阅读说明：本技术 一种淫羊藿根提取物及其制备方法和用途 (Epimedium root extract and its prepn and use ) 是由 房春林 吴学渊 韩笑 *** 于 2020-07-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种淫羊藿根提取物,它是以淫羊藿根的醇提物和水提物为活性成分,加入兽药上可接受的辅料制成的提取物。本发明淫羊藿根提取物,经试验证实其具有显著提升免疫损伤动物的白细胞和淋巴细胞数量的作用,可作为一种免疫调节剂在兽医临床上使用,具有广泛的应用前景。(The invention discloses an epimedium root extract, which is an extract prepared by taking alcohol extract and water extract of epimedium root as active ingredients and adding auxiliary materials acceptable for veterinary drugs. Experiments prove that the epimedium root extract has the effect of remarkably increasing the number of leucocytes and lymphocytes of immune-damaged animals, can be used as an immunomodulator in veterinary clinic, and has wide application prospect.)

一种淫羊藿根提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明具体涉及一种淫羊藿根提取物及其制备方法和用途。

背景技术

淫羊藿(Herba epimedii)属小檗科植物，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效，现代药理研究表明，淫羊藿具有显著的抗菌、抗炎作用，其提取物对免疫器官、免疫细胞、免疫因子等均具有调节作用，并能促进骨骼生长，阻止钙质流失，预防骨质疏松；同时淫羊藿煎剂具有性激素样作用，可以使雌性小鼠血清子宫增重、E2含量升高、雄性小鼠血清T含量升高，此外，淫羊藿还具有镇咳、平喘、祛痰，镇痛、镇静、局麻等作用。针对药理研究，近年来学者对产生这些药理作用的有效成分也进行了较多研究，研究表明，淫羊藿的主要药用成分是黄酮类化合物和多糖，此外还含有生物碱、木脂素、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚麻酸、酚苷类、紫罗酮类、乙醇苷类等。

目前《中国兽药典》收载的淫羊藿属于淫羊藿药材的地上部分，规定淫羊藿苷含量不低于0.5％，但是研究发现淫羊藿根成分也较为丰富，具有有抗炎、抗菌等功能，民间一直将淫羊藿根用来抗菌、消炎，俗称“小黄连”。经前期实验研究表明，淫羊藿根主要成分为潮藿定C，含量为高于3.6％，但根中淫羊藿苷含量非常低，所以淫羊藿与淫羊藿根在主要成分含量上存在较大差别，目前淫羊藿根资源丰富，储藏量大，主要分布在亚洲、中东、欧洲的温带和亚热带地区，在我国遍布于全国各地，在华东、华南(除山东省)各省，湖南、湖北、四川、贵州、陕西等地方均有分布，因此资源丰富，具有研究开发的资源优势。

目前，还没有关于淫羊藿根在提高免疫力方面的研究报道，更没有其提取物在提高免疫力方面的应用。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了淫羊藿根及其提取物在制备提高免疫功能的药物中的用途。

进一步地，所述药物为提升动物白细胞和/或淋巴细胞数量的药物。

进一步地，所述淫羊藿根提取物是淫羊藿根加10～20倍量v/w，ml/g的70-75％乙醇回流提取2次，每次2h的醇提物，与回流提取后的淫羊藿根残渣加20倍量v/w，ml/g的水煎煮提取2次，每次2h的水提物混合，得到的混合提取物。

本发明还提供了一种提高免疫功能的组合物，它包含淫羊藿根醇提物和淫羊藿根水提物，其中，醇提物是淫羊藿根加10～20倍量70-75％乙醇回流提取2次，每次2h得到的醇提物；所述水提物是淫羊藿根醇提物制备后的淫羊藿根残渣加20倍量水煎煮提取2次，每次2h得到的水提物。

进一步地，所述组合物每1g相当于原生药材淫羊藿根2～4g。

本发明还提供了一种前述组合物的制备方法，它包括如下步骤：

1)取淫羊藿根，加10-20倍量70％-75％的乙醇回流提取，过滤，得醇提液；

2)取步骤1)所得淫羊藿根残渣，加入20倍水量煎煮提取，过滤，得水提液；

3)步骤1)醇提液和步骤2)水提液混合，浓缩至无醇味，再干燥成粉末，添加辅料即得。

进一步地，所述组合物每1g相当于原生药材2.5g；所述干燥为喷雾干燥；所述辅料为淀粉。

本发明最后提供了一种前述组合物的制备方法，它包括如下步骤：

a)取淫羊藿根，加10-20倍量70％-75％的乙醇回流提取，过滤，滤液挥干，真空干燥得醇提物；淫羊藿根残渣，加20倍水量煎煮提取，过滤，滤液喷雾干燥得水提物；

b)取PEG8000加热熔化，加PVP_K-17加热溶解，混匀，再加入步骤a)醇提物溶解，冷却至凝固，粉碎，得淫羊藿根醇提物可溶性粉；

c)分别取步骤a)水提物和步骤b)淫羊藿根醇提物可溶性粉，加入辅料混合，再合并，即得。

进一步地，步骤a)所述真空干燥温度60-80℃；和/或，步骤b)所述PEG8000：PVP_K-17：醇提物的质量比为400～500g：40～50g：200～250g，优选400g：40g：200g；和/或，步骤c)所述水提物加入辅料至每1g相当于原生药材2.5g，淫羊藿根醇提物可溶性粉加入辅料至每1g相当于原生药材10g；所述合并时混有辅料的淫羊藿根醇提物可溶性粉与混有辅料的水提物的质量比为1：4。

更进一步地，所述辅料为葡萄糖。

本发明含淫羊藿根提取物的组合物，经试验证实其具有显著提升免疫损伤动物的白细胞和淋巴细胞数量的作用，可作为一种免疫调节剂在兽医临床上使用，具有广泛的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的

具体实施方式

，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

实施例1本发明含淫羊藿根提取物的组合物

取淫羊藿根10kg，加入10倍75％的乙醇回流提取2次，每次2h，过滤后滤液保存；取回流后的淫羊藿根残渣，加入20倍水量煎煮提取2次，每次2h，过滤后混合醇提液和水提液，然后浓缩至无醇味，喷雾干燥成粉末(含量为每1g粉末相当于原生药材4g)

实施例2本发明含淫羊藿根提取物的组合物

取淫羊藿根10kg，加入20倍70％的乙醇回流提取2次，每次2h，过滤后滤液保存；取回流后的淫羊藿根残渣，加入20倍水量煎煮提取2次，每次2h，过滤后混合醇提液和水提液，然后浓缩至无醇味，喷雾干燥成粉末(含量为每1g粉末相当于原生药材4g)

实施例3、本发明含淫羊藿根提取物的组合物

取淫羊藿根10kg，加入10倍量75％的乙醇回流提取2次，每次2h，过滤后滤液保存；取回流后的淫羊藿根残渣，加入20倍水量煎煮提取2次，每次2h，过滤后混合醇提液和水提液，然后浓缩至无醇味，喷雾干燥成粉末，添加辅料淀粉至4kg(含量为每1g粉末相当于原生药材2.5g)，即得。

实施例4、本发明含淫羊藿根提取物的组合物

取淫羊藿根10kg，加入20倍量70％的乙醇回流提取2次，每次2h，过滤后滤液保存；取回流后的淫羊藿根残渣，加入20倍水量煎煮提取2次，每次2h，过滤后混合醇提液和水提液，然后浓缩至无醇味，喷雾干燥成粉末，添加辅料淀粉至4kg(含量为每1g粉末相当于原生药材2.5g)，即得。

实施例5、本发明含淫羊藿根提取物的组合物

1、取淫羊藿根10kg，加入20倍量70％的乙醇回流提取2次，每次2h，过滤，滤液挥干乙醇后60-80℃真空干燥得淫羊藿根醇提物200-250g；

取PEG8000 400-500g，加入干燥的烧杯中，加热熔化成液体，加入PVPK-17 40-45g，加热溶解，搅拌均匀，加入前述淫羊藿根醇提物(含原生药材10kg)，搅拌溶解，冷却至凝固，粉碎至80目得淫羊藿根醇提物可溶性粉，加入辅料葡萄糖至1kg。

2、取回流后的淫羊藿根残渣，加入20倍水量煎煮提取2次，每次2h，过滤喷雾干燥成粉末，添加辅料葡萄糖至4kg(含量为每1g粉末相当于原生药材2.5g)，即得。

3、合并步骤1和步骤2中所得的混有辅料的提取物，得淫羊藿根提取物5kg(含原生药材2g/g)。

以下通过试验例来说明本发明的有益效果。

试验例1水溶性淫羊藿根醇提物工艺研究

前期试验中发现淫羊藿根醇提物干燥后的固体粉末不能完全溶于水，这使淫羊藿根提取物对免疫力的药效有显著的影响，故对淫羊藿根醇提物固体的制剂工艺进行了优化。

1、材料

1.1淫羊藿根醇提取物200g(含原生药材为5g/g)，自制；

聚乙烯吡咯烷酮(PVP_K-17)、聚乙二醇8000(PEG8000)、吐温40。

2方法

2.1熔融法

2.1.1单溶剂筛选

根据前期初步筛选试验，单溶剂与提取物比例按2:1比例称取，分别称取聚乙烯吡咯烷酮(PVP _K-17)、吐温40、聚乙二醇8000(PEG8000)400g，加入烧杯中，加热熔化，加入淫羊藿根醇提取物200g，搅拌溶解，观察记录溶解情况，冷却溶液至固体状，粉碎至细度为80目，观察固体形态是否符合粉剂要求(即药物含量准确，混合均匀，色泽一致，不发霉、结块、无变质现象，符合卫生学标准)，另取制备的粉末1g，加入蒸馏水100ml，观察其溶解性。结果见表1。

表1单溶剂对淫羊藿根的溶解效果

溶剂	用量(g)	液体澄明度	粉末形态及性质	粉末水溶性
					PVP <sub>K-17</sub>	400	有沉淀	符合要求	部分溶解
PEG8000	400	澄明	有一定粘度	溶解
					吐温40	400	澄明	粘度较大	溶解

单溶剂筛选试验结果表明，PVP _K-17熔点较高，提取物在熔融液中溶解性较差，吐温40、聚乙二醇8000(PEG8000)溶解性较好，但吐温40为半固体状态，粉末粘度较大，不符合粉剂要求，聚乙二醇8000(PEG8000)效果较好，但略有一点粘度，因此，需要开展复合溶剂的筛选。

2.1.2复合溶剂筛选

根据2.1.1筛选结果，按表2溶剂用量称取复合溶剂，加入烧杯中，加热熔化、溶解，加入淫羊藿根醇提取物200g，搅拌溶解，观察记录溶解情况，冷却溶液至固体状，粉碎至细度为80目，观察固体形态是否符合粉剂要求及粉末水溶解性，另取制备的粉末1g，加入蒸馏水100ml，观察其溶解性。结果见表2。

表2复合溶剂对淫羊藿根的溶解效果

复合溶剂筛选试验结果表明，PEG8000+PVP _K-17因按400g和40g比例组合，形成的粉剂水溶性好，粘度较小，符合粉剂要求。

3结论

通过溶剂筛选试验，确定水溶性淫羊藿根醇提物制备工艺为：按溶剂与提取物比例按2:1比例，称取聚乙二醇8000(PEG-8000)400g加入烧杯中熔化，再加入PVP _K-1740g搅拌溶解，加入淫羊藿根醇提物200g，搅拌溶解，冷却至室温，凝固成固体后粉碎至80目，即得。

试验例2淫羊藿根提取物对小鼠免疫功能的影响

1材料与方法

18-22g ICR小鼠140只(合格证编号：0011089)，雌雄各半，以及饲料，均购自四川省医学科学院试验动物研究所(成都)，常规饲养，适应1周后用于试验。

1.1药品

本发明涉及到的药品环磷酰胺、黄芪多糖、淫羊藿根均为已知产品，通过购买市售产品获得。

1.2主要试剂和仪器

小鼠白介素-2(IL-2)试剂盒：购自于南京建成生物工程研究所，批号:20160628；

小鼠白介素-4(IL-4)试剂盒：购自于南京建成生物工程研究所，批号:20160628；

血常规仪：深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，型号，BC 2800-Vet；

酶标仪：BIO-Rad，Imark；

电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司，CPA225D；

离心机：科大创新股份有限公司，HC-3017；

烘箱：上海博迅实业有限公司，GZX-9076MBE；

旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂，RE-3000。

2方法

2.1淫羊藿根的提取

淫羊藿根提取物：取淫羊藿根10kg，加入10-20倍70％-75％的乙醇回流提取2次，每次2h，过滤后滤液保存；取回流后的淫羊藿根残渣，加入20倍水量煎煮提取2次，每次2h，过滤后混合醇提液和水提液，然后浓缩至无醇味，喷雾干燥成粉末(含量为每1g粉末相当于原生药材4g)，保存备用。

2.2分组

140只小鼠，分别分为正常组、模型组、黄芪多糖口服液组、淫羊藿根低剂量、淫羊藿根中剂量和淫羊藿根高剂量组，每组20只，雌雄各半。试验第2-6组均需环磷酰胺造模，剂量为80mg/kg体重，分别于4、8、12日腹腔注射，正常组注射等量生理盐水，环磷酰胺使用生理盐水配置。黄芪多糖口服液组以1ml/只灌胃，淫羊藿根低中高剂量分别为2、4、6g/kg原生药材给药，1-14天，正常组和模型组灌胃等量的生理盐水，于15日处死采集相关数据。

2.3免疫器官指数

小鼠处死后称定体重，分离脾脏记录重量，并统计脾脏指数。免疫器官指数＝免疫器官鲜重(g)/体重(g)*1000。

2.4白细胞和淋巴细胞

采集小鼠的抗凝血，使用血细胞分析仪测定其白细胞和淋巴细胞的数量。

2.5血清中IL-2和IL-4测定

按小鼠IL-2和IL-4ELISA试剂盒操作说明书进行，测定小鼠血清中IL-2水平。

3.结果与分析

3.1淫羊藿根提取物对免疫损伤小鼠体重和脾脏指数的影响

不同剂量淫羊藿根提取物处理后，小鼠体重和脾脏指数见表3。结果可知环磷酰胺显著降低正常小鼠小鼠体重和脾脏指数(p<0.05)；对于小鼠体重的影响是，黄芪多糖口服液和淫羊藿根基本不能逆转，但是对于脾脏指数，黄芪多糖口服液和淫羊藿根提取物给药后有一定的升高，但是差异不显著(p>0.05)。

表3淫羊藿根对免疫损伤小鼠体重和脾脏指数的影响

注:*表示与模型组比较差异显著p<0.05。

3.2淫羊藿根提取物对免疫损伤小鼠白细胞和淋巴细胞数量的影响

由表4的结果可知，淫羊藿根提取物能显著降低小鼠的白细胞和淋巴细胞数量(p<0.05)。在给药后，淫羊藿根提取物的高剂量能显著恢复免疫损伤小鼠的白细胞数量，而淋巴细胞数量则能在中高剂量得到显著的恢复(p<0.05)，效果优于黄芪多糖口服液。

表4淫羊藿根对免疫损伤小鼠白细胞和淋巴细胞数量的影响

注:*表示与模型组比较差异显著p<0.05。

3.3淫羊藿根提取物对免疫损伤小鼠细胞因子的影响

淫羊藿提取物根对免疫损伤小鼠细胞因子的影响结果见表5，与正常组比较，环磷酰胺免疫损伤小鼠的白介素2和白介素4含量显著低于正常组(p<0.05)。淫羊藿根提取物能在一定程度上恢复免疫损伤状态，但是对IL-2的影响不显著(p>0.05)；淫羊藿根提取物的高、中、低剂量均能显著改善小鼠的IL-4的含量，且呈剂量依赖关系(p<0.05)。

表5淫羊藿根提取物对免疫损伤小鼠细胞因子的影响

注:*表示与模型组比较差异显著p<0.05。

以上研究结果表明，淫羊藿根提取物能显著提升免疫损伤小鼠的白细胞和淋巴细胞数量，且具有剂量依赖性；而对细胞因子的影响，则主要是通过IL-4途径，而对IL-2途径影响不明显。因此淫羊藿根提取物也具有免疫调节的效应，可用于动物免疫抑制性疾病的预防和治疗。