阅读说明：本技术 Bcs iv类药物前药及其制备和应用 (BCS IV drug prodrug and preparation and application thereof ) 是由 付强 刘丹 郭美辰 宋航 于 2020-06-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种BCS IV类药物前药及其制备和应用,具体涉及包括靶向肠道MCT 1载体蛋白的BCS IV类药物前药及含有该前药的药物组合物及其制备方法。该纳米粒基于纳米化与肠道转运体靶向前药的“增溶-促渗”串联策略能够明显改善BCS IV类药物溶解性和成药性,用于口服给药。属于医药技术领域。本发明提供通式(I)所示化合物、几何异构体及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物：其中,X和Drug如权利要求和说明书所述。本发明基于肠道MCT 1转运体在全肠段表达的特征,设计以MCT 1为载体的口服前药,以提高透膜性差的药物的肠细胞摄取和转运。本发明的以高分子材料为稳定剂的药物组合物体外溶出度高,可进一步解决难溶性前药的口服吸收问题。<Image he="234" wi="318" file="DDA0002528248190000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention relates to a BCS IV drug prodrug, preparation and application thereof, in particular to a BCS IV drug prodrug containing a targeting intestinal MCT1 carrier protein, a pharmaceutical composition containing the prodrug and a preparation method thereof. The nanoparticle can obviously improve the solubility and the pharmacy of BCS IV drugs based on a 'solubilization-permeation promotion' tandem strategy of a nanocrystallization and intestinal transporter targeting prodrug, and is used for oral administration. Belongs to the technical field of medicine. The invention provides a compound shown as a general formula (I), a geometrical isomer and a compound thereofPharmaceutically acceptable salts, hydrates, solvates: wherein X and Drug are as described in the claims and specification. The invention designs an oral prodrug taking MCT1 as a carrier based on the characteristic that an intestinal MCT1 transporter is expressed in a whole intestinal segment, so as to improve intestinal cell uptake and transport of a drug with poor membrane permeability. The pharmaceutical composition taking the high molecular material as the stabilizer has high in-vitro dissolution rate, and can further solve the problem of oral absorption of the insoluble prodrug.)

BCS IV类药物前药及其制备和应用

技术领域

本发明涉及一种BCS IV类药物前药及其制备和应用，具体涉及包括靶向肠道MCT1载体蛋白的BCS IV类药物前药及含有该前药的药物组合物及其制备方法。该纳米粒基于纳米化与肠道转运体靶向前药的“增溶-促渗”串联策略能够明显改善BCS IV类药物溶解性和成药性，用于口服给药。属于医药技术领域。

背景技术

根据BCS理论，溶解性和透膜性是药物口服递送的关键因素。BCS IV类药物由于溶解性和透膜性都较差，导致口服生物利用度不理想。纳米化技术是一种常用的改善难溶性药物溶解性或溶出行为的药剂学手段。该技术采用“自上而下法”或“自下而上法”，将原料药的粒径由微米级降低至纳米级，增大药物的比表面积，进而改善药物的溶解性或溶出行为(Springer International Publishing,Cham，2014，pp.323-341)。

但纳米技术无法解决药物透膜性差的问题，因此仅靠纳米化不能有效改善BCS IV类药物的口服吸收。而肠道转运体靶向前药策略可以提高药物的透膜性(AAPS PharmSci，2000，2(1):48-58)：该策略将肠道内流型转运体的底物共价连接在透膜性差的药物分子上，形成前药。该前药能够被特定的肠道转运体识别，由肠道转运体介导口服吸收，提高生物利用度。人体肠细胞上分布着丰富的潜在药物转运体，如寡肽转运体(oligopeptidetransporter，PEPT)、氨基酸转运体(L-amino acid transporter，LAT)和单羧酸转运体(monocarboxylate transporter，MCT)等。其中，MCT是机体内的一种重要的吸收型转运体，主要转运生物有机体在代谢过程中所产生的只含有一个羧基的小分子代谢产物和其他短链脂肪酸。MCT的各种亚型中，MCT 1的研究最为透彻。免疫组化研究表明，MCT 1在全肠段均有表达(Journal of pharmacobio-dynamics，1991，14(9):501-508)。一些药物的设计与改造充分利用了MCT 1转运体良好的转运能力：如加巴喷丁经结构改造，制备成氨基甲酸酯前药，该前药经由MCT 1吸收，避免了转运体饱和和吸收窗窄的限制，口服生物利用度大幅提高(British journal of clinical pharmacology,2010,69(5):498-507)。由此可见，全肠道分布的高容量MCT 1转运体介导的口服前药设计具有广阔的应用前景。

药物的口服递送需面临系列生理屏障，如pH梯度变化的胃肠液、肠道非搅动水层、肠上皮细胞层等，进而相继出现动态溶解/析出、阻滞在非搅动水层、透膜性差等问题，使药物的吸收受限。单一的药物递送策略难以应对复杂的生理屏障。因此，合理运用复合药物递送系统，提供一种适用性广，能同时解决BCS IV类药物低溶出速率问题和低透膜性问题的方案对BCS IV类药物的开发具有重要意义。

发明内容

为克服现有技术的缺陷，本发明主要解决了三个主要问题：其一，提出一种适用性广泛的改善BCS IV类药物低透膜性的分子结构；其二，提出了一种包括所述分子结构和稳定剂的药物组合物及其制备方法，该药物组合物载药量高，操作简便易行，可以用于工业化生产；其三，提供所述药物组合物在改善BCS IV类药物口服吸收中的应用。

本发明解决的第一个技术问题是提供一种以高表达于肠道上皮细胞的内流型转运体MCT 1为靶点的前药。该转运体能够提高结构中含有靶向配体的前药的口服吸收，靶向配体为丙酸、正丁酸、正戊酸类似物。该类前药显著提高了透膜性，进而显著提高药物的口服吸收。

本发明提供通式(I)所示化合物、几何异构体及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物：

其中：

Drug为含羟基的BCS IV类药物残基；X为C₂-C₆的正二元酸残基；

进一步地，

所述含羟基的BCS IV类药物选自阿昔洛韦、依托泊苷、呋塞米；

X为C₂-C₆的正二元酸残基，优选为琥珀酸、正戊二酸、正己二酸残基。

进一步地，本发明优选戊二酸阿昔洛韦单酯前药，其结构式为：

本发明所述的通式(I)所示化合物、几何异构体及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物采用常规合成方法制备。

本发明解决的第二个技术问题，是提供一种含有通式(I)所示结构的化合物的药物组合物。所述的药物组合物包含通式(I)所示的化合物、几何异构体及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和稳定剂。其中，各成分在药物组合物中的百分组成如下：通式(I)所示的化合物、几何异构体及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物占1-99％，稳定剂占1-99％，通式(I)所示的化合物、几何异构体及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物与稳定剂的重量比为1:99-99:1，优选为20:80-80:20。

其中，所述稳定剂为表面活性剂或高分子聚合物，选自聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物(Soluplus)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、泊洛沙姆(F127，F68)、十二烷基硫酸钠(SDS)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的一种或多种。优选羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物(Soluplus)，更优选羟丙基甲基纤维素(HPMC)。

进一步的，本发明提供了所述药物组合物的制备方法，包括采用反溶剂法与超声破碎技术联用制备药物组合物。所述制备过程如下：

1)将稳定剂分散于水中，制备含有稳定剂的水分散体介质，得溶液A，置于50-60℃下恒温水浴；

2)将通式(I)所示的化合物、几何异构体及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物溶解于有机良溶剂中，得浓度为5-30％(w/V)的B溶液；

3)将溶液B迅速注入溶液A中，并将混合溶液置于冰水浴，冷却30min，形成初混悬液C；

4)将初混悬液C用超声波细胞破碎仪减小粒径，获得的药物组合物的粒径在1-1000nm，优选为200-800nm。

步骤1)中稳定剂的浓度为0.25-1.5％(w/V)。

步骤2)中有机良溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、二甲基亚砜中的一种或多种。

步骤3)中溶液B与溶液A的体积比为1:10-90。

步骤4)中超声波细胞破碎仪的运行功率为50-500W，总工作时间为5-10min。此破碎工艺参数的设定，在能耗低的前提下，可获得粒径分布均匀的药物组合物。

本发明解决的第三个技术问题，是提供所述药物组合物在改善BCS IV类药物口服吸收中的应用。本发明所述的药物组合物是利用高分子材料或表面活性剂的稳定作用将前药分散于分散介质中，通过破碎或自组装，将前药粒子尺寸控制至纳米级别(1-1000nm)，以提高比表面积、溶出速率以及生物利用度。

本发明利用Caco-2细胞试验等对通式(I)所示结构的化合物的摄取及转运情况进行考察，并利用大鼠药动学试验等验证所述药物组合物是否能解决BCS IV类药物吸收不理想的问题。

细胞试验结果表明，靶向MCT 1的阿昔洛韦前药通过提高药物的透膜性，进而表现出显著高于阿昔洛韦的细胞摄取和转运；其中，戊二酸阿昔洛韦单酯前药的透膜性和细胞摄取效率是所有前药中最高的，因此选择该前药进一步通过制剂学手段克服其溶解性差的缺点；药物组合物解决了戊二酸阿昔洛韦单酯前药溶解性差的问题，可以进一步改善戊二酸阿昔洛韦单酯前药的细胞摄取和转运；药动学试验结果表明，MCT 1靶向前药的药物组合物以“增溶-促渗”的串联方式显著提高了阿昔洛韦的口服生物利用度。

本发明提供了一种可改善口服生物利用度的复合药物传递系统，具体涉及BCS IV类药物靶向前药和包含该前药的药物组合物及其制备方法。所述方案溶出速率快，透膜性高，体内吸收稳定且良好，有效改善了BCS IV类药物的口服生物利用度，且制备工艺简单，具有产业化前景。

本发明的优势在于：1)本发明基于肠道MCT 1转运体在全肠段表达的特征，设计以MCT 1为载体的口服前药，以提高透膜性差的药物的肠细胞摄取和转运；2)本发明的以高分子材料为稳定剂的药物组合物体外溶出度高，可进一步解决难溶性前药的口服吸收问题；3)本发明辅料无毒，无污染，操作简便，便于实现工业化生产；4)本发明提出的“增溶-促渗”串联的复合药物传递系统，可以克服BCS IV类药物溶解性和透膜性差的缺点，对开发BCSIV类药物口服用药具有广泛适用性。

附图说明

图1为本发明实施例1中琥珀酸阿昔洛韦单酯前药(AS)的¹H-NMR谱图

图2为本发明实施例1中戊二酸阿昔洛韦单酯前药(AG)的¹H-NMR谱图

图3为本发明实施例1中己二酸阿昔洛韦单酯前药(AA)的¹H-NMR谱图

图4为本发明实施例1中戊酸阿昔洛韦单酯前药(AVA)的¹H-NMR谱图

图5为实施例3中阿昔洛韦前药溶液和阿昔洛韦溶液在AP→BL方向和在BL→AP方向的跨Caco-2细胞单层的表观渗透系数

图6为实施例4中阿昔洛韦前药溶液和阿昔洛韦溶液的Caco-2细胞摄取图；A.药物在不同浓度下的Caco-2细胞摄取B.药物在不同时间下的Caco-2细胞摄取

图7为实施例5中采用不同比例FRET供体和受体制备的AG药物组合物/FRETs的荧光共振转移效率

图8为实施例6中药物组合物两个优选处方的透射电子显微镜图；A.AG药物组合物B.AG药物组合物/FRETs

图9为实施例6中药物组合物两个优选处方的扫描电子显微镜图；A.AG药物组合物B.AG药物组合物/FRETs

图10为实施例7中AG、稳定剂、二者物理混合物、AG药物组合物的DSC图；

图11为实施例7中AG、稳定剂、二者物理混合物、AG药物组合物的PXRD图；

图12为实施例8中阿昔洛韦、AG和AG药物组合物的体外溶出图

图13为实施例9中阿昔洛韦溶液、AG溶液、AG药物组合物、AG粗混悬液的Caco-2细胞摄取图；A.药物在不同浓度下的Caco-2细胞摄取B.药物在不同时间下的Caco-2细胞摄取

图14为实施例9中丁酸对阿昔洛韦溶液、AG溶液、AG药物组合物、AG粗混悬液的Caco-2细胞摄取的影响

图15为实施例9中阿昔洛韦溶液、AG溶液、AG药物组合物、AG粗混悬液在不同pH下的Caco-2细胞摄取

图16为实施例9中AG药物组合物/FRETs与Caco-2细胞的细胞核共定位图

图17为实施例10中阿昔洛韦溶液、AG溶液、AG药物组合物、AG粗混悬液的Caco-2细胞转运图；A.药物在AP→BL方向的转运B.药物在BL→AP方向的转运

图18为实施例10中丁酸对阿昔洛韦溶液、AG溶液、AG药物组合物、AG粗混悬液AP→BL方向的Caco-2细胞转运的影响

图19为实施例10中阿昔洛韦溶液、AG溶液、AG药物组合物、AG粗混悬液在不同pH下AP→BL方向的Caco-2细胞转运

图20为实施例10中AG药物组合物/FRETs与Caco-2细胞的细胞器共定位图

图21为实施例11中大鼠体内平均血浆药-时曲线图；A.灌胃阿昔洛韦溶液和AG溶液以及用正丁酸预处理后灌胃阿昔洛韦溶液和AG溶液的大鼠体内平均血浆药-时曲线图B.灌胃AG溶液、AG粗混悬液、AG药物组合物以及用正丁酸预处理后灌胃AG药物组合物的大鼠体内平均血浆药-时曲线图。

具体实施方式

实施例1：阿昔洛韦前药的合成

取2.25g阿昔洛韦、1.05g琥珀酸酐于茄型瓶，加入10mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，随后加入2mL三乙胺，于120℃反应过夜。蒸干N,N-二甲基甲酰胺，过二氯甲烷-甲醇体系的硅胶柱色谱得到终产品琥珀酸阿昔洛韦单酯前药(AS)，收率8.35％。¹H NMR(600MHz,DMSO–d₆,δppm)12.18(s,1H),10.90(s,1H),7.88(s,2H),7.54(s,1H),5.81(s,2H),4.22(s,2H),3.69(s,2H),2.62(s,2H),2.52(s,2H).(图1)

取2.25g阿昔洛韦、1.20g戊二酸酐于茄型瓶，加入10mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，随后加入2mL三乙胺，于120℃反应过夜。蒸干N,N-二甲基甲酰胺，过二氯甲烷-甲醇体系的硅胶柱色谱得到终产品AG(AG)，收率32.4％。¹H NMR(600MHz,DMSO–d₆,δppm)12.09(s,1H),10.70(s,1H),7.81(s,1H),6.54(s,2H),5.35(s,2H),4.09(s,2H),3.66(s,2H),2.28(s,2H),2.21(s,2H),1.69(s,2H)。(图2)

取2.25g阿昔洛韦、1.35g己二酸酐于茄型瓶，加入10mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，随后加入2mL三乙胺，于120℃反应过夜。蒸干N,N-二甲基甲酰胺，过二氯甲烷-甲醇体系的硅胶柱色谱得到终产品己二酸阿昔洛韦单酯前药(AA)，收率28.6％。¹H NMR(600MHz,DMSO–d₆,δppm)12.18(s,1H),10.92(s,1H),9.05(s,2H),7.77(s,1H),5.81(s,2H),4.21(s,2H),3.69(s,2H),2.35(s,2H),2.32(s,2H),1.72(s,2H),1.60(s,2H)。(图3)

取2.25g阿昔洛韦、1.96g戊酸酐于茄型瓶，加入10mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，随后加入2mL三乙胺，于120℃反应过夜。蒸干N,N-二甲基甲酰胺，过二氯甲烷-甲醇体系的硅胶柱色谱得到终产品戊酸阿昔洛韦单酯前药(AVA)，收率35.6％。¹H NMR(600MHz,DMSO–d₆,δppm)9.71(s,1H),7.77(s,1H),7.12(s,2H),5.81(s,2H),4.21(s,2H),3.69(s,2H),2.35(s,2H),1.65(s,2H),1.37(s,2H),0.92(s,3H)。(图4)

实施例2：阿昔洛韦前药的稳定性

按照一级动力学求算在不同pH缓冲液条件下及大鼠组织匀浆(肝、肠)和血浆中前药降解的半衰期，结果见表1。

表1.AG在不同pH缓冲液、大鼠组织匀浆(肝、肠)和血浆中的稳定性。

--表示在测定时间内未水解

由表1可知，AS、AG、AA和AVA这四种阿昔洛韦前药稳定性相似，在不同pH缓冲液中降解半衰期在8小时左右，预示着所合成的阿昔洛韦前药不会因胃肠道化学环境降解。同理，合成的阿昔洛韦前药可以稳定存在于血浆中。然而，前药在肝匀浆和肠匀浆中的稳定性下降，说明他们可在肝和肠内活化为母药。前药在肝匀浆中的降解半衰期最短，表明肝脏可能是前药的主要活化位点。由于前药对化学环境不敏感，我们推断，前药的活化机制可能与酶有关。

实施例3：阿昔洛韦前药的透膜性考察

我们采用少量有机溶剂制备了阿昔洛韦及其前药的溶液剂，以Caco-2细胞为模型，考察药物的透膜性。将Caco-2细胞以3×10³个/孔接种在Transwell小室中，将阿昔洛韦溶液及前药溶液加入到Caco-2细胞供给侧，测定AP→BL方向和BL→AP方向的表观渗透系数(图5)。结果表明，AVA的表观渗透系数与阿昔洛韦无明显差异，而另外三种前药AS、AG和AA溶液的AP→BL方向的表观渗透系数显著高于阿昔洛韦溶液，说明AVA无法有效提高阿昔洛韦的透膜性，而AS、AG和AA的透膜性高于阿昔洛韦。这可能是由于他们分子结构的差异所致。AS、AG和AA分子中均含有单羧基，因此可能通过MCT 1被细胞转运。而AVA分子中无游离羧基，从而导致MCT 1无法识别，不能经MCT 1介导被细胞转运。AS的表观渗透系数显著低于AG，且AA的表观渗透系数虽与AG无统计学差异，但也略低于AG，说明AG提高透膜性的效果最好，因此AG更适合进行随后的制剂研究。此外，AVA虽与AG碳数相同，其表观渗透系数却显著低于AG。因此我们推测透膜性的提高可能与化合物的脂溶性关系不大，而是由于MCT 1的转运作用。由于MCT 1主要分布于人体肠粘膜顶侧，我们进行了BL→AP的被动扩散试验，进一步验证透膜性的提高与MCT 1介导的主动转运有关。结果表明前药溶液与阿昔洛韦溶液在BL→AP方向的表观渗透系数均无明显差别，说明AS、AG和AA都是经MCT 1介导的主动转运跨Caco-2细胞单层，而阿昔洛韦和AVA的细胞转运与MCT 1无关。

实施例4：阿昔洛韦前药的细胞摄取

将Caco-2细胞以5×10³个/孔接种在24孔板中，第一周每隔一天更换一次培养基，之后每天更换培养基直至培养15天。由于MCT 1对底物的转运具有H⁺依赖性，在第七天更换用正丁酸酸化的培养基。试验在第15天进行。

采用少量有机溶剂制备了阿昔洛韦及其前药的溶液剂，采用浓度分别为0.5、2、5和10mM药物溶液与细胞共孵育60min，考察药物浓度对摄取的影响(图6A)。此外，将5mM药物溶液与细胞共同孵育10、30、60和120min，考察孵育时间对摄取的影响(图6B)。结果表明，前药和母药的摄取均具有浓度和时间依赖性。AVA与阿昔洛韦的摄取量无显著性差异，而AS、AG和AA溶液由于改善了阿昔洛韦的透膜性，细胞摄取明显增加。AG的摄取量明显高于同碳数化合物AVA，说明MCT 1靶向前药可以改善药物的细胞摄取。此外，AG的细胞摄取显著高于AS的摄取，且略高于AA的摄取，说明AG提高药物摄取效率的效果最好，因此选择AG进行后续研究。

实施例5：AG药物组合物处方筛选

由于AG为难溶性前药，因此制备其药物组合物以期改善其溶解性。首先，将AG溶解于50-60℃的有机良溶剂中，配置成5-30％(w/V)的含药溶液。随后制备含有0.25-1.5％(w/V)的聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物(Soluplus)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、泊洛沙姆(F68)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等的水相，并将水相置于50-60℃保温。紧接着，将含药溶液迅速注入水相中，并立即转移至冰水浴30min使形成初混悬液。最后，将初混悬液用超声波细胞破碎仪进一步减小粒径至纳米级，运行功率为50-500W。测定各处方的粒径与多分散指数，如表2所示。表2数据结果表明，不同稳定剂的稳定能力不同。最终确定添加量为0.25％-1.2％(w/V)的羟丙基甲基纤维素(HPMC)作为稳定剂，优选添加量1.0％-1.2％(w/V)，制备的药物组合物粒子粒径在纳米级，且粒度分布均匀。其余常用的稳定剂制备的药物组合物的粒径或多分散指数较大，表明粒度分布不均匀，稳定剂的稳定效果较差。

表2细胞破碎仪功率、辅料种类及用量对AG药物组合物粒径的影响

此外，在优选处方的基础上制备荧光共振能量转移(Fluorescence resonanceenergy transfer,FRET)染料标记的AG药物组合物。首先将FRET对的供体和受体分别溶解于有机良溶剂中，制备染料溶液。随后将前药溶解于染料溶液中，配置成含药5-30％(w/V)且含FRET对0.1％(w/V)的溶液。紧接着制备含有1.0-1.2％(w/V)羟丙基甲基纤维素(HPMC)的水相，并将水相置于50-60℃保温。而后将含药溶液迅速注入水相中，并立即转移至冰水浴30min使形成初混悬液。最后，将初混悬液用超声波细胞破碎仪进一步减小粒径至纳米级。调节FRET对中供体和受体的比例，测定FRET转化效率(图7)。如图7所示，最终优选供体和受体比例为1:3(w/w)，制备的AG药物组合物/FRETs荧光共振转移效率最高。测定优选处方的粒径与多分散指数，如表3所示。表3数据结果表明，AG药物组合物/FRETs粒径分布均匀，且FRET对的加入，未明显改变AG药物组合物的粒径。

表3.FRET对的加入对AG药物组合物粒径的影响

实施例6：AG药物组合物的形态表征

粒子形态会影响药物的口服吸收机制和生物利用度。为了考察FRET染料对的包埋是否影响AG药物组合物的形态，采用透射电子显微镜和扫描电子显微镜对AG药物组合物的粒子形态进行表征，透射电子显微镜(图8)和扫描电子显微镜(图9)结果显示，AG药物组合物的粒子形态为细长针状，长约600-800nm，宽约50nm。且FRET染料的包埋对AG药物组合物的尺寸和形态没有明显影响。

实施例7：AG药物组合物中药物的晶型表征

AG药物组合物的制备涉及反溶剂重结晶过程，可能导致AG的晶型发生改变。因此采用冷冻干燥技术将液态制剂固化，考察AG药物组合物中AG的晶型。在-80℃下，将液态制剂预冻16-24h，然后置于冷冻干燥设备中，在温度为-5-10℃条件下冻干18-24h，即得固化的AG药物组合物。对固化后的AG药物组合物的晶型进行表征。差示扫描量热分析(图10)以及X-射线衍射(图11)结果显示，AG药物组合物的制备过程未改变AG的晶型。

实施例8：体外溶出试验

为验证药物组合物提高了AG的溶出速率，采用透析袋法考察AG药物组合物的体外溶出行为。在37℃下，以50mL纯水为溶出介质，将上述制备的相当于AG 5mg的药物组合物、AG粉末以及阿昔洛韦粉末置于分子量为8000-14000Da的透析袋中，依法操作。于0.25、0.5、1、2、3、4、5和6h取样2mL，并补充2mL新鲜介质。采用紫外可见分光光度计测定样品浓度，并绘制溶出度曲线。溶出度曲线见图12。由图可见，AG的溶出速率和程度远不及阿昔洛韦，但将其制备成AG药物组合物后，溶出速率显著提高。

实施例9：AG药物组合物的细胞摄取

将Caco-2细胞以5×10³个/孔接种在24孔板中，第一周每隔一天更换一次培养基，之后每天更换培养基直至培养15天。由于MCT 1对底物的转运具有H⁺依赖性，在第七天更换用正丁酸酸化的培养基。试验在第15天进行。

采用浓度分别为0.5、2、5和10mM药物与细胞共孵育60min，考察药物浓度对摄取的影响(图13A)。此外，将5mM药物与细胞共同孵育10、30、60和120min，考察孵育时间对摄取的影响(图13B)。结果表明，药物的摄取均具有浓度和时间依赖性。虽然AG溶液明显改善了阿昔洛韦的细胞摄取，但AG粗混悬液的内化药物量明显少于AG溶液。我们推断这是由于AG为难溶性药物，水溶性差限制了细胞摄取。将AG制备成AG药物组合物后，摄取的药物明显增多。我们已经证实了AG药物组合物可以改善AG的溶出行为，也就是说，MCT 1靶向前药药物组合物可协同改善BCS IV类药物的摄取效率。

转运体介导的转运可被竞争性抑制。为了考察MCT 1在AG摄取过程中的作用，我们以MCT 1的高亲和性底物正丁酸为抑制剂进行了竞争性抑制试验。结果如图14所示。丁酸对阿昔洛韦溶液的摄取几乎没有影响，表明阿昔洛韦不是通过MCT 1被摄取。但是，丁酸可显著降低AG溶液、AG药物组合物和AG粗混悬液的细胞摄取，说明MCT 1介导的主动转运是AG分子的主要摄取途径。此外，由于MCT 1对底物的转运具有H⁺依赖性，我们考察了pH对细胞摄取的影响。如图15所示，H⁺浓度的改变几乎不影响阿昔洛韦溶液的摄取。但AG溶液、AG药物组合物和AG粗混悬液在pH 6.0时的摄取量比pH 7.4时高得多，说明AG是MCT 1的底物，可与H⁺共转运。

进一步地，我们用FRET染料对标记AG药物组合物，考察AG药物组合物在Caco-2细胞中的摄取情况，结果如图16所示。FRET荧光指示完整AG药物组合物，其出现在细胞核(蓝色)周围，说明AG药物组合物/FRETs主要被摄取到核周。我们采用内吞抑制试验研究完整AG药物组合物的内化机制。本试验选用的内吞抑制剂包括叠氮钠(能量抑制剂)、槲皮素(非网格蛋白-非小窝蛋白介导的内吞抑制剂)、甲基-β-环糊精(脂筏介导的内吞抑制剂)、氯丙嗪(网格蛋白介导的内吞抑制剂)和吲哚美辛(小窝蛋白介导的内吞抑制剂)。如图16所示，叠氮钠显著抑制了AG药物组合物/FRETs的摄取，说明AG药物组合物的内化是能量依赖的过程。槲皮素、甲基-β-环糊精和氯丙嗪也可以抑制AG药物组合物/FRETs的细胞摄取，说明AG药物组合物可能通过非网格蛋白-非小窝蛋白介导的途径、脂筏介导的途径或网格蛋白介导的途径内吞进入细胞。然而，所有抑制试验中，仅吲哚美辛几乎不影响FRET荧光强度，这说明小窝蛋白可能不参与AG药物组合物的内吞。

实施例10：AG药物组合物的细胞转运

我们以Caco-2细胞单层为模型，考察药物的细胞转运情况。将阿昔洛韦溶液、AG溶液、AG药物组合物和AG粗混悬液加入到Caco-2细胞供给侧，考察AP→BL方向和BL→AP方向的表观渗透系数(图17)。我们已经证实了AG显著改善了ACV的透膜性，但AG粗混悬液仍表现出较低的表观渗透系数。通过将其制备成AG药物组合物，改变其溶解性，表观渗透系数可显著增加。前药的透膜性会随着溶解性增加而提高，这说明前药跨细胞单层的转运有赖于药物的溶解。此外，我们进行了BL→AP转运试验。结果如图17B所示，AG药物组合物的表观渗透系数与AG溶液相似，且显著高于AG粗混悬液，进一步证实了溶解性的提高有利于药物的跨细胞转运。

此外，我们考察了竞争性底物丁酸(图18)以及pH(图19)对药物细胞转运的影响。结果与细胞摄取结果一致。丁酸的加入和H⁺浓度的降低对于阿昔洛韦的转运无明显的影响，但都显著抑制AG溶液、AG药物组合物以及AG粗混悬液的转运。由此可知，AG分子经MCT 1被细胞转运。

进一步地，我们采用FRET考察完整AG药物组合物的Caco-2细胞转运途径。结果如图20所示，FRET荧光信号可以与溶酶体共定位，说明完整AG药物组合物可被递送至溶酶体。此外，高尔基体是转胞吞过程中的重要细胞器，而内质网/高尔基体和高尔基体/质膜是常见的转胞吞途径。因此，我们研究了AG药物组合物/FRETs与高尔基体和内质网的共定位情况。结果表明，AG药物组合物/FRETs可以与高尔基体较好地共定位，说明AG药物组合物可通过高尔基体/质膜途径被肠细胞转运。然而AG药物组合物/FRETs在内质网中的积累较少。这说明AG药物组合物难以通过高尔基体/内质网途径被细胞转运。

实施例11：AG药物组合物的药动学

细胞实验已经证实MCT 1靶向前药药物组合物策略可以改善BCS IV类药物的细胞摄取和转运。进一步地，我们以Wistar大鼠(220g-250g)为模型，进行了口服药动学实验，考察MCT 1靶向前药、药物组合物以及基于二者的复合递送系统对口服生物利用度的影响。将大鼠随机分成7组(n＝6)，为考察MCT 1靶向前药对药物口服生物利用度的影响，首先采用少量有机溶剂制备阿昔洛韦溶液和AG溶液。大鼠分别口服灌注给予阿昔洛韦溶液及AG溶液，给药剂量相当于阿昔洛韦40mg/kg。同时，大鼠分别口服灌注AG药物组合物及AG粗混悬液，以考察药物组合物对难溶性前药口服生物利用度的影响，给药剂量相当于阿昔洛韦40mg/kg。此外，为考察MCT 1在靶向前药吸收过程中的作用，大鼠先口服灌注MCT 1的高亲和性底物正丁酸。10分钟后，灌胃阿昔洛韦溶液、AG溶液和AG药物组合物，给药剂量相当于阿昔洛韦40mg/kg。于5、15、30min以及1、2、4、6、8、12、24h眼眶取血0.3mL，置于肝素化离心管中，13000rpm离心5min，取上清液于-80℃保存备用。

通过液相色谱-质谱联用仪同时测定血浆中药物的浓度并绘制药-时曲线(图21)及计算相应的药动学参数(表4)。结果表明，AG溶液的AUC_0-24h显著高于阿昔洛韦溶液的AUC_0-24h，表明MCT 1靶向前药显著提高了透膜性较差的药物的口服吸收。此外，可以发现，正丁酸几乎不改变阿昔洛韦的口服吸收，说明阿昔洛韦的口服吸收不是由MCT 1介导的。然而，正丁酸显著抑制AG溶液的口服吸收，说明MCT 1在靶向前药吸收过程中发挥着至关重要的作用。为考察药物组合物是否可以进一步改善药物口服生物利用度，我们对AG粗混悬液和AG药物组合物的口服药代动力学进行了研究。结果表明，AG药物组合物的AUC_0-24h显著高于AG粗混悬液的AUC_0-24h，且与AG溶液的AUC_0-24h没有显著性差别。这说明药物组合物策略可以有效改善难溶性前药的口服生物利用度。此外，为验证“增溶-促渗”串联的MCT 1靶向前药药物组合物策略在药物口服吸收过程中的作用，我们进行了竞争性抑制实验。我们采用正丁酸屏蔽了MCT 1对AG的识别，从而阻断了协同作用。结果表明AG药物组合物的AUC_0-24显著降低，说明了MCT 1靶向前药药物组合物以“增溶-促渗”的串联形式改善了BCS IV类药物的口服吸收。

表4A口服阿昔洛韦溶液及AG溶液的药动学参数

^*p＜0.05，^***p<0.001和^****p<0.0001以AG溶液为对照；^#p<0.05和^####p<0.0001以AG溶液为对照

表4B口服AG溶液、AG粗混悬液及AG药物组合物的药动学参数

^**p<0.01，^***p<0.001和^****p<0.0001以AG粗混悬液为对照；^#p<0.05和^####p<0.0001以AG药物组合物为对照。