细胞株系统生产并进行二次阳离子交换色谱纯化的试样SDA-0070_RD1601，评价HT-29细胞中的中和能力并比较了根据生产细胞株的功效等效性。

为了试验，使用在包含10％的胎牛血清(Gibco，美国)、1％的抗生素、抗-抗(青霉素/链霉素/抗支原体；Gibco，美国)的RPMI1640(hyclone，美国)培养基将HT-29细胞传代培养3次以上的细胞。中和能力试验执行对于白细胞介素-17A的单独中和能力、对于肿瘤坏死因子-α的单独中和能力、白细胞介素-17A及肿瘤坏死因子-α同时中和能力三种。为了试验白细胞介素-17A单独中和能力试验，将白细胞介素-17A(R&D，美国)以3.75ng/ml的最终浓度稀释，为了对于肿瘤坏死因子-α的单独中和能力试验，肿瘤坏死因子-α(R&D，美国)以1.17ng/ml的最终浓度稀释。为了白细胞介素-17A及肿瘤坏死因子-α的同时中和能力试验，白细胞介素-17A以2.5ng/ml的最终浓度稀释、且肿瘤坏死因子-α以0.39ng/ml的最终浓度稀释。将抗体试样从736pM到0.36pM为止每次稀释2倍，最终以共12个浓度处理。在96孔板混合所稀释的抗体和抗原稀释物，在37℃的温度下反应1小时。将在抗原-抗体反应结束的板进行胰蛋白酶-乙二胺四乙酸处理来回收的HT-29细胞接种，在37℃的温度、5％的CO₂环境下培养48小时，并回收培养液。对于回收的培养液，利用ELISA kit Human CXCL-1(R&D，美国)测定培养液中的CXCL-1浓度来评价了对于抗体的抗原的中和能力。

对于相同克隆的HEK293临时表达系统生产试样SDA-0700_CEX和CHO-S细胞株生产试样SDA-0070_RD1601之间的中和能力进行比较试验的结果，未发生对于白细胞介素-17和肿瘤坏死因子-α的中和能力差异(图7a至7c及表10)。下述表10比较了利用HT-29细胞的生产系统之间的功效。

表10

实施例10：通过分析报告细胞来评价HEK293及CHO-S衍生试样之间的功效物质等效性

对通过HEK293细胞株临时表达系统生产的抗体试样SDA-0070_CEX和通过CHO-S细胞株系统生产的抗体试样SDA-0070_RD1601的HEK-Blue衍生细胞中的中和能力进行评价，并比较根据生产细胞株的功效等效性。

使用表达作为白细胞介素-17受体的白细胞介素-17RA及白细胞介素-17RC的HEK-Blue^TM白细胞介素-17细胞株(invivogen，美国)和表达作为肿瘤坏死因子-α受体的肿瘤坏死因子受体I及肿瘤坏死因子受体II的HEK-Blue^TM肿瘤坏死因子-α细胞株(invivogen，美国)，评价了对于白细胞介素-17A和肿瘤坏死因子-α的中和能力。当培养HEK-Blue细胞株时，使用包含10％的胎牛血清(Gibco，美国)、1％的抗生素及抗-抗(青霉素/链霉素/抗支原体；Gibco，美国)的DMEM-HG(hyclone，美国)，共同使用吉欧霉素(invivogen，美国)作为保持各个受体和SEAP表达的选择抗生素。在HEK-Blue^TM白细胞介素-17细胞株中，还使用作为抗生素混合产品的HEK-Blue^TM Selection(invivogen，美国，hb-sel)。用于实验的所有细胞使用传代培养3次以上的细胞，当从培养皿回收细胞时，使用细胞消化液(Merck Millipore，德国)。以将白细胞介素-17A(R&D，美国，7955-IL-025/CF)的最终浓度成为0.6ng/ml、肿瘤坏死因子-α(R&D，美国，210-TA-020/CF)的最终浓度成为0.4ng/ml的方式分别制备抗原稀释物，各个抗体试样从736pM到0.36pM为止每次稀释2倍，最终以共12个浓度处理。在96孔板混合所稀释的抗体和抗原稀释物，在37℃的温度下反应1小时。在抗原-抗体反应结束的板中，接种利用细胞消化液回收的HEK-Blue白细胞介素-17细胞和HEK-Blue肿瘤坏死因子-α细胞，在37℃的温度、5％的CO₂环境下培养24小时，24小时后，回收排除细胞的培养液。向回收的培养液添加QUANTI-Blue^TM培养基(Invivogen，美国)溶液并在37℃的温度下培养，根据所产生的底物反应速度，在20分钟至60分钟的时间内利用分光光度计(spectrophotometer)(thermofish er scientific，美国，Multiskan^TM GO MicroplateSpectrophotometer)在622nm的条件下测定吸光度。

对相同克隆的HEK293临时表达系统生产试样SDA-0070_CEX与CHO-S细胞株生产试样SDA-0070_RD1601之间的中和能力进行比较试验的结果，未发生源自细胞的两种蛋白质功效差异(图8a、图8b及表11)。下述表11比较了利用HEK-Blue衍生细胞的各个蛋白质的功效。

表11

实施例11：对于人FcRn抗原的抗体的亲和力评价

使用Octet QK分析设备(Fortebio Inc，美国)测定了对于人或猴FcRn(北京义翘神州科技股份有限公司Sinobiological，中国)抗原的多个抗体的亲和力。Octet分析设备通过适用BLI(Bio-Layer Interferometry)原理来测定在生物传感器表面结合的蛋白质层的厚度变化，因此可实时监测蛋白质与其他生物分子的结合情况。

使用涂敷有镍的Ni-NTA生物传感器(ForteBio Inc，18-5101)在蛋白质的C-末端固定与组氨酸残基结合的人或猴FcRn-His抗原，并使其分别与按照浓度准备的抗体修美乐及SDA-0070结合来求得亲和力。

对于人FcRn的所有抗体的亲和力调查结果，SDA-0070在6.0的pH值的条件下的结合速度(Kon)为1.6×10⁶ 1/Ms，示出与正常免疫球蛋G结构的修美乐相似的结合速度，解离速度(Kdis)低于1×10^-31/s。KD反映极小的解离速度(Kdis)差异，修美乐的KD为6.4×10^-10M水平，SDA-0070的KD为5.0×10^-10M水平。在pH值为7.4的环境中，SDA-0070的解离速度(Kdis)为与修美乐相似的水平的5.83×10^-3 1/s。并且，猴FcRn中的分析与人FcRn的结果相似。尽管具有双抗体的结构差异，示出与正常结果的免疫球蛋白G相似水平的FcRn亲和力。下述表12示出SDA-0070与人、FcRn、猴FcRn之间的动力参数(Kinetic parameter)。

表12

实施例12：对于抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用蛀牙蛋白质的SDA-0070的结合评价

为了测定SDA-0070的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADC C，antibody-dependent cell mediated cytotoxicity)中的结合力，实施间接-酶联免疫吸附测定(Indirect-ELISA)。抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用为NK细胞识别与靶细胞的表面结合的抗体的Fc区域并将该细胞作为靶示出细胞毒性的现象。位于NK细胞的表面的CD16、CD64等与抗体的Fc结合来触发激活信号，由此诱导感染细胞的细胞凋亡。

为了评价SDA-0070与CD64和CD16的结合，使用一种免疫球蛋白G1形态的抗体(Sigma Aldrich，美国)和修美乐(Abbvie，美国)作为阳性条件抗体。一同使用一种免疫球蛋白G4(Sigma Aldrich，美国)抗体作为阴性条件抗体。利用杜氏磷酸缓冲液将1μg/ml的重组人FcγRIIIA/CD16a蛋白(R&D systems，美国)、重组人FcγRI/CD64蛋白(R&D systems，美国)和牛血清白蛋白(Sigma Aldric h，美国)以每孔100μl的浓度处理在96孔板(NUNC，96well plat bottom)，反应12小时以上并包被。将所要试验结合的如上所述的抗体组从1380nM稀释4倍，分别以100μl处理来反应2小时。利用二次抗体过氧化物酶亲和F(ab’)2片段山羊抗人免疫球蛋白G(Peroxi dase-AffiniPure F(ab')2Fragment Goat Anti-HumanIgG)、F(ab')2片段特异性(F(ab')2Fragment Specific)(Jackson Immune research，美国)进行处理并反应1小时。利用四甲基联苯胺处理来确认发色，利用H₂SO₄处理来终止底物反应后，在450nm的条件下利用分光光度计(Thermo Scinentific，美国)检测。

测定抗体组的Fc部分与源自NK细胞的CD64结合的程度的结果，SDA-0070的结合力为与修美乐及免疫球蛋白G1对照组的结合力等同的水平(图9)。

并且，对于抗体组与CD16a的结合力，免疫球蛋白G1对照抗体的情况最为优秀，其次SDA-0070和修美乐抗体相似(图10)。确认了对于牛血清白蛋白结合力，SDA-0070及对照组抗体均未反应(图11)。

实施例13：SDA-0070与白细胞介素-17A及肿瘤坏死因子-α同时结合能力的分析

如下所述，利用OCTET实时确认SDA-0070与肿瘤坏死因子-α及白细胞介素-17A的同时结合的形态。

使用Octet QK分析设备(Fortebio Inc，美国)，使得抗体通过Fc区域与AHC生物传感器(ForteBio Inc，美国)结合。将SDA-0070以10ug/ml的浓度稀释在1×Kinetics缓冲液(Fortebio Inc，美国)，上样至AHC生物传感器来结合。与传感器结合的SDA-0070通过稳定化时间确认未结合状态。根据各个条件，仅处理20nM的肿瘤坏死因子-α(Peprotech，美国)或Kinetics缓冲液来实时比较肿瘤坏死因子-α结合，之后，根据各个条件仅处理15nM的白细胞介素-17A(R&D syst ems，美国)或Kinetics缓冲液来实时比较白细胞介素-17A结合。

结果，与通过使用酶联免疫吸附测定来确认的结果相同地，通过实时结果资料确认了SDA-0070同时认知两个抗原并结合(图12)。

实施例14：抗白细胞介素-17A和抗肿瘤坏死因子-α抗体的中和能力分析

在包含添加有人润滑膜细胞(Synoviocyte)培养基(Cell application，美国)的96-孔细胞培养板的各个孔以2×10⁴细胞接种以通过肿瘤坏死因子-α或白细胞介素-17A诱导作为炎症性细胞因子的hIL-6表达的细胞周知的类风湿性关节炎成纤维样滑膜的商用细胞(Cell application，美国)，在37℃的温度、5％的CO₂条件下培养24小时。在本实施例中，与作为肿瘤坏死因子-α单靶向抗体的修美乐(Abbvie，美国)、作为白细胞介素-17A单靶向抗体的苏金单抗(苏金单抗；Novartis，瑞士)、作为肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-17A双抗体的LY3114062(Eli lilly，WO2014137961，美国)一同评价SDA-0070。在1.87ng/ml的人肿瘤坏死因子-α(R&D system，美国)、18.7ng/ml的人白细胞介素-17A(R&D system，美国)，将作为抗白细胞介素-17A的苏金单抗抗体从17664pM每次稀释4倍并混合，SDA-0070、LY3114062或作为抗肿瘤坏死因子-α抗体的修美乐从4416pM进行阶段稀释并混合后，将混合物分别在37℃的温度反应1小时。

在上文中培养的类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞处理混合物并一同培养24小时。之后，仅取出培养液并在hIL-6测定用酶联免疫吸附测定试剂盒(ELISA kit)(R&Dsystem，美国)进行处理，利用分光光度计(Multiskan GO，Thermo Scinentific，美国)测定hIL-6表达量。

结果，确认了与单一抗白细胞介素-17抗体或单一抗肿瘤坏死因子-α抗体处理组相比，SDA-0070双抗体示出更加优秀的白细胞介素-6(IL-6)分泌抑制能力(图13至图15、表13至表15)。

表13

商用类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞中的对于白细胞介素-17A及肿瘤坏死因子-α的同时中和能力评价结果

表14

商用类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞中的对于白细胞介素-17A的中和能力评价结果

表15

商用类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞中的对于肿瘤坏死因子-α的中和能力评价结果

实施例15：利用源自患者的类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞的SDA-0070的白细胞介素-17A及肿瘤坏死因子-α中和能力评价

在本实施例中，分离并培养并不是商用类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞的类风湿性关节炎患者的成纤维细胞样滑膜细胞(rheumatoid arthritis-fibroblast likesynoviocyte，RA-FLS)，并评价SDA-0070的活性。经滑膜组织块切成细小块后，在达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium)(WelGENE Inc.，韩国)添加1mg/ml的2型胶原酶(Worthington Biochemical Corporation)并进行反应。在达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)(添加有10％的胎牛血清(FBS，fetal bovine serum)、1％的P/S(supplemented with 10％fetal bovine serum(FBS),1％P/S))中再次悬浮后，利用细胞过滤器(40μm的细胞过滤网(cell strainer))过滤，并附着在100mm的培养皿。仅重复培养所附着的细胞并使用。

将分离培养的源自患者的类风湿性关节炎成纤维样滑膜(RA03)细胞以5×10⁴细胞/ml接种在24孔板，在37℃的温度培养后，在各个细胞分别以10³、10²、10¹、10⁰,、10^-1、10^-2及1^0-3pM处理修美乐、SDA-0070及LY3114062，1小时后，同时处理10ng/ml的肿瘤坏死因子-α(R&Dsystems，美国)和50ng/ml的白细胞介素-17A(R&D systems，美国)，48小时后回收细胞培养液。对于所回收的培养液，以3500rpm的条件离心分离5分钟来获取上清液，保存在超低温冷冻库并用于酶联免疫吸附测定实验。为了测定细胞培养液中的白细胞介素-6的浓度，利用人白细胞介素-6酶联免疫吸附测定(Human IL-6ELISA)(R&Dsystems，美国)进行分析。

在类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞(RA03)中，在肿瘤坏死因子-α+白细胞介素-17A诱导白细胞介素-6生产条件下确认了抗体处理组的IC₅₀值(pM单位)。结果，当按降序查看IC₅₀值时，分析了SDA-0070为0.3694pM、LY3114062为1.420pM、修美乐为1.966pM。经确认，SDA-0070作为双抗体的同时抑制肿瘤坏死因子-α及白细胞介素-17A的功效最为优秀，与LY3114062相比，优秀约3.8倍，与作为肿瘤坏死因子-α的单靶向抗体的修美乐相比，优秀约5倍(图16a至图16c)。

实施例16：在C57BL/6小鼠中测定白细胞介素-17A、肿瘤坏死因子-α功能抑制能力

通过体内(In vivo)实验，确认根据给药双抗体的白细胞介素-17A/肿瘤坏死因子-α刺激引起的血清内的KC浓度变化。

向每5只一组的C57/BL6雄性、6周龄小鼠注射磷酸盐缓冲液、SDA-0070(40μg/小鼠)、LY3114062(40μg/小鼠)、苏金单抗(30μg/小鼠)及修美乐(30μg/小鼠))。1小时后，皮下注射0.5μg/小鼠的肿瘤坏死因子-α(R&D systems，美国)及6μg/小鼠的白细胞介素-17A(R&D system，美国)，4小时后获取血液。以5000rpm的条件对所采集的血液进行10分钟的离心分离，来获取血清并保存在超低温冷冻库，利用Quantikine ELISA Mouse CXCL1/KCImmunoassay kit(R&Dsystems，美国)测定了KC(CXCL1)浓度。

在包被有抗小鼠KC抗体的微孔板，处理稀释在分析用稀释液的小鼠血清，在常温条件下反应2小时。利用清洗缓冲液清洗5次后，按照100μl处理小鼠KC偶联物(Conjugate)后，在常温条件下反应2小时。利用清洗缓冲液再次清洗5次后，以100μl添加底物溶液并反应30分钟，利用终止溶液终止反应后，利用分光光度计在450nm的条件下测定O.D。

结果，与阳性对照组(仅肿瘤坏死因子-α+白细胞介素-17A组合(TNF-α+IL-17Acombination only))相比，利用抗体处理的组均示出统计学上显著低的KC水平(level)，其中，确认了SDA-0070处理自具有最低的KC水平。与修美乐处理组相比，SDA-0070处理组的为p＝0.0012，具有统计学上显著优秀的功效，与LY3114062处理组相比，SDA-0070处理组为p＝0.0138，具有统计学上优秀的功效。即，确认根据向体内给药双抗体的白细胞介素-17A/肿瘤坏死因子-α刺激引起的血清内KC浓度变化的结果，确认了SDA-0070与白细胞介素-17A及肿瘤坏死因子-α两种抗原的中和能力优秀(图17)。

产业上的可利用性

本发明的双靶向抗体或其抗原结合片段对于白细胞介素-17A及肿瘤坏死因子-α示出高特异性，与现有的单靶向抗体相比，不仅示出出色的中和能力，还同时抑制白细胞介素-17和肿瘤坏死因子-α，由此迅速抑制炎症及免疫反应，从而具有减少给药剂量且增强治疗效果的优点。

以上，详细说明的本发明内容的特定部分，这种具体技术仅为优选的实施方式，本发明的范围并不局限于此，对于本技术领域的普通技术人员而言是明确的。因此，本发明的实质范围通过发明要求保护范围和它们的等同技术方案定义。

序列表自由文本

附上电子文件。

<110> Y生物股份有限公司

<120> 与白细胞介素-17A及肿瘤坏死因子-α特异性结合的双靶向抗体

<130> KHP212111222.4

<160> 92

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<223> FR1

<400> 22

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp

20 25 30

<210> 23

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FR2

<400> 23

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

1 5 10

<210> 24

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FR3

<400> 24

Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 25

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FR4

<400> 25

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Ile Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 26

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FR2

<400> 26

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Val

1 5 10

<210> 27

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FR1

<400> 27

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Ala Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Asn Ile Ile Cys

20

<210> 28

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FR2

<400> 28

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Leu Leu Val Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 29

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FR3

<400> 29

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Thr Arg Asp Glu Ser Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 30

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FR4

<400> 30

Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

1 5 10

<210> 31

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FR1

<400> 31

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Ser Ile Thr Cys

20

<210> 32

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FR2

<400> 32

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 33

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FR3

<400> 33

Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 34

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH

<400> 34

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Ala Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Gly Ser Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Thr Leu Ile Ser Phe Asp Gly Arg Ser Lys Leu Tyr Gly Asp Ser Val

50 55 60

Arg Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Lys Ile Ser Asp Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Arg Glu Gly Glu Asp Ala Phe Asp Leu Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 35

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH

<400> 35

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Gly Ser Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Thr Leu Ile Ser Phe Asp Gly Arg Ser Lys Leu Tyr Gly Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ser Val Arg Gly Glu Ala Ala Phe Asp Leu Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 36

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH

<400> 36

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Gly Ser Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Thr Leu Ile Ser Phe Asp Gly Arg Ser Lys Leu Tyr Gly Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ser Lys Leu Gly Glu Asp Ala Phe Asp Leu Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 37

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH

<400> 37

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Gly Ser Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Thr Leu Ile Ser Phe Asp Gly Arg Ser Lys Leu Tyr Gly Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ser Arg Ile Gly Glu Asp Ala Phe Asp Leu Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 38

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH

<400> 38

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp His

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Leu Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Phe Ser Asp Ser Arg Gly Arg Ser Asp Val Pro Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Ile Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 39

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH

<400> 39

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp His

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Leu Ile Gly Pro Asp Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Phe Ser Asp Ser Arg Gly Arg Ser Asp Val Pro Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Ile Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 40

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL

<400> 40

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Ala Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Asn Ile Ile Cys Ser Gly Asp Asn Leu Arg Thr Lys Tyr Val

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Leu Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gln Asp Thr Arg Arg Pro Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Thr Arg

65 70 75 80

Asp Glu Ser Thr Tyr Tyr Cys Met Thr Trp Asp Val Asp Thr Thr Ser

85 90 95

Met Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 41

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL

<400> 41

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Leu Arg Thr Lys Tyr Val

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gln Asp Thr Arg Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Thr Trp Asp Val Asp Thr Thr Ser

85 90 95

Met Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 42

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VH

<400> 42

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggcccagc ctgggaggtc cctcagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cgccttcggt agttacacta tgcactgggt ccgccaggcg 120

ccaggcaagg gactggagtg ggtgacactt atatcgtttg atggacgtag caagctttac 180

ggagactccg tgagggaccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa catgctgtat 240

ctgaaaataa gtgacctgcg atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagacggggg 300

agggagggtg aagatgcttt cgatctctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcctca 360

360

<210> 43

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VH

<400> 43

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtgcagc ctgggaggtc cctcagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cgccttcggt agttacacta tgcactgggt ccgccaggcg 120

ccaggcaagg gactggagtg ggtgacactt atatcgtttg atggacgtag caagctttac 180

ggagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cagcctgtat 240

ctgcagatga acagcctgcg agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagggtct 300

gtgcggggtg aagctgcttt cgatctctgg ggccaaggga cactggtcac cgtctcctca 360

360

<210> 44

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VH

<400> 44

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtgcagc ctgggaggtc cctcagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cgccttcggt agttacacta tgcactgggt ccgccaggcg 120

ccaggcaagg gactggagtg ggtgacactt atatcgtttg atggacgtag caagctttac 180

ggagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cagcctgtat 240

ctgcagatga acagcctgcg agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagggagt 300

aagttgggtg aagatgcttt cgatctctgg ggccaaggga cactggtcac cgtctcctca 360

360

<210> 45

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VH

<400> 45

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtgcagc ctgggaggtc cctcagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cgccttcggt agttacacta tgcactgggt ccgccaggcg 120

ccaggcaagg gactggagtg ggtgacactt atatcgtttg atggacgtag caagctttac 180

ggagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cagcctgtat 240

ctgcagatga acagcctgcg agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaggttcg 300

cgtattggtg aagatgcttt cgatctctgg ggccaaggga cactggtcac cgtctcctca 360

360

<210> 46

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VH

<400> 46

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cgtctggatt cacctttgat gatcatgcca tgcactgggt ccgtcaagct 120

ccagggaagg gtctggagtg ggtctctctt attagcggtg atggtggtgc cacatactat 180

gcagactctg tgaagggccg gttcatcatc tccagagaca acagcaaaaa ctccctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagacatttt 300

tctgatagtc gtggtcgctc cgatgttcct tttgatatct ggggccaagg gacactgatc 360

accgtctcct ca 372

<210> 47

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VH

<400> 47

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cgtctggatt cacctttgat gatcatgcca tgcactgggt ccgtcaagct 120

ccagggaatg gtctggagtg ggtcggcctg attggtcctg atggtggtgc cacatactat 180

gcagactctg tgaagggccg gttcatcatc tccagagaca acagcaaaaa ctccctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagacatttt 300

tctgatagtc gtggtcgctc cgatgttcct tttgatatct ggggccaagg gacactgatc 360

accgtctcct ca 372

<210> 48

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VL

<400> 48

tcctatgagc tgacacaggc accctcactg tccgtgtcgc caggacagac agccaacatc 60

atctgctctg gagataactt gcgtactaaa tatgtttctt ggtatcagca gaagccaggc 120

cagtcccctt tattggtcat ctatcaggac accaggcggc cctcaggcat ccctgcgcga 180

ttctcaggct ccaactcggg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccagactaga 240

gatgaatcta cctattactg tatgacgtgg gacgtcgaca ctacctcgat gattttcggc 300

ggagggacca agctgaccgt ccta 324

<210> 49

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VL

<400> 49

tcctatgagc tgacacagcc cccctcagtg tccgtgtcgc caggacagac agccagcatc 60

acctgctctg gagataactt gcgtactaaa tatgtttctt ggtatcagca gaagccaggc 120

cagtcccctg tgttggtcat ctatcaggac accaggcggc cctcaggcat ccctgagcga 180

ttctcaggct ccaactcggg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg 240

gatgaagctg actattactg tatgacgtgg gacgtcgaca ctacctcgat gattttcggc 300

ggagggacca agctgaccgt ccta 324

<210> 50

<211> 396

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hIL-17A

<400> 50

ggaatcacaa tcccacgaaa tccaggatgc ccaaattctg aggacaagaa cttcccccgg 60

actgtgatgg tcaacctgaa catccataac cggaatacca ataccaatcc caaaaggtcc 120

tcagattact acaaccgatc cacctcacct tggaatctcc accgcaatga ggaccctgag 180

agatatccct ctgtgatctg ggaggcaaag tgccgccact tgggctgcat caacgctgat 240

gggaacgtgg actaccacat gaactctgtc cccatccagc aagagatcct ggtcctgcgc 300

agggagcctc cacactgccc caactccttc cggctggaga agatactggt gtccgtgggc 360

tgcacctgtg tcaccccgat tgtccaccat gtggcc 396

<210> 51

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-17A-His

<400> 51

ggaatcacaa tcccacgaaa tccaggatgc ccaaattctg aggacaagaa cttcccccgg 60

actgtgatgg tcaacctgaa catccataac cggaatacca ataccaatcc caaaaggtcc 120

tcagattact acaaccgatc cacctcacct tggaatctcc accgcaatga ggaccctgag 180

agatatccct ctgtgatctg ggaggcaaag tgccgccact tgggctgcat caacgctgat 240

gggaacgtgg actaccacat gaactctgtc cccatccagc aagagatcct ggtcctgcgc 300

agggagcctc cacactgccc caactccttc cggctggaga agatactggt gtccgtgggc 360

tgcacctgtg tcaccccgat tgtccaccat gtggcccatc atcatcatca tcaccatcac 420

420

<210> 52

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 52

ggaatcacaa tcccacgaaa t 21

<210> 53

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 53

ggccacatgg tggacaatcg g 21

<210> 54

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR1

<400> 54

Asp Tyr Ala Met His

1 5

<210> 55

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR2

<400> 55

Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu

1 5 10 15

Gly

<210> 56

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR3

<400> 56

Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 57

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR1

<400> 57

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 58

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR2

<400> 58

Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser

1 5

<210> 59

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR3

<400> 59

Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr

1 5

<210> 60

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR1

<400> 60

Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr Ala

1 5

<210> 61

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR2

<400> 61

Met Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys

1 5

<210> 62

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR3

<400> 62

Ala Arg Asp Arg Gly Ile Ala Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly

1 5 10 15

Met Asp Val

<210> 63

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR1

<400> 63

Ser Gln Ser Val Tyr Ser Tyr

1 5

<210> 64

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR2

<400> 64

Asp Ala Ser

1

<210> 65

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR3

<400> 65

Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Phe Thr

1 5 10

<210> 66

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR1

<400> 66

Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr Gly

1 5

<210> 67

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR2

<400> 67

Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile

1 5

<210> 68

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR3

<400> 68

Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 69

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR1

<400> 69

Gln Asn Val Gly Thr Asn

1 5

<210> 70

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR2

<400> 70

Ser Ala Ser

1

<210> 71

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR3

<400> 71

Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 72

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR1

<400> 72

Gly Phe Ile Phe Ser Asn His Trp

1 5

<210> 73

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR2

<400> 73

Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr

1 5 10

<210> 74

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR3

<400> 74

Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr

1 5 10

<210> 75

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR1

<400> 75

Gln Phe Val Gly Ser Ser

1 5

<210> 76

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR2

<400> 76

Tyr Ala Ser

1

<210> 77

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR3

<400> 77

Gln Gln Ser His Ser Trp Pro Phe Thr

1 5

<210> 78

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH

<400> 78

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 79

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL

<400> 79

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 80

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH

<400> 80

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Met Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Lys Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Gly Ile Ala Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly

100 105 110

Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 81

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL

<400> 81

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Tyr Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105

<210> 82

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH

<400> 82

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser

115

<210> 83

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL

<400> 83

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 84

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH

<400> 84

Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn His

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ala

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Thr Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser

115

<210> 85

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL

<400> 85

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Phe Val Gly Ser Ser

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Thr Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Trp Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Val Lys

100 105

<210> 86

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VH

<400> 86

gaagtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggccggag cctgcggctg 60

agctgcgccg ccagcggctt caccttcgac gactacgcca tgcactgggt gcggcaggcc 120

cccggcaagg gcctggagtg ggtgagcgcc atcacctgga acagcggcca catcgactac 180

gccgacagcg tggagggccg gttcaccatc agccgggaca acgccaagaa cagcctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caaggtgagc 300

tacctgagca ccgccagcag cctggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtctct 360

agcgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900

aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020

tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080

gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320

acgcagaaga gcctctccct gtctccg 1347

<210> 87

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scFv

<400> 87

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtgcagc ctgggaggtc cctcagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cgccttcggt agttacacta tgcactgggt ccgccaggcg 120

ccaggcaagt gcctggagtg ggtgacactt atatcgtttg atggacgtag caagctttac 180

ggagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cagcctgtat 240

ctgcagatga acagcctgcg agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagggtct 300

gtgcggggtg aagctgcttt cgatctctgg ggccaaggga cactggtcac cgtctcctca 360

ggcggcggtg gatccggcgg aggaggctcc ggaggtggcg gaagcggtgg cggaggatct 420

tcctatgagc tgacacagcc cccctcagtg tccgtgtcgc caggacagac agccagcatc 480

acctgctctg gagataactt gcgtactaaa tatgtttctt ggtatcagca gaagccaggc 540

cagtcccctg tgttggtcat ctatcaggac accaggcggc cctcaggcat ccctgagcga 600

ttctcaggct ccaactcggg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg 660

gatgaagctg actattactg tatgacgtgg gacgttgaca ctacctcgat gattttcggc 720

tgcgggacca agctgaccgt ccta 744

<210> 88

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接子

<400> 88

ggaggcggag gttctggcgg cggcggctcc ggtggaggtg gctca 45

<210> 89

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VL

<400> 89

gacatccaga tgacccagtc tcccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgggtgacc 60

atcacctgcc gggccagcca gggcatccgg aactacctgg cctggtacca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gccagcaccc tgcagagcgg cgtgcccagc 180

cggttcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gaggacgtgg ccacctacta ctgccagcgg tacaaccggg ccccctacac cttcggccag 300

ggcaccaagg tggaaatcaa aagaaccgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642

<210> 90

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH

<400> 90

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro

<210> 91

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL

<400> 91

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 92

<211> 712

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SDA-0070

<400> 92

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

450 455 460

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

465 470 475 480

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Gly Ser Tyr

485 490 495

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

500 505 510

Thr Leu Ile Ser Phe Asp Gly Arg Ser Lys Leu Tyr Gly Asp Ser Val

515 520 525

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr

530 535 540

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

545 550 555 560

Ala Arg Gly Ser Val Arg Gly Glu Ala Ala Phe Asp Leu Trp Gly Gln

565 570 575

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

580 585 590

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Leu

595 600 605

Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Ser Ile

610 615 620

Thr Cys Ser Gly Asp Asn Leu Arg Thr Lys Tyr Val Ser Trp Tyr Gln

625 630 635 640

Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Thr Arg

645 650 655

Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn

660 665 670

Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp

675 680 685

Tyr Tyr Cys Met Thr Trp Asp Val Asp Thr Thr Ser Met Ile Phe Gly

690 695 700

Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

705 710