阅读说明：本技术 一种抗hiv的单克隆抗体及其制备方法和应用 (anti-HIV monoclonal antibody and preparation method and application thereof ) 是由 李太生 孙明 刘玉斌 李冰香 王红叶 朱小永 于 2020-06-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抗HIV的单克隆抗体及其制备方法和应用。所述的单克隆抗体包括重链和轻链,具体如序列表所示。本发明运用YU2 gp140 trimer和AE1 gp140 trimer双抗原对感染HIV的长期不进展者进行特异性单个记忆B细胞的分选,获得了配对的抗体重链和轻链基因,并筛选得到抗HIV的单克隆抗体7D5。该抗体具有高结合活性及有限中和活性。优化的抗体基因克隆方案提高了重链和轻链的扩增效率。该单克隆抗体的发现不仅为HIV感染的预防和治疗提供了备选药物,也为抗病毒感染的单抗药物研发提供了技术参考。(The invention discloses an anti-HIV monoclonal antibody and a preparation method and application thereof. The monoclonal antibody comprises a heavy chain and a light chain, and is specifically shown in a sequence table. The invention uses YU2 gp140 trimer and AE1gp140 trimer double antigens to sort specific single memory B cells of a long-term non-progressor infected with HIV, obtains paired antibody heavy chain and light chain genes, and screens to obtain the anti-HIV monoclonal antibody 7D 5. The antibodies have high binding activity and limited neutralizing activity. The optimized antibody gene cloning scheme improves the amplification efficiency of heavy chains and light chains. The discovery of the monoclonal antibody not only provides an alternative medicine for preventing and treating HIV infection, but also provides a technical reference for developing monoclonal antibody medicines for resisting virus infection.)

一种抗HIV的单克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于抗病毒感染单克隆抗体制备技术领域，具体是涉及一种能有效抑制人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染的单克隆抗体。同时，本发明还涉及所述单克隆抗体的制备方法，以及该抗体在抗感染药物制备方面的应用。

背景技术

HIV是一种感染CD4⁺免疫细胞的慢病毒，属逆转录病毒，于1981年在中美洲首次发现。HIV感染人体可导致获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS)。目前没有有效的疫苗用于预防HIV感染，且病毒感染后几乎无法根治。全球现有3690万感染病例，每年约有170万的新发病例，77万人死于AIDS。我国现存活HIV感染者/AIDS病人约85万例，年新增感染人数约15万。现有的抗逆转录病毒治疗(antiretroviraltherapy，ART)虽可抑制HIV-1的复制和延长患者的预期寿命，但ART不能清除病毒储存库，因此需要终身用药。而患者的依从性、药物不良反应和耐药毒株的出现也是ART面临的重大挑战。因此，需要一些新的策略来预防和治疗HIV感染，以控制病毒传播和疾病发展。

广谱中和抗体(broadly neutralizing antibodies,bNAbs)的分离和作用机制研究为HIV的防控以及疫苗的设计提供了新的方法。目前，已有3个bNAbs完成II期临床研究，其治疗功效已在HIV感染者中得到证实，预防效果评价已进入临床试验阶段。bNAbs较长的半衰期、Fc效应功能可增强机体对HIV-1的免疫应答。抗体介导的免疫增强作用也许能更好的控制病毒复制和清除感染细胞从而降低HIV-1储存库的量。此外，bNAbs免疫学特征和结构特征以及作用位点的阐明，为疫苗的设计提供了新的思路，基于抗原表位以及基于抗体谱系的免疫策略也正准备进入临床试验。

但是，值得注意的是，广谱高效中和抗体对已建立的感染治疗时，依然存在效力相对有限的问题，在接受bNAbs治疗的病人中，由于预先可能存在逃逸型毒株，或单一抗体对病毒的选择压力相对较小，使得抗体在使用一段时间后，多数患者体内很快就会由于突变病毒的发展而出现病毒载量的反弹。同时，一旦建立感染，中和抗体对细胞与细胞之间传播(cell-to-cell transmission)病毒的阻断能力也会明显下降。此外，目前分离到的bNAbs主要源自北美和非洲患者，流行毒株以B亚型和C亚型为主，我国主要的流行毒株以CRF01-AE亚型和CRF07_BC亚型为主，且CRF01-AE感染者呈现病毒载量高、病程进展快的特点，现有bNAbs的应用受到一定的影响和限制，对中国流行毒株和感染患者的效力也将受限。另外，目前的人源抗HIV单克隆抗体制备技术对抗体基因的扩增效率有限。因此，需要进一步优化抗体分选和分子克隆技术，促进bNAbs的分离和鉴定，为临床应用提供更多的候选抗体。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种具有良好活性的抗HIV的单克隆抗体。

本发明同时提供了一种制备所述单克隆抗体的方法。

本发明的目的还在于提供所述单克隆抗体在制备治疗或预防HIV感染药物方面的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

一种抗HIV的单克隆抗体，包括重链和轻链，其特征在于：所述的单克隆抗体重链可变区的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO.1所示；轻链可变区的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO.2所示；所述的单克隆抗体重链可变区的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4氨基酸编码序列如序列表SEQ ID NO.3所示；轻链可变区的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4氨基酸编码序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

一种制备所述抗HIV单克隆抗体的方法，包括以下步骤：

(1)基于12株不同亚型和中和敏感度的HIV假病毒，从HIV感染的长期不进展者中筛选血浆中和效价和广谱度最佳的样本作为抗体分选的供体；所述的12株HIV假病毒为B亚型4个毒株：RHPA4259.7，SC42266.8，TRJO4551.58，REJO4541.67；C亚型4个毒株：Du156.12，Du172.17，Du422.1，ZM55F.PB28a；AE亚型4个毒株：2249_13_2_1；2316_14_22_3；2149_39_2_2，498_40_32_4；

(2)用HIV gp140三聚体蛋白YU2 gp140 trimer和AE1 gp140 trimer作为分选抗原，从供体的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中分选HIV特异性的单个记忆性B细胞；

(3)再将B细胞裂解产物与carrier RNA冰浴10分钟，之后作为模板逆转录获得cDNA，巢式PCR体系扩增抗体的重链和轻链可变区基因；

(4)将抗体的重链可变区通过连接TOPO载体测序鉴定后连接表达载体，抗体的轻链可变区通过同源重组连接表达载体，并在293T、293F细胞及CHO-S细胞中进行抗体表达；

(5)细胞表达上清与千分之一的rProtein A微球室温孵育2小时后，加入层析柱中进行抗体纯化，得到所需的抗HIV单克隆抗体。

所述的抗HIV单克隆抗体在制备治疗或预防HIV感染药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明运用YU2 gp140 trimer和AE1 gp140 trimer双抗原对感染HIV的长期不进展者进行特异性单个记忆B细胞的分选，获得了配对的抗体重链和轻链基因，并筛选得到抗HIV的单克隆抗体7D5。该抗体具有高结合活性及有限中和活性。优化的抗体基因克隆方案(具体见实施例一)提高了重链和轻链的扩增效率。该单克隆抗体的发现不仅为HIV感染的预防和治疗提供了备选药物，也为抗病毒感染的单抗药物研发提供了技术参考。

附图说明

图1：HIV特异性抗原gp140三聚体蛋白的活性鉴定。(A)gp140蛋白与HIV-1特异性单抗的结合活性。(B)gp140蛋白与血浆的结合活性。

图2：流式分选HIV特异性单个记忆性B细胞。CD20⁺CD27⁺YU2gp140⁺AE1gp140⁺细胞按单个分选到96孔PCR板中。FSC：前向散射光；SSC:侧向散射光。

图3：巢氏PCR扩增抗体可变区基因。(A)重链PCR结果。(B)轻链(κ链)PCR结果。

图4：抗体可变区基因序列特征分析。(A)重链可变区和轻链可变区的胚系基因来源。(B)重链可变区和轻链可变区的突变频率。(C)重链可变区和轻链可变区不同胚系基因来源序列的突变频率。(D)重链可变区和轻链可变区的CDR3长度。

图5：表达的抗体蛋白鉴定。(A)Western Blot鉴定细胞表达的抗体蛋白，左为细胞上清，右为细胞内。(B)SDS-PAGE鉴定纯化的抗体蛋白。

图6：抗体与HIV-1特异性蛋白的结合能力。(A)抗体与AE1 gp140三聚体蛋白的结合能力。(B)抗体与YU2 gp140三聚体蛋白的结合能力。(C)抗体与CRF_07BC gp140三聚体蛋白的结合能力。

图7：单抗7D5的病毒抑制作用分析。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但附图和实施例并不是对本发明技术方案的限定，所有基于本发明教导所做出的变化或等同替换均应属于本发明的保护范围。

实施例一：对所述抗HIV单克隆抗体的制备过程作详细说明。

(一)血浆中和活性检测

1.样本：本研究通过了北京协和医院伦理委员会的审查，所有患者均签署了知情同意书。

纳入标准：

(1)经初筛试验及蛋白印迹检测HIV抗体结果均为阳性；

(2)HIV感染超过4年；

(3)未接受抗逆转录病毒治疗；

(4)血浆病毒载量可检测得到；

(5)有PBMC样本。

排除标准：

(1)年龄大于65岁或小于18岁；

(2)合并严重机会感染造成重要脏器功能衰竭；

(3)严重肝肾疾病；

(4)活动性肿瘤患者；

(5)妊娠及哺乳期患者。

2.中和活性检测：检测59个样本对12株HIV-1假病毒(B亚型4个毒株：RHPA4259.7，SC42266.8，TRJO4551.58，REJO4541.67；C亚型4个毒株：Du156.12，Du172.17，Du422.1，ZM55F.PB28a；AE亚型4个毒株：2249_13_2_1；2316_14_22_3；2149_39_2_2；498_40_32_4)的中和效价和广谱度。方法如下：

(1)血浆样本在56℃热灭活1h，短暂离心去除不溶物。

(2)在96孔细胞培养板中，细胞对照(第1列)加150μl GM(DEME+10％FBS+25mMHEPES+1％双抗)，其余各孔加100μl GM，另加40μl GM到3A-3H和8A-8H(如下表)。

(3)取11μl①号血浆加入3A-B，②号血浆加入3C-D，依次，即血浆初始稀释度为1:20。

(4)充分混匀血浆样本，取50μl移入下一孔，依次3倍系列稀释。

(5)解冻HIV-1假病毒，用GM稀释至4000TCID₅₀/ml，取50μl(200TCID₅₀)加入2-12列。

(6)37℃孵育1h。

(7)消化TZM-bl细胞，用GM重悬，细胞浓度为1.3×10⁵个/ml，并加入DEAE-dextranhydrochloride(10mg/ml)是其浓度为25μg/ml。

(8)取100μl细胞悬液(即每1.3×10⁴个细胞)加到细胞板中，DEAE-dextranhydrochloride终浓度为10μg/ml。

(9)将细胞板放置在温度为37℃，CO2浓度为5％的培养箱培养48h。

(10)读数：48h后弃去细胞培养液，用200μl PBS清洗一次，拍干；每孔加20μlLysis Solution，室温放置10min；用Reaction Buffer 1：50稀释反应底物，每孔加100μl，室温孵育40min；用酶标仪读板，setting——luminescence——96well costar)。

(11)计算血浆的50％抑制稀释度(ID₅₀)，血浆各稀释度的病毒抑制比例(％)＝(V-T)/(V-C),T为待测样品，C为细胞对照，V为病毒对照；通过GraphPad Prism的log(inhibitor)vs.response--Variable slope计算ID₅₀。

3.结果分析：经过活性筛选，中和滴度(ID₅₀)大于60，并且中和一半以上毒株(>6个)的样本为6个，可以作为中和抗体分选的候选样本(参见表1)。

表1.具备中和活性的候选样本(ID₅₀)

ID₅₀为50％抑制稀释度，GEO为几何平均值，/12表示中和毒株的数目。

(二)HIV特异性抗原的活性鉴定

1.酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测抗原活性

(1)抗原包被：用磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)将抗原(HIV-1YU2 gp140三聚体蛋白或HIV-1AE1gp140三聚体蛋白)稀释为1μg/ml，加入酶标板中，100μl/孔，37℃孵育2h。

(2)洗涤：用PBST(PBS+0.5‰吐温-20)洗涤3次。

(3)封闭：加入100μl封闭液(PBST+5％BSA)，4℃封闭过夜。

(4)洗涤：PBST洗涤3次。

(5)在稀释板上用封闭液将血浆或抗体系列2倍稀释，稀释按每孔100μl加入已包被的96孔板中，37℃孵育2h。

(6)PBST洗涤5次。

(7)酶标二抗用封闭液稀释(1:20000)，每孔加100μl，37℃孵育1h。

(8)PBST洗涤5次。

(9)显色液A、B液按1:1混合后，每孔加100μl，在室温于暗处放置5min-10min。

(10)加50μl终止液终止反应。

(11)用酶标仪450nm处读数。

(12)计算阴性血浆对照组读数的平均值及SD值，读数值大于对照组平均值+2×SD值的最大稀释倍数为该样品的抗体滴度。

2.结果分析：gp140三聚体蛋白能与抗HIV-1单克隆抗体(VRC01、N6、10-1074和10E8)特异性结合，与候选样本的血浆亦有很强的结合能力(见图1)。

(三)分选抗原的标记

按照PerCP Conjugation Kit和Lightning-LinkAllophycocyanin(APC)Conjugation Kit标记试剂盒的说明书(Innova Biosciences公司)将HIV-1gp140三聚体蛋白标记进行荧光标记，步骤如下：

(1)在10μl HIV-1YU2 gp140三聚体蛋白(浓度为1.4mg/ml)和10μl HIV-1AE1gp140三聚体蛋白(浓度为1.1mg/ml)中分别加入1μl LL-modifier试剂，轻轻混匀。

(2)将HIV-1YU2 gp140三聚体蛋白和LL-modifier混合液加入10μg PerCP荧光素冻干粉中，HIV-1AE1 gp140 trimer蛋白和LL-modifier混合液加入10μg APC荧光素冻干粉中，溶解并混匀。

(3)室温避光孵育3h。

(4)加1μl LL-quencher试剂孵育30min后使用。

(四)HIV特异性单个记忆B细胞的分选

(1)PBMC复苏：将冻存的候选样本的PBMC(约1×10⁷个)在37℃水浴中迅速复苏，并用10ml 37℃预热的RPMI 1640培养基(+10％FBS)重悬，860×g离心5min。

(2)标记：弃去培养基，将细胞用10ml预冷的PBS重悬，860×g离心5min，弃上清；将荧光素标记的抗体(CD20-PE、CD27-FITC)及抗原(YU2 gp140-PerCP、AE1 gp140-APC)混合液加入细胞中，室温孵育1h；细胞用10ml预冷的PBS洗一次，用1ml预冷的PBS重悬。

(3)分选：将标记的PBMC在FACSjazzTM Cell Sorter流式细胞仪上进行分析和分选，CD20⁺CD27⁺YU2gp140⁺AE1gp140⁺的抗原特异性记忆性B细胞以单个分入含有20μl裂解液(0.5μl RNase Out,5μl 5×first strand buffer,1.25μl 0.1M DTT和0.0625μl Igepal)的96孔PCR板中。

(4)冻存：迅速置于干冰中，并移至-80℃冰箱冻存。

(5)结果：共获得约750个CD20⁺CD27⁺YU2gp140⁺AE1gp140⁺细胞(见图2)。

(五)单个B细胞基因克隆

1.逆转录

将上述冻存的96孔板解冻后，按照SuperScript^TMIV First-Strand SynthesisSystem(Invitrogen，18091050)的说明，加入试剂进行逆转录，步骤如下：

(1)在96孔PCR板中，每孔加1μl carrier RNA，冰上静置10min。

(2)每孔加

2μl random hexamers at 50ng/μl,

1.5μl dNTP mix,each at 10mM,

(3)65℃加热5min，冰上放置至少1min。

(4)加RNase Inhibitor(40U/μl)0.5μl和1μl SuperScript IV。

(5)反应条件：23℃10min,50℃20min，然后80℃灭活10min。

2.巢氏PCR

(1)重链可变区巢氏PCR

引物：

抗体重链基因的第一轮巢式PCR反应体系如下：

PCR反应条件：预变性98℃15min；PCR反应94℃30s，56℃30s，72℃55s，35个循环；延伸72℃10min。

抗体重链基因的第二轮巢式PCR反应体系如下：

PCR反应条件：预变性98℃15min；PCR反应94℃30s，58℃30s，72℃45s，40个循环；延伸72℃10min。

(2)轻链(kappa)可变区巢氏PCR

引物：

抗体轻链(kappa)基因第一轮巢式PCR反应体系如下：

PCR反应条件：预变性98℃2min；98℃10s，56℃5s，72℃10s，35个循环；终延伸72℃5min。

抗体的轻链(kappa)基因第二轮巢式PCR反应体系如下：

PCR反应条件：预变性98℃2min；98℃10s，58℃5s，72℃10s，35个循环；延伸72℃5min。

抗体的轻链(Light chain)kappa基因第三轮巢式PCR反应体系如下：

PCR反应条件：预变性98℃2min；98℃10s，60℃5s，72℃10s，35个循环；延伸72℃5min。

(3)轻链(Lamda)可变区巢式PCR

引物：

抗体的轻链(Light chain)Lamda基因第一轮巢式PCR反应体系如下：

PCR反应条件：预变性98℃2min；98℃10s，58℃5s，72℃10s，35个循环；终延伸72℃5min。

抗体的轻链(Lamda)基因第二轮巢式PCR反应体系如下：

PCR反应条件：预变性98℃2min；98℃10s，60℃5s，72℃10s，40个循环；延伸72℃5min。

3.PCR产物胶回收纯化

(1)柱平衡步骤：向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。

(3)向胶块中加入等倍体积溶液PC(如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μl PC溶液)，50℃水浴放置10min左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

(4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。

(5)向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW(已加入无水乙醇)，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；重复操作步骤。

(6)将吸附柱CB2放入收集管中，12,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。

(7)将吸附柱CB2放入一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量预热的纯水，室温放置2min。12,000rpm离心2min，收集DNA溶液；将收集DNA溶液滴加在吸附膜中上，室温放置2min；12,000rpm离心2min，再次收集DNA溶液以提高DNA的回收量。

4.结果分析：使用1％琼脂糖凝胶电泳对最后一轮的PCR产物进行检测(见图3)，并对大小在300bp-400bp处有阳性片段的PCR产物进行胶回收。纯化的DNA片段浓度使用Nanodrop测定其浓度。

(六)重链基因连接载体

1.将目的片段与克隆载体Topo连接：

25℃反应10min。

2.连接产物转化感受态细胞DH5α

(1)在冰浴上融化感受态细胞(100μl)，加入连接产物(10μl)，轻轻混匀，冰上静置30min。

(2)放入温度为42℃的水浴中热激45s，迅速转移至冰浴中，静置2min。

(3)向离心管中加入500μl不含抗生素的无菌培养基LB，混匀后在温度为37℃、转速为200转的摇床中复苏1小时。

(4)将复苏的菌液均匀涂布到含氨苄霉素的LB培养基上，待菌液吸收后，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

3.接种

挑取上述LB平板中生长的单个菌落，加入至3ml氨苄抗性的液体LB培养基中，在温度为37℃转速为220rmp的摇床中培养6h-7h。每个平板挑取3个菌落。

4.阳性克隆的鉴定

将菌液送生物技术公司进行测序鉴定。

5.抗体重链基因序列基因特征分析

181个重链可变区分别来自6个不同的胚系基因IGHV1-2、IGHV1-69、IGHV3-11、IGHV3-15、IGHV4-38和IGHV4-59，其中IGHV1-2占的比例最高，为63.9％，其次为IGHV1-69，比例为32.2％；且来自同一胚系基因的序列同源性很高，为98％-99％。与胚系基因相比，重链可变区的突变频率在6.5％-32％之间，来自胚系基因IGHV1-2的重链可变区突变频率最高，为32.4％；来自IGHV3-11的重链可变区突变频率为22％；来自IGHV1-69、IGHV3-11、IGHV3-15、IGHV4-38和IGHV4-59的重链可变区突变频率较低，为6.5％-10％。(见图4)。此外，互补决定区(complementary determining region，CDR)CDR3 loop的长度分析显示，重链可变区有9aa、10aa、12aa、14aa或22aa的HCDR3。

6.抗体重链基因片段与表达载体连接和鉴定

(1)将连接有正确抗体重链基因片段的TOPO-H用限制性内切酶EcoR I和Nhe I双酶切，反应体系如下：

反应条件：37℃反应20min。

酶切结束后进行琼脂糖凝胶电泳和胶回收纯化，方法同上。

(2)根据可变区碱基数的不同，选择对应的表达载体进行连接，反应体系如下：

混匀上述反应液，25℃连接反应10min。

(3)将连接产物转化DH5α感受态细胞，经卡那霉素平板筛选，挑单克隆培养并送测序，方法同上。

(4)质粒小提

1)柱平衡：向吸附柱CP3中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，弃去收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2)取3ml培养过夜的菌液加入1.5ml离心管中，12000rpm离心1min，弃去上清；反复收集。

3)在留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1(确定已加入RNaseA)，使用移液器吹打混匀或涡旋振荡器震荡混匀菌液。

4)在离心管中加入250μl溶液P2，温和的上下翻转6次-8次，充分混匀和裂解菌液。

5)向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和的上下翻转6次-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀，12000rpm离心10min。

6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12000rpm/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

7)向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW(请先检查是否已经加入无水乙醇)，12000rpm/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管；重复操作步骤(7)。

8)将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm/min离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

9)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜中央滴加30μl预热的纯水，室温放置5min，12000rpm/min离心2min将质粒溶液收集到离心管中；重复操作步骤(9)。

(七)轻链基因连接表达载体

1.将轻链的表达载体CMVR-L用限制性内切酶EcoR I和Pvu II双酶切，反应体系如下：

反应条件：37℃反应20min。

酶切结束后进行琼脂糖凝胶电泳和胶回收纯化，方法同上。

2.将轻链的PCR胶回收产物与双酶切的表达载体进行同源重组，反应体系如下：

混匀上述反应液，50℃连接反应20min。

3.将连接产物转化DH5α感受态细胞，经卡那霉素平板筛选，挑单克隆培养并送测序，方法同上。

4.抗体重链基因序列基因特征分析

轻链可变区来自2个不同的胚系基因IGKV1-5*03和IGKV1-33*01，所占比例分别为95％和5％。胚系基因IGKV1-5*03、IGKV1-33*01来源的两种轻链可变区，突变频率分别为4％和21％(见图3)。此外，互补决定区(complementary determining region，CDR)CDR3loop的长度分析显示，LCDR3有5aa或8aa(见图4)。

(八)不同细胞系中的抗体表达

1.293T细胞系统的抗体表达

将成功配对的抗体重链和轻链基因表达载体瞬时转染293T细胞：

(1)转染前24h在12孔板中，每孔铺4×10⁵个293T细胞。

(2)转染当天观察细胞的汇合程度，以70％-80％为宜。

(3)各取1μg无内毒素质粒DNA用50μl Opti-MEM培养基稀释。

(4)取6μl2000Reagent用50μl Opti-MEM培养基稀释稀释。

(5)将以上DNA和2000以1:1体积混合，室温孵育5min。

(6)取100μl混合液轻轻加入293T细胞中，5％CO₂ 37℃培养。

(7)48h后，收集细胞和上清，12,000rmp离心2min，收集上清，在-20℃保存。取1ml预冷的PBS加入离心管中，吹打混匀细胞沉淀，12,000rmp离心2min，弃上清，洗涤两次。加入100μl细胞裂解液，冰浴10min，12,000rmp离心5min，收获上清。将细胞培养上清及裂解沉淀后收获的上清分别进行SDS-PAGE、Western-Blot检测(见图5A)。

2.CHO-S细胞系统的抗体表达

(1)将阳性克隆且配对的重链和轻链用去内毒素的大提试剂盒提取质粒，并用0.22μm针式过滤器进行过滤除菌。

(2)转染前24h将CHO-S细胞以5×10⁵cells/ml传代，120rmp-135rpm 37℃(125ml摇瓶),8％CO2培养。

(3)转染当天，细胞浓度约为1.2×10⁶-1.5×10⁶个/ml，将细胞稀释到1×10⁶cells/ml，细胞存活率≥95％，以保证转染效率；在125ml摇瓶中加30ml细胞。

(4)轻轻颠倒混匀FreeStyle^TMMAX转染试剂。

(5)将37.5μg无内毒素且无菌的质粒DNA(重量和轻链摩尔比1：1)用0.6mlOptiPro^TMSFM稀释并混匀；在另一支管中，用0.6ml OptiPro^TMSFM稀释37.5μlFreeStyle^TMMAX转染试剂，轻轻颠倒混匀；立即将稀释的FreeStyle^TMMAX加入稀释的DNA溶液中，轻轻混匀。

(6)DNA-FreeStyle^TMMAX混合液在室温孵育10min以形成复合物。

(7)将此1.2ml DNA-FreeStyle^TMMAX混合液加入125ml装有30ml细胞的摇瓶中，手动慢慢旋转瓶子以混匀。

(8)将转染的细胞在37℃、8％CO₂、135rpm的条件下培养6天-7天后，3000rmp20min离心收上清。

3.293F细胞系统的抗体表达

(1)转染前一天，将处在对数生长期且活率高于90％的293F细胞以2×10⁶个/ml的密度接种到新鲜培养基中,置于37℃，5％CO2，150rmp-175rpm转速的恒温摇床中培养(125ml摇瓶)。

(2)转染当天，取样计数细胞密度和活率。细胞密度应该3×10⁶-5×10⁶个/ml，活率高于90％。调整细胞密度至3×10⁶cells/ml，每瓶细胞液体积为30ml。

(3)转染液的配制：用150mM的NaCl溶液稀释30μg DNA(重量和轻链摩尔比1：1)至总体积为0.75ml，温和混匀；用150mM的NaCl稀释100μl Sinofection转染试剂至总体积为0.75ml，温和混匀；将稀释好的DNA和转染试剂同时单独静置约5分钟后温和混匀，总体积1.5ml，之后室温静置10分钟。

(4)将转染液逐滴加入到细胞培养液中，滴加的同时轻轻摇动培养瓶，摇匀后放回摇床继续培养。

(5)在转染后第24小时加入1％-5％SMS 293-SUPI加料液，此后每隔48小时添加一次加料液(1％-5％)，根据不同蛋白的表达特性最长可以在转染后6天-10天收样。

(九)抗体纯化

1.亲和层析纯化抗体

(1)Buffer的准备：所用水和Buffer用0.45μm滤膜过滤，结合/洗杂Buffer(0.15MNaCl，20mMNa₂HPO₄，pH7.0)，洗脱Buffer(0.1M甘氨酸，pH3.0)，中和液(1M Tris-HCl，pH8.5)。

(2)样品准备：细胞上清用0.45μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

(3)样品纯化

1)将rProtein A Beads与细胞上清混合，在摇床上缓慢摇动孵育2h。

2)在层析柱中装入适量rProtein A Beads，层析用5倍柱体积的结合Buffer进行平衡。

3)将孵育好的细胞上清加到平衡好的rProtein A Beads中，收集流出液；将流出液加回层析柱中，收集流出液。

4)用10倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白。

5)使用10倍柱体积的洗脱Buffer，收集洗脱液，即目的蛋白组分。

6)依次使用3倍柱体积的结合Buffer和5倍柱体积的去离子水平衡填料，最后再用5倍柱体积的20％的乙醇平衡，然后保存在等体积的20％的乙醇中，置于4℃保存。

7)使用BCA法对纯化抗体进行蛋白定量。定量结果显示，纯化抗体的浓度为0.1mg/ml-0.5mg/ml。

2.结果分析：SDS-PAGE显示，亲和层析后的蛋白纯度较高，提示该目标抗体可用于体外活性分析(见图5B)。

(十)单克隆抗体的特异性结合分析

1.ELISA检测单克隆抗体与HIV特异性抗原的结合能力

(1)抗原包被：用磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)将抗原(HIV-1gp140单体(CRF_07BC)或HIV-1gp140三聚体(YU2和AE1))稀释为1μg/ml，加入酶标板中，100μl/孔，37℃孵育2h。

(2)洗涤：用PBST(PBS+0.5‰吐温-20)洗涤3次。

(3)封闭：加入100μl封闭液(PBST+5％BSA)，4℃封闭过夜。

(4)洗涤：PBST洗涤3次。

(5)在稀释板上用封闭液将抗体系列2倍稀释(起始浓度为10μg/ml)，按每孔100μl加到已包被的96孔板中，37℃孵育2h。

(6)PBST洗涤5次。

(7)酶标二抗用封闭液稀释(1:20000)，每孔加100μl，37℃孵育1h。

(8)PBST洗涤5次。

(9)显色液A、B液按1:1混合后，每孔加100μl，在室温于暗处放置5-10min。

(10)加50μl终止液终止反应。

(11)用酶标仪450nm处读数。

(12)绘制抗体浓度-吸光度曲线。

2.结果分析：8个待测抗体中，7D5与三个不同亚型抗原的结合能力最强，其次为7F7和8H5,而53、8A4、8E5、8F10和8H4与HIV-1特异性抗原的结合活性相对较弱。与对照抗体VRC01相比，7D5与B亚型抗原YU2 gp140三聚体和CRF_07BC gp140单体的结合活性较弱，但与AE亚型抗原的结合活性明显高于VRC01。此外，7F7对AE亚型抗原的结合能力也高于VRC01(见图6)。

(十一)单克隆抗体的中和活性分析

1.中和试验检测单克隆抗体的中和活性

(1)在96孔细胞培养板中，细胞对照(第1列)加150μl GM(DMEM+10％FBS+25mMHEPES+1％双抗)，其余各孔加100μl GM。

(2)3A-3H和8A-8H中加入抗体(即①号抗体加入3A-B，②号抗体加入3C-D，依次)，抗体初始浓度为20μg/ml，补加GM使总体积为150μl。

(3)充分混匀抗体，取50μl移入后一孔，依次3倍系列稀释。

(4)室温解冻HIV-1假病毒，用GM稀释至4000TCID₅₀/ml，取50μl(200TCID₅₀)加入2-12列。

(5)37℃孵育1h。

(6)消化TZM-bl细胞，用GM重悬，细胞浓度为1.3×10⁵个/ml，并加入DEAE-dextranhydrochloride(10mg/ml)是其浓度为25μg/ml。

(7)取100μl细胞悬液(即每1.3×10⁴个细胞)加到细胞板中，DEAE-dextranhydrochloride终浓度为10μg/ml。

(8)37℃5％CO2培养48h。

(9)读数：48h后弃去细胞培养液，用200μl PBS清洗一次，拍干；每孔加20μl LysisSolution，室温放置10min；用Reaction Buffer 1：50稀释反应底物，每孔加100μl，室温孵育40min；用酶标仪读板，setting——luminescence——96well costar)。

(10)计算抗体的50％抑制浓度(IC₅₀)：抑制率＝(V-T)/(V-C),T为待测样品，C为细胞对照，V为病毒对照；使用Graphpad Prism计算IC₅₀。

2.结果分析：8个待测抗体中7D5的中和活性最好，可中和B亚型的毒株和部分C亚型的毒株，对tier3的REJO4541.67也有部分中和活性。其余7个待测抗体53、7F7、8A4、8E5、8F10、8H4和8H5对四个亚型8个毒株的IC₅₀均大于20μg/ml(见表2)。

表2.抗体中和活性(IC₅₀,μg/ml)

实施例二：实施例1所得单克隆抗体7D5用于抑制HIV感染

1.病毒抑制实验

(1)细胞准备：TZM-bl细胞复苏后至少传代三次，细胞活率在90％以上。

(2)在96孔细胞板中，将50μl(200TCID₅₀)HIV(REJO4541.67)与100μl不同浓度的单抗7D5在37℃孵育1h。

(3)随即加入100μl浓度为1.3×10⁵个/ml的TZM-bl细胞，细胞悬液中已加入DEAE-dextran hydrochloride，其终浓度为10μg/ml。

(4)37℃5％CO2培养48h。

(5)读数：用酶标仪检测孔板内的荧光信号。

(6)计算抗体的病毒抑制活性：抑制率＝(V-T)/(V-C),T为待测样品，C为细胞对照，V为病毒对照。

2.结果分析：从结果可知，单抗7D5对病毒的抑制作用呈剂量依赖性，当抗体浓度为10μg/ml时，对病毒的抑制率达96％(见图7)。

序列表

1

抗HIV单克隆抗体7D5重链可变区的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4核苷酸编码序列：

CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGGTCAGATGAAGAAGCCTGGCGAGTCGATGAGAATTTCTTGTCGGGCTTCTGGATATGAATTTATTGATTGTACGCTAAATTGGATTCGTCTGGCCCCCGGAAAAAGGCCTGAGTGGATGGGATGGCTGAAGCCTCGGGGGGGGGCCGTCAACTACGCACGTCCACTTCAGGGCAGAGTGACCATGACTCGAGACGTTTATTCCGACACAGCCTTTTTGGAGCTGCGCTCGTTGACAGTAGACGACACGGCCGTCTACTTTTGTACTAGGGGAAAAAACTGTGATTACAATTGGGACTTCGAACACTGGGGCCGGGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCA

2

抗HIV单克隆抗体7D5轻链可变区的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4核苷酸编码序列：

GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCACTCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGATACCGTCACTATCACTTGCCAGGCAAACGGCTACTTAAATTGGTATCAACAGAGGCGAGGGAAAGCCCCAAAACTCCTGATCTACGATGGGTCCAAATTGGAAAGAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGAAGATGGGGGCAAGAATATAATCTGACCATCAACAATCTGCAGCCCGAAGACATTGCAACATATTTTTGTCAAGTGTATGAGTTTGTCGTCCCTGGGACCAAGCTGGAGATCAAA

3

抗HIV单克隆抗体7D5重链可变区的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4氨基酸编码序列：

QVQLVQSGGQMKKPGESMRISCRASGYEFIDCTLNWIRLAPGKRPEWMGWLKPRGGAVNYARPLQGRVTMTRDVYSDTAFLELRSLTVDDTAVYFCTRGKNCDYNWDFEHWGRGTTVTVSS

4

抗HIV单克隆抗体7D5轻链可变区的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4氨基酸编码序列：

EIVMTQSPLSLSASVGDTVTITCQANGYLNWYQQRRGKAPKLLIYDGSKLERGVPSRFSGRRWGQEYNLTINNLQPEDIATYFCQVYEFVVPGTKLEIK