阅读说明：本技术 一种利用长双歧杆菌制备发酵饲料的方法 (Method for preparing fermented feed by using bifidobacterium longum ) 是由 翟齐啸 陈卫 田丰伟 乔楠桢 于雷雷 赵建新 张灏 于 2020-05-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种利用长双歧杆菌制备发酵饲料的方法,属于生物技术领域以及发酵技术领域。本发明提供了一种以农作物为原料制备发酵饲料的方法,此方法通过将保藏编号为GDMCC No.60926的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)接种至含有农作物和/或农作物废弃物的发酵原料中进行发酵以得到发酵饲料；利用此方法制备得到的发酵饲料营养丰富、不易腐败且安全性很高,具体体现在：利用此方法制备得到发酵饲料中霉菌的含量仅有0.27×10<Sup>5</Sup>CFU/g,并且,于30℃下放置15d后,利用此方法制备得到发酵饲料中霉菌的含量为0。(The invention relates to a method for preparing fermented feed by utilizing bifidobacterium longum, belonging to the technical field of biology and fermentation. The invention provides a method for preparing fermented feed by using crops as raw materials, which comprises the steps of inoculating Bifidobacterium longum (Bifidobacterium longum) with the preservation number of GDMCC No.60926 into fermented raw materials containing the crops and/or crop wastes for fermentation to obtain the fermented feed; the fermented feed prepared by the method is nutritiousIs rich and not easy to decay, and has high safety, and the content of mould in the fermented feed prepared by the method is only 0.27 × 10 5 CFU/g, and after being placed at 30 ℃ for 15 days, the content of the mould in the fermented feed prepared by the method is 0.)

一种利用长双歧杆菌制备发酵饲料的方法

技术领域

本发明涉及一种利用长双歧杆菌制备发酵饲料的方法，属于生物技术领域以及发酵技术领域。

背景技术

我国是农业大国，但是，由于在农作物加工过程中，难以避免的会产生大量的废弃物，例如，生产苹果浓缩汁会产生苹果渣、生产蓝莓果汁会产生蓝莓果渣、生产桑葚果汁会产生桑葚果渣、生产葡萄果汁会产生葡萄渣等水果废弃物，生产山楂提取液会产生山楂果渣、生产淀粉会产生木薯渣、生产胡萝卜干会产生胡萝卜渣等蔬菜废弃物，以及生产大豆油会产生豆粕、生产麻油会产生芝麻粕、生产葵花籽油会产生葵花籽粕等油料作物废弃物等油料作物废弃物，因此，我国也是农作物废弃物排放大国。这些农作物废弃物的有效利用和处理问题也成为了考验我国农作物加工行业的一大难题。

目前，已经有人尝试通过将农作物废弃物制备成饲料以实现农作物废弃物的有效利用和处理问题。例如，吴正可等人通过混菌固态发酵将农作物废弃物制备成高蛋白发酵饲料(具体可见参考文献：吴正可，刘国华，李阳等.混菌固态发酵菜籽粕工艺优化[J].中国农业科学,2019,24:4603-4612)；郝森林等人通过无氧发酵将农作物废弃物制备成发酵果渣饲料(具体可见参考文献：郝森林，邹颖，余元善等.桑果渣营养成分分析及果渣饲料发酵工艺研究[J].蚕业科学,2019,4:563-568)；李北等人通过乳酸菌发酵将农作物废弃物制备成发酵饲料(具体可见参考文献：李北，李永恒，黄允升等.木薯渣生物发酵饲料开发设计[J].轻工科技,2019,11:30-31)。

但是，由于富含氨基酸等营养成分和水分，农作物废弃物很容易受到丝状真菌侵袭，而扩展青霉、黑曲霉、娄地青霉、指状青霉等丝状真菌(它们主要通过侵蚀农作物的叶片、果实等造成农作物腐败，进而引起农作物的贮藏病害，并且，它们会产生展青霉素和桔霉素等毒素，这些毒素会残留在农作物中，进而通过食物链进入人体，具有潜在的危害性)均是造成农作物腐败的元凶之一，因此，即使是经过杀菌，以农作物为原料制备得到的饲料在贮藏过程中也很容易腐败。

为解决这一问题，马青松等人尝试在以农作物为原料制备得到的饲料中添加防腐剂以延长其保质期(具体可见参考文献：马青松，王卫国.不同防霉剂对颗粒饲料储藏品质的影响[J].饲料工业,2019,40(9):38-44)，但是，大量添加防腐剂存在食品安全的问题，并且，化学添加剂具有成本高、回报低且不利于环保等诸多限制(具体可见参考文献：余峥嵘，吴银超，谢佳玉等.防霉剂脱氢醋酸钠致大鼠出血试验[J].动物医学进展,2018,39(1):73-78和参考文献：王雪洋，韩淑敏，李金库等.防霉剂在饲料中的应用[J].畜牧与饲料科学,2019,40(3):50-52)，而防腐剂添加量不够则会导致防腐效果差。

因此，急需找到一种安全性高且效果好的防止以农作物为原料制备得到的饲料腐败的方法。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种安全性高且效果好的防止以农作物为原料制备得到的饲料腐败的方法。

[技术方案]

本发明要解决的技术问题是提供一种利用长双歧杆菌制备发酵饲料的方法，所述方法为将长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)接种至含有农作物和/或农作物废弃物的发酵原料中进行发酵，得到发酵饲料；所述长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)的保藏编号为GDMCC No.60926。

在本发明的一种实施方式中，所述长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)以种子液的形式接种至发酵原料中；所述种子液的体积占发酵原料总体积的0.5～2％。

在本发明的一种实施方式中，所述长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)以种子液的形式接种至发酵原料中；所述种子液的体积占发酵原料总体积的1％。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵原料的含水量为55～65％。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵原料的含水量为60％。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为25～35℃、时间为2～5d。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为30℃、时间为3d。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵过程保持厌氧。

在本发明的一种实施方式中，所述农作物为水果、蔬菜、油料作物和/或粮食作物；所述农作物废弃物为水果废弃物、蔬菜废弃物、油料作物废弃物和/或粮食作物废弃物。

在本发明的一种实施方式中，所述水果废弃物为苹果渣、蓝莓果渣、桑葚果渣和/或葡萄渣；所述蔬菜废弃物为胡萝卜渣、木薯渣和/或山楂果渣；所述油料作物废弃物为豆粕、棉籽粕、花生粕、芝麻粕、葵花籽粕和/或菜籽粕。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为将长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)接种至由苹果渣、豆粕和水组成的发酵原料中进行发酵，得到发酵饲料；所述发酵原料中，苹果渣和豆粕质量比为16～20:1～6。

在本发明的一种实施方式中，所述苹果渣和豆粕的质量比为18:1。

在本发明的一种实施方式中，所述苹果渣的粒径为250μm。

在本发明的一种实施方式中，所述豆粕的粒径为250μm。

本发明还提供了上述方法制备得到的发酵饲料。

本发明还提供了上述方法在制备发酵饲料中的应用。

[有益效果]

本发明提供了一种以农作物为原料制备发酵饲料的方法，此方法通过将保藏编号为GDMCC No.60926的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)接种至含有农作物和/或农作物废弃物的发酵原料中进行发酵以得到发酵饲料；利用此方法制备得到的发酵饲料营养丰富、不易腐败且安全性很高，具体体现在：

(1)利用此方法制备得到发酵饲料中，粗蛋白的含量高达23.45％、粗纤维的含量低至28.33％、粗脂肪的含量高达10.74％、总氨基酸的含量高达6.19％；

(2)利用此方法制备得到发酵饲料中霉菌的含量仅有0.27×10⁵CFU/g，并且，于30℃下放置15d后，利用此方法制备得到发酵饲料中霉菌的含量为0；

(3)此方法所使用的发酵菌株为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，而长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)是益生菌的一种，目前已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，不会给人体带来任何潜在的安全隐患。

生物材料保藏

一株长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109，所述长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109已于2019年12月09日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60926，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

附图说明

图1：不同浓度长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液对扩展青霉菌丝体生长的影响。

图2：不同浓度长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液对展青霉素合成量的影响。

图3：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液对扩展青霉patA～F基因表达的影响

图4：经不同方式处理后的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液对扩展青霉菌丝体生长的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的扩展青霉购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，产品编号为CICC40658；下述实施例中涉及的黑曲霉购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，产品编号为CICC2089；下述实施例中涉及的娄地青霉购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，产品编号为CICC 40663；下述实施例中涉及的指状青霉购自北纳生物，产品编号为BNCC336887；下述实施例中涉及的苹果渣购自陕西省眉县恒兴果汁有限公司；下述实施例中涉及的豆粕购自福建省华龙饲料有限公司。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

含水量检测方法：采用烘箱干燥法测定，将样品放在105℃烘箱中烘至恒重，样品的失重即代表水分质量。

粗蛋白检测方法：采用凯氏定氮法测定样品中粗蛋白含量。

粗纤维检测方法：采用国家标准GB/T 6434-2006《饲料中粗纤维的测定-过滤法》。

粗脂肪检测方法：采用国家标准GB/T 6433-2006《饲料中粗脂肪的测定》。

总氨基酸检测方法：采用高效液相色谱法(HPLC)测定样品中总氨基酸含量。

pH检测方法：采用pH计测量。

有机酸检测方法：采用高效液相色谱法(参考文献：候霞霞.青贮用优良乳酸菌的筛选及苹果渣发酵试验研究[D].西北农林科技大学,2014。

霉菌含量检测方法：采用PDA平板稀释培养法(参考文献：候霞霞.青贮用优良乳酸菌的筛选及苹果渣发酵试验研究[D].西北农林科技大学,2014)。

下述实施例中涉及的培养基如下：

mMRS固体培养基：在1L蒸馏水中加入10g蛋白胨、10g牛肉膏、20g葡萄糖、5g酵母浸膏、2g无水乙酸钠、0.25g一水硫酸锰、1mL吐温80、2.6g三水合磷酸氢二钾、0.5g七水硫酸镁、2g柠檬酸二铵、1g半胱氨酸盐酸盐、18g琼脂粉，pH6.2～6.5。

mMRS液体培养基：在1L蒸馏水中加入10g蛋白胨、10g牛肉膏、20g葡萄糖、5g酵母浸膏、2g无水乙酸钠、0.25g一水硫酸锰、1mL吐温80、2.6g三水合磷酸氢二钾、0.5g七水硫酸镁、2g柠檬酸二铵、1g半胱氨酸盐酸盐，pH6.2～6.5。

PDA培养基：在1L马铃薯汁中加入20g葡萄糖和18g琼脂，自然pH。

实施例1：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)的筛选、鉴定、培养和观察

1、筛选

取1g来源于无锡地区的健康成年人粪便样本，用生理盐水梯度稀释后涂布于mMRS固体培养基上，置于37℃厌氧环境中培养72h，观察并记录菌落形态；挑取菌落在mMRS固体培养基上划线，于37℃厌氧环境下进行纯化培养，获得纯化后的单菌落；挑取单菌落在mMRS固体培养基上划线，37℃厌氧培养48h，对所得菌落进行革兰氏染色(革兰氏染色方法参考教科书《工业微生物育种学》作者：诸葛健著)，记录菌落形态，并根据教科书《常见细菌系统鉴定手册》(作者：东秀珠)考察菌株的生理生化特性，保留革兰氏阳性、菌落呈光滑圆形、过氧化氢阴性的菌株，此菌株的其余生理生化特性为：能利用D-核糖、L-阿拉伯糖、乳糖、纤维二糖、低聚果糖、山梨醇、淀粉、葡萄糖、甘露糖、木糖、麦芽糖、海藻糖；硝酸盐还原、接触酶、精氨酸水解实验、吲哚实验均为阴性。

2、初步鉴定

挑取步骤1筛选得到的菌株的单菌落接种至mMRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到菌液；将菌液8000rpm离心2min，收集沉淀；将沉淀用含0.05％半胱氨酸盐酸盐(m/m)的磷酸盐缓冲液(pH6.5、浓度0.05M)洗涤两次后8000rpm离心2min，收集菌体；取0.2mg菌体重悬于200μL含0.05％半胱氨酸盐酸盐(m/m)和0.25％TritonX-100(m/m)的磷酸盐缓冲液(pH6.5、浓度0.05M)中，得到重悬液；在将重悬液中添加50μL混合液(由浓度为6mg/mL氟化钠和10mg/mL碘乙酸钠混合而得)以及50μL浓度为80mg/mL的果糖-6-磷酸后37℃孵育1h，得到孵育液；在孵育液中添加300μL浓度为0.139g/mL的盐酸羟胺(pH6.5)后室温(25℃)放置10min，得到待测液；在待测液中分别添加200μL浓度为15％(m/m)的三氯乙酸溶液和200μL浓度为4M的HCL溶液，得到反应体系1～2；在反应体系1～2中添加200μL浓度为5％(m/m)的三氯乙酸溶液和200μL浓度为0.1M的HCL溶液，添加后，反应体系1～2迅速变为红色，说明步骤1筛选得到的菌株为F6PPK阳性，初步断定为双歧杆菌。

3、进一步鉴定

挑取步骤1筛选得到的菌株的单菌落接种至mMRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到菌液；取1mL于1.5mL离心管中，10000rpm离心2min，收集沉淀；将沉淀用无菌水洗涤一次后10000rpm离心2min，收集菌体；取0.2mg菌体重悬于500μL无菌水中，用于细菌16SrDNA PCR反应；提取步骤1筛选得到的菌株的基因组，将菌株的18SrDNA进行扩增和测序(扩增得到的16SrDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，将获得的序列在GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为长双歧杆菌，命名为长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)CCFM1109；

其中，PCR反应体系：10×Taq buffer，5μL；dNTP，5μL；27F，0.5μL；1492R，0.5μL；Taq酶，0.5μL；模版，0.5μL；ddH2O，38μL；

PCR反应条件：95℃，5min；95℃，10s；55℃，30s；72℃，30s；step2-4，30×；72℃，5min；12℃，2min；

PCR所用引物：F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO.2)；R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO.3)。

4、培养和观察

挑取步骤1筛选得到的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109的单菌落接种至mMRS固体培养基上，37℃培养48h，48h后，观察长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)CCFM1109在mMRS固体培养基上的菌落特征。

观察可得，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109在mMRS固体培养基上的菌落直径范围0.5～2mm，正面形态圆形，侧面形态呈突起状，边缘整齐，乳白色，不透明，表面湿润光滑，无色素产生。

挑取步骤1筛选得到的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109的单菌落接种至mMRS液体培养基中，37℃培养48h，48h后，通过电镜观察长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109的菌体特征。

观察可得，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)不形成孢子，不运动，菌体呈杆状，稍弯曲，多数呈V型，少数呈Y型，两端着色深。

挑取步骤1筛选得到的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109的单菌落接种至mMRS液体培养基中，37℃培养，培养过程中，每隔4h检测菌液的OD₆₀₀，通过OD₆₀₀绘制长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109的生长曲线。

由生长曲线可知，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109生长24h时达到对数生长末期。

实施例2：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109及其发酵上清液对丝状真菌孢子萌发率的影响

1、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109对丝状真菌孢子萌发率的影响(双层平板-生长抑制法)

挑取实施例1筛选得到的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109的单菌落在mMRS固体培养基上划线，厌氧环境下37℃培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于mMRS液体培养基中，厌氧环境下37℃培养48h进行培养，重复此操作3次，得到培养至第三代的菌液。

用接种环蘸取安瓿管中的扩展青霉菌液接种到PDA培养基上，28℃、200rpm培养7d，得到菌丝体及孢子；挑取孢子接种于PDA斜面上，28℃、200rpm培养7d，重复此操作2次，得到培养至第三代的扩展青霉；在生长有培养至第三代的扩展青霉的PDA培养基中加入5mL无菌水，用接种环刮取孢子，再用4层无菌纱布过滤得到扩展青霉孢子悬液；将扩展青霉孢子悬液用无菌水稀释至浓度为1×10⁴cfu/mL。

用接种环蘸取菌悬液mMRS固体培养基上划两条两厘米的平行线，37℃培养48h后，mMRS固体培养基上添加8mL浓度为1×10⁴cfu/mL的扩展青霉孢子悬液，28℃分别培养2d、7d后，观察抑制区域(即mMRS固体培养基上的划线区域)，以抑制区域的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109菌落及菌落周围无孢子萌发的面积占mMRS固体培养基总面积的百分比作为指标，检测长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109对扩展青霉孢子萌发率的抑制能力，检测结果见表1。

参照同样的方法分别检测长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109对黑曲霉、娄地青霉和指状青霉孢子萌发率的抑制能力，检测结果见表1。

由表1可知，检测长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109对扩展青霉、黑曲霉、娄地青霉和指状青霉孢子萌发率的抑制能力时，抑制区域的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109菌落及菌落周围不小于mMRS固体培养基70％面积的区域均无孢子萌发，可见，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109对扩展青霉、黑曲霉、娄地青霉和指状青霉孢子萌发率的抑制能力较强。

表1长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109对不同丝状真菌孢子萌发率的抑制能力

注：双歧杆菌菌落及菌落周围不小于平板30％面积的区域均无孢子萌发，+++；双歧杆菌菌落区域及菌落周围低于30％平板面积的区域无孢子萌发，++；仅双歧杆菌菌落区域无孢子萌发，+；无孢子萌发抑制区域，-。

2、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液对丝状真菌孢子萌发率的影响(96孔板-孢子萌发抑制法)

挑取实施例1筛选得到的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109的单菌落在mMRS固体培养基上划线，厌氧环境下37℃培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于mMRS液体培养基中，厌氧环境下37℃培养48h进行培养，得到种子液；将种子液以2％(v/v)的接种量接种至mMRS液体培养基中，厌氧环境下37℃培养48h进行培养，重复此操作2次，获得发酵液；将发酵液8000rpm离心10min后通过0.2μm滤器过滤，获得发酵上清液。

用接种环蘸取安瓿管中的扩展青霉菌液接种到PDA培养基上，28℃、200rpm培养7d，得到菌丝体及孢子；挑取孢子接种于PDA斜面上，28℃、200rpm培养7d，重复此操作2次，得到培养至第三代的扩展青霉；在生长有培养至第三代的扩展青霉的PDA培养基中加入5mL无菌水，用接种环刮取孢子，再用4层无菌纱布过滤得到扩展青霉孢子悬液；将扩展青霉孢子悬液用无菌水稀释至浓度为1×10⁴cfu/mL。

在无菌96孔板中加入190μL发酵上清液以及10μL浓度为1×10⁴cfu/mL的扩展青霉孢子悬液，28℃培养48h，得到培养液；以mMRS液体培养基作为对照，通过测量培养液和mMRS液体培养基的OD₅₈₀，计算长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液对扩展青霉的孢子萌发抑制率，计算结果见表2；其中，孢子萌发抑制率(％)＝(1-(△OD发酵上清液-△ODmMRS)/△ODmMRS)×100％。

参照同样的方法分别检测长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液对黑曲霉、娄地青霉和指状青霉的孢子萌发抑制率，检测结果见表2。

由表2可知，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液对扩展青霉、黑曲霉、娄地青霉和指状青霉的孢子萌发抑制率分别可高达98.38±0.37％、90.23±0.67％、92.65±1.27％、96.34±0.53％，可见，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液对扩展青霉、黑曲霉、娄地青霉和指状青霉孢子萌发率的抑制能力较强。

表2长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109对不同丝状真菌孢子萌发的抑制能力

实施例3：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液对丝状真菌菌丝体生长的影响

将mMRS液体培养基分别以1:9、1.5:8.5、2:8、2.5:7.5、3:7(mMRS液体培养基：PDA培养基)的体积比与PDA培养基混合，得到mMRS液体培养基浓度分别为10、15、20、25、30％(v/v)的对照组混合液；将实施例2获得的发酵上清液分别以1:9、1.5:8.5、2:8、2.5:7.5、3:7(发酵上清液：PDA培养基)的体积比与PDA培养基混合，得到发酵上清液浓度分别为10、15、20、25、30％(v/v)的实验组混合液；将对照组和实验组的混合液分别倾倒平板；在平板中央滴加10μL实施例2获得的扩展青霉孢子悬液，28℃培养6d，培养期间，通过每2d测量每一个平板上的菌丝体直径，检测长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液对扩展青霉菌丝体生长的影响，检测结果见图1。

如图1所示，通过测量培养第6d时平板上的菌丝体直径可知，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液对扩展青霉菌丝体生长的抑制能力随着发酵上清液的浓度升高而增大，在长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液达到20％时，可达到完全抑制(即抑制率达100％)；而mMRS液体培养基的浓度变化对扩展青霉的生长呈促进作用。

实施例4：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液对扩展青霉产展青霉素产量的影响

将mMRS液体培养基分别以1:9、1.5:8.5、2:8、2.5:7.5、3:7(mMRS液体培养基：PDA培养基)的体积比与PDA培养基混合，得到mMRS液体培养基浓度分别为10、15、20、25、30％(v/v)的对照组混合液；将实施例2获得的发酵上清液分别以1:9、1.5:8.5、2:8、2.5:7.5、3:7(发酵上清液：PDA培养基)的体积比与PDA培养基混合，得到发酵上清液浓度分别为10、15、20、25、30％(v/v)的实验组混合液；将对照组和实验组的混合液分别倾倒平板；在平板中央滴加10μL实施例2获得的扩展青霉孢子悬液，28℃培养6d，6d后，在平板上添加5mL酸化水(pH4.0)后静置1d，1d后，刮取平板上的扩展青霉孢子及菌丝体；将孢子及菌丝体离心过滤，取上清液，将上清液经0.22μm滤膜过滤后高效液相色谱上样，将结果与商业展青霉素标准品(购自普瑞邦公司)进行比较以定量，通过上清液中展青霉素的含量，检测长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液对扩展青霉产展青霉素产量的影响，检测结果见图2；其中，高效液相色谱条件为：色谱柱：Waters4.6*250mmC₁₈色谱柱；柱温：30℃；流动相：10％乙腈，90％水；流速：1mL/min；进样量：10μL；检测器：UV；检测波长：276nm。

如图2所示，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液对扩展青霉产展青霉素产量的抑制能力随着发酵上清液的浓度升高而增大，在长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液达到20％时，可达到完全抑制(即抑制率达100％)；而mMRS液体培养基浓度的增加反而促进展青霉素产量。

实施例5：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液对扩展青霉PatA～F基因表达量的影响

将mMRS液体培养基以1.5:8.5(mMRS液体培养基：PDA培养基)的体积比与PDA培养基混合，得到mMRS液体培养基浓度为15％(v/v)的对照组混合液；将实施例2获得的发酵上清液以1.5:8.5(发酵上清液：PDA培养基)的体积比与PDA培养基混合，得到发酵上清液浓度为15％(v/v)的实验组混合液；将对照组和实验组的混合液分别倾倒平板；在平板中央滴加10μL实施例2获得的扩展青霉孢子悬液，28℃培养6d，6d后，刮取平板上的扩展青霉孢子及菌丝体，液氮速冻，保存于-80℃；将扩展青霉孢子及菌丝体液氮研磨后采用Trizol法提取总RNA，并以β-tubulin基因为内参进行qRT-PCR以评价长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)CCFM1109发酵上清液对扩展青霉PatA～F基因(PatA～F基因为调控扩展青霉合成次级代谢产物展青霉素的基因)相对表达量的影响，检测结果见图3；其中，数据采用2^-ΔΔCT法进行定量计算。

如图3所示，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液可显著降低扩展青霉PatK，PatM，PatN基因的相对表达量，使得扩展青霉PatK、PatM、PatN基因的相对表达量分别降低为接种至不含此长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液的培养基上进行培养的扩展青霉的0.11、0.16、0.19倍。

实施例6：温度对长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液抑制扩展青霉菌丝体生长的能力的影响

将实施例2获得的发酵上清液以1.5:8.5(发酵上清液：PDA培养基)的体积比与PDA培养基混合，得到发酵上清液浓度为15％(v/v)的的对照组混合液；将实施例2获得的发酵上清液121℃加热20min后以1.5:8.5(发酵上清液：PDA培养基)的体积比与PDA培养基混合，得到发酵上清液浓度为15％(v/v)的实验组混合液；将对照组和实验组的混合液分别倾倒平板；在平板中央滴加10μL实施例2获得的扩展青霉孢子悬液，28℃培养6d，培养期间，通过每2d测量每一个平板上的菌丝体直径，检测长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液对扩展青霉菌丝体生长的影响，检测结果见图4。

如图4所示，通过测量培养第6d时平板上的菌丝体直径可知，经加热处理后，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液(菌丝体生长直径为5.3mm)对扩展青霉菌丝体生长的抑制能力较未经加热处理的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液(菌丝体生长直径为5.7mm)无显著变化。

实施例7：pH对长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液抑制扩展青霉菌丝体生长的能力的影响

将实施例2获得的发酵上清液(pH为3.56)以1.5:8.5(发酵上清液：PDA培养基)的体积比与PDA培养基混合，得到发酵上清液浓度为15％(v/v)的的对照组混合液；将实施例2获得的发酵上清液调节至pH为7后(用1mol/L的NaOH和1mol/L的HCl调节)以1.5:8.5(发酵上清液：PDA培养基)的体积比与PDA培养基混合，得到发酵上清液浓度为15％(v/v)的实验组混合液；将对照组和实验组的混合液分别倾倒平板；在平板中央滴加10μL实施例2获得的扩展青霉孢子悬液，28℃培养6d，培养期间，通过每2d测量每一个平板上的菌丝体直径，检测pH对长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液抑制扩展青霉菌丝体生长的能力的影响，检测结果见图4。

如图4所示，通过测量培养第6d时平板上的菌丝体直径可知，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液的pH为3.56，此时，其对扩展青霉菌丝体生长的抑制能力较强(菌丝体生长直径为5.7mm)；pH为7时，长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)CCFM1109发酵上清液对扩展青霉菌丝体生长的抑制能力与未经pH调节的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液相比显著降低(菌丝体生长直径为15.7mm)。

实施例8：蛋白酶处理对长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液抑制扩展青霉菌丝体生长的能力的影响

先将实施例2获得的发酵上清液调节至pH为7(用1mol/L的NaOH和1mol/L的HCl调节)，然后在发酵上清液中添加1mg/mL蛋白酶(购自SIGMA公司，产品编号为P3910)，37℃水浴2h，接着将发酵上清液100℃煮沸灭酶3min，得到经蛋白酶处理的发酵上清液；将实施例2获得的发酵上清液以1.5:8.5(发酵上清液：PDA培养基)的体积比与PDA培养基混合，得到发酵上清液浓度为15％(v/v)的的对照组混合液；以1.5:8.5(发酵上清液：PDA培养基)的体积比与PDA培养基混合，得到发酵上清液浓度为15％(v/v)的实验组混合液；将对照组和实验组的混合液分别倾倒平板；在平板中央滴加10μL实施例2获得的扩展青霉孢子悬液，28℃培养6d，培养期间，通过每2d测量每一个平板上的菌丝体直径，检测蛋白酶处理对长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液抑制扩展青霉菌丝体生长的能力的影响，检测结果见图4。

如图4所示，通过测量培养第6d时平板上的菌丝体直径可知，经蛋白酶处理后，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109发酵上清液(菌丝体生长直径为5.0mm)对扩展青霉菌丝体生长的抑制能力较未经蛋白酶处理的长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)CCFM1109发酵上清液(菌丝体生长直径为5.7mm)略有提高。

实施例9：发酵饲料的制备(以苹果渣和豆粕为原料)

方案一：

具体步骤如下：

(1)挑取实施例1的步骤1筛选得到的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109的单菌落接种至mMRS液体培养基中，37℃培养48h，得到一级种子液；将一级种子液以2％(v/v)的接种量接种至mMRS液体培养基中，37℃培养48h，得到二级种子液；将二级种子液以2％(v/v)的接种量接种至含有mMRS液体培养基的种子罐中，37℃培养48h，得到三级种子液；将三级种子液以2％(v/v)的接种量接种至含有mMRS液体培养基的发酵罐中，37℃扩大培养48h，得到发酵液(整个发酵液的获得过程均需保证无菌操作，避免杂菌污染)；

(2)控制苹果渣与豆粕粉的粒径均为250μm(通过粉碎和过筛控制粒径)，将苹果渣和豆粕粉按照质量比18:1混合，并通过加水控制最终发酵原料的含水量在60％；先将发酵原料装入具有单向排气阀的发酵袋(购自温州新吉高包装有限公司)中，然后将发酵液以1％(v/v)的接种量接种至发酵原料中，使得发酵原料中长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)CCFM1109的活菌数大于10⁹CFU/g，再将具有单向排气阀的发酵袋密封，得到发酵体系；将发酵体系于30℃下发酵3d，得到发酵饲料A(苹果渣与豆粕粉均进行过高温瞬时杀菌，整个发酵饲料的获得过程均需保证无菌操作，避免杂菌污染)。

方案二：

具体步骤如下：

在方案一的基础上，将长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109分别替换为长双歧杆菌CGMCC No.15032(记载于参考文献：陈卫，张秋香，应聪萍等.一株双歧杆菌及其应用，201711444295.1[P].2017-12-27)或长双歧杆菌CGMCC No.4900(记载于参考文献：刘佳明.一株长双歧杆菌，20110188038.2[P].2011-06-25)，得到发酵饲料B、C。

以于30℃下放置3d后的发酵原料作为空白对照，检测发酵饲料A～C中粗蛋白、粗纤维、粗脂肪和总氨基酸的含量(检测结果见表3)。

以于30℃下放置3d后的发酵原料作为空白对照，检测发酵饲料A～C的pH值，并且检测发酵饲料A～C中乳酸和乙酸的含量(检测结果见表4)。

以于30℃下放置0～15d后的发酵原料作为空白对照，检测发酵饲料A～C中的霉菌数(检测结果见表5)。

由表3可知，发酵饲料A中粗蛋白的含量高达23.45％、粗纤维的含量低至28.33％、粗脂肪的含量高达10.74％、总氨基酸的含量高达6.19％，营养丰富。

由表5可知，发酵饲料A中霉菌的含量仅有0.27×10⁵CFU/g，并且，于30℃下放置15d后，发酵饲料A中霉菌的含量为0，而此发酵饲料B～C无此效果。说明，发酵饲料A更不易滋生丝状真菌不仅是由于乳酸菌产酸，而是由于长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM1109本身可抑制丝状真菌。

表3发酵饲料A～C中粗蛋白、粗纤维、粗脂肪和总氨基酸的含量

组别	粗蛋白/％	粗纤维/％	粗脂肪/％	总氨基酸/％
					空白对照	13.62	42.64	9.53	5.85
发酵饲料A	23.45	28.33	10.74	6.19
					发酵饲料B	20.12	29.98	9.45	5.17
发酵饲料C	21.92	32.11	9.14	5.74

表4发酵饲料A～C的pH值以及乳酸和乙酸的含量

组别	pH	乳酸(g/kgDM)	乙酸(g/kgDM)
				空白对照	4.21	0.23	0.42
发酵饲料A	3.86	1.32	0.79
				发酵饲料B	3.97	1.28	0.64
发酵饲料C	4.01	1.15	0.69

表5发酵饲料A～C中霉菌数的变化(10⁵CFU/g)

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种利用长双歧杆菌制备发酵饲料的方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1389

<212> DNA

<213> 长双歧杆菌

<400> 1

gctcatccca caaggggtta ggccaccggc ttcgggtgct gcccactttc atgacttgac 60

gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgcat tcaccgcgac gttgctgatt cgcgattact 120

agcgactccg ccttcacgca gtcgagttgc agactgcgat ccgaactgag accggttttc 180

agggatccgc tccgcgtcgc cgcgtcgcat cccgttgtac cggccattgt agcatgcgtg 240

aagccctgga cgtaaggggc atgatgatct gacgtcatcc ccaccttcct ccgagttaac 300

cccggcggtc ccccgtgagt tcccggcata atccgctggc aacacggggc gagggttgcg 360

ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacgacc atgcaccacc 420

tgtgaacccg ccccgaaggg aagccgtatc tctacgaccg tcgggaacat gtcaagccca 480

ggtaaggttc ttcgcgttgc atcgaattaa tccgcatgct ccgccgcttg tgcgggcccc 540

cgtcaatttc tttgagtttt agccttgcgg ccgtactccc caggcgggat gcttaacgcg 600

ttagctccga cacggaaccc gtggaacggg ccccacatcc agcatccacc gtttacggcg 660

tggactacca gggtatctaa tcctgttcgc tccccacgct ttcgctcctc agcgtcagta 720

acggcccaga gacctgcctt cgccattggt gttcttcccg atatctacac attccaccgt 780

tacaccggga attccagtct cccctaccgc actcaagccc gcccgtaccc ggcgcggatc 840

caccgttaag cgatggactt tcacaccgga cgcgacgaac cgcctacgag ccctttacgc 900

ccaataattc cggataacgc ttgcacccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta 960

gccggtgctt attcaacggg taaactcact ctcgcttgct ccccgataaa agaggtttac 1020

aacccgaagg cctccatccc tcacgcggcg tcgctgcatc aggcttgcgc ccattgtgca 1080

atattcccca ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgta tctcagtccc aatgtggccg 1140

gtcgccctct caggccggct acccgtcgaa gccacggtgg gccgttaccc cgccgtcaag 1200

ctgataggac gcgaccccat cccataccgc gaaagctttc ccagaagacc atgcgatcaa 1260

ctggagcatc cggcattacc acccgtttcc aggagctatt ccggtgtatg gggcaggtcg 1320

gtcacgcatt actcacccgt tcgccactct caccaccaag caaagcctga tggatcccgt 1380

cgactgcat 1389

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tacggctacc ttgttacgac tt 22