miRNA表达载体及其应用
阅读说明：本技术 miRNA表达载体及其应用 (MiRNA expression vector and application thereof ) 是由 刘晓萍 罗霭玲 徐令 江华 刘晓丹 杨旭 蔡蔓斯 于 2020-05-07 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种miRNA表达载体及其应用,所述miRNA表达载体从5’端到3’端依次具有以下元件：第一启动子、目标序列、第二启动子和线粒体定位序列,所述目标序列由待表达miRNA的DNA序列重复多次得到。通过实验测试证明,相比于已知载体,利用本申请的miRNA表达载体能够使待表达miRNA在宿主细胞的线粒体中定向显著表达,从而有助于调节线粒体中miRNA的表达,实现线粒体功能调控,为靶向线粒体的药物开发提供基础。(The invention relates to a miRNA expression vector and application thereof, wherein the miRNA expression vector sequentially comprises the following elements from a 5 'end to a 3' end: the miRNA expression vector comprises a first promoter, a target sequence, a second promoter and a mitochondrial positioning sequence, wherein the target sequence is obtained by repeating a DNA sequence of miRNA to be expressed for multiple times. Experimental tests prove that compared with known vectors, the miRNA expression vector can be used for realizing the directional and significant expression of the miRNA to be expressed in the mitochondria of host cells, so that the regulation of the expression of the miRNA in the mitochondria is facilitated, the regulation of mitochondrial function is realized, and a foundation is provided for the development of drugs targeting mitochondria.)
技术领域
本发明涉及生化分子技术领域，特别是涉及一种miRNA表达载体及其应用。
背景技术
线粒体是胞浆中的具有双层膜结构的细胞器，是细胞氧化磷酸化合成ATP的场所。线粒体参与真核细胞分化、能量代谢、信号传导、钙离子稳态、活性氧生成、凋亡及衰老等功能的调控。
胶质瘤是最常见的神经系统肿瘤，根据WHO分级可分为I-IV级，其中恶性程度最高的是胶质母细胞瘤(IV级)。化疗、放疗及手术治疗对胶质瘤特别是胶质母细胞瘤的提高生存率及降低死亡率作用不明显。胶质瘤中的线粒体功能失调包括：结构异常，线粒体膜电位改变，凋亡信号通路被扰乱，mtDNA突变，三羧酸循环相关酶突变等。线粒体融合增加，分裂减少，胶质瘤细胞丝状伪足和树突状伪足中出现线粒体。胶质瘤细胞中线粒体脂肪代谢可促进活性氧异常增加，导致细胞凋亡。研究发现，胶质母细胞瘤患者中具有催化NADP+还原为NADPH功能的酶IDH1突变。研究证实，多种化疗药物(如紫杉醇)可通过靶向线粒体功能抑制胶质瘤。在多种肿瘤中，包括胶质瘤，细胞代谢从氧化磷酸化变成有氧糖酵解，这种代谢重构常伴有线粒体过度极化。胶质瘤细胞中的线粒体过度极化可被小分子口服药二氯乙酸逆转，继而导致肿瘤细胞生长受限。三环类抗抑郁药可促进胶质瘤细胞耗氧量降低、细胞色素C释放，诱导细胞凋亡，但由于其副作用而应用受限。因此，靶向线粒体的药物开发将成为治疗胶质瘤潜在的有效的方法。
微小RNA(microRNA，miRNA)是一类内源性大小在18nt～24nt的一类非编码RNAs，目前已发现的miRNA有上千种。已证实，miRNA在细胞分化、增殖、凋亡等过程中发挥重要作用，通过与靶基因mRNA的3’非翻译区(3’untranslated region，3’UTR)结合调控mRNA的翻译和降解。miRNA因表达失调，在肿瘤的发生发展中的多个阶段发挥重要作用。通过miRNA模拟体或者抑制剂调控miRNA的表达和活性可为抗肿瘤治疗提供新的方法。线粒体中存在多种非编码RNA，包括miRNAs、snoRNA、srpRNA、piRNA及重复序列相关的小RNA，在人类肿瘤中通常发挥类似癌基因或抑癌基因的作用，并且参与线粒体功能调控。
为进一步研究线粒体中miRNA在胶质母细胞瘤中的功能，需要在胶质母细胞瘤线粒体中过表达miRNA，但是现有的商业化载体和文献报道的载体均不能有效实现。
发明内容
基于此，有必要提供一种可在线粒体中高效表达miRNA的miRNA表达载体。
一种miRNA表达载体，所述miRNA表达载体从5’端到3’端依次具有以下元件：第一启动子、目标序列、第二启动子和线粒体定位序列，所述目标序列由待表达miRNA的DNA序列重复多次得到。
在其中一个实施例中，所述目标序列由待表达miRNA的DNA序列重复三次以上得到。
在其中一个实施例中，所述待表达miRNA为miR-92b-5p、miR-25-5p或miR-34a-5p，其DNA序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3所示。
在其中一个实施例中，所述第一启动子为U6启动子，所述第二启动子为CMV启动子。
在其中一个实施例中，所述线粒体定位序列为COX8序列，序列如SEQ ID NO：4所示。
在其中一个实施例中，所述线粒体定位序列的3’端还具有标签蛋白序列。
在其中一个实施例中，所述miRNA表达载体的序列如SEQ ID NO：5所示。
本发明还提供了一种上述miRNA表达载体在线粒体定向表达miRNA中的应用。
本发明还提供了一种重组细胞，所述重组细胞中含有上述miRNA表达载体，或所述重组细胞的基因组整合有上述miRNA表达载体。
本发明还提供了一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物含有上述miRNA表达载体以及药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明通过长期筛选优化构建得到的miRNA表达载体，其从5’端到3’端依次具有第一启动子、目标序列、第二启动子和线粒体定位序列，而目标序列由待表达miRNA即成熟体miRNA的DNA序列重复多次得到。通过实验测试证明，相比于已知载体，利用本申请的miRNA表达载体能够使待表达miRNA在宿主细胞的线粒体中定向显著表达，从而有助于调节线粒体中miRNA的表达，实现线粒体功能调控，为靶向线粒体的药物开发提供基础。
附图说明
图1为COX8序列和hsa-miR-92b-5p成熟体三联体序列的PCR扩增产物纯化鉴定电泳图；其中，泳道1为marker，泳道2为hsa-miR-92b-5p成熟体三联体序列，泳道3为COX8序列；
图2为AfeI酶切pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO的电泳检测结果图；其中，泳道1为marker，泳道2为pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO酶切前，泳道3为pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO酶切后；
图3为Sanger测序验证COX8是否成功克隆至pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO载体的测序结果；
图4为Sanger测序验证has-miR-92b-5p成熟体三联体是否成功克隆至pLB载体的测序结果；
图5为BamHI和EcoRI双酶切has-miR-92b-5p成熟体三联体PCR产物和pHBLV-U6-MCS-CMV-COX8-ZsGreen-PGK-PURO载体的电泳检测结果图；其中，A为has-miR-92b-5p成熟体三联体的检测结果，泳道1为marker，泳道2为酶切前，泳道3为酶切后；B为pHBLV-U6-MCS-CMV-COX8-ZsGreen-PGK-PURO载体的检测结果，泳道1为marker，泳道2为酶切前，泳道3为酶切后；
图6为Sanger测序验证has-miR-92b-5p成熟体三联体序列是否成功克隆至pHBLV-U6-MCS-CMV-COX8-ZsGreen-PGK-PURO载体的测序结果；
图7为Western blot检测线粒体外膜蛋白VDAC以确定分离线粒体的纯度结果图；
图8为qRT-PCR检测U251细胞线粒体中has-miR-92b-5p的表达结果图；其中，1为pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO，2为pHBLV-U6-MCS-CMV-COX8-ZsGreen-PGK-PURO，3为pHBLV-U6-has-miR-92b-5p-CMV-COX8-ZsGreen-PGK-PURO；
图9为qRT-PCR检测pri-miR-92b-5p组(pri-miRNA)、miR-92b-5p成熟体组(miR-92b-5p)、miR-92b-5p三联体组(miR-92b-5p-3)、miR-92b-5p五联体组(miR-92b-5p-5)的U251细胞线粒体中has-miR-92b-5p的表达结果图；
图10为荧光原位杂交检测miR-92b-5p在细胞中的定位及表达的显微照片；
图11为转染pmcherry-COX8-miR-92b-5p-N1表达载体的U251细胞线粒体中miR-92b-5p的表达结果图；
图12为Sanger测序验证miR-25-5p成熟体三联体序列是否成功克隆至pHBLV-U6-MCS-CMV-COX8-ZsGreen-PGK-PURO载体的测序结果；
图13为Sanger测序验证miR-34a-5p成熟体三联体序列是否成功克隆至pHBLV-U6-MCS-CMV-COX8-ZsGreen-PGK-PURO载体的测序结果；
图14为qRT-PCR检测U251细胞线粒体中has-miR-25-5p的表达结果图；其中，1为pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO，2为pHBLV-U6-MCS-CMV-COX8-ZsGreen-PGK-PURO，3为pHBLV-U6-has-miR-25-5p-CMV-COX8-ZsGreen-PGK-PURO；
图15为qRT-PCR检测U251细胞线粒体中has-miR-34a-5p的表达结果图；其中，1为pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO，2为pHBLV-U6-MCS-CMV-COX8-ZsGreen-PGK-PURO，3为pHBLV-U6-has-has-miR-34a-5p-CMV-COX8-ZsGreen-PGK-PURO；
图16为荧光原位杂交检测miR-25-5p在细胞中的定位及表达的显微照片；
图17为荧光原位杂交检测miR-34a-5p在细胞中的定位及表达的显微照片。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。
启动子指的是位于结构基因5’端上游，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性的DNA序列。表达载体指的是可将DNA或RNA序列引入宿主细胞中，以便转化宿主并促进所引入的序列的表达的运载体。MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。
本发明一实施例的miRNA表达载体，其5’端到3’端依次具有以下元件：第一启动子、目标序列、第二启动子和线粒体定位序列，该目标序列由待表达miRNA的DNA序列重复多次得到。
一般构建miRNA过表达载体时是将pri-miRNA序列克隆至表达载体中，但发明人前期经过大量尝试，在线粒体中无法成功表达目标miRNA。目前，已知的线粒体特异性表达载体是将线粒体DNA编码基因COX8克隆到基因表达载体以达到线粒体特异性表达的目的，但该类载体仅能过表达具有蛋白编码功能的mRNA，并不是miRNA，而已知的miRNA过表达载体则不能特异性定位于线粒体。本发明通过长期筛选优化构建得到的miRNA表达载体，其从5’端到3’端依次具有第一启动子、目标序列、第二启动子和线粒体定位序列，而目标序列由待表达miRNA即成熟体miRNA的DNA序列重复多次得到。通过实验测试证明，相比于已知载体，利用本申请的miRNA表达载体能够使待表达miRNA在宿主细胞的线粒体中定向显著表达，从而有助于调节线粒体中miRNA的表达，实现线粒体功能调控，为靶向线粒体的药物开发提供基础。
在一个具体示例中，目标序列由待表达miRNA的DNA序列重复三次以上得到，表达效果更显著。
在一个具体示例中，待表达miRNA为miR-92b-5p、miR-25-5p或miR-34a-5p，其DNA序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3所示。可以理解，具体的miRNA不限于此，可根据需要调整。
在一个具体示例中，第一启动子为U6启动子，第二启动子为CMV启动子。可以理解，启动子不限于此，可根据需要选择其他可用于真核表达的启动子。
在一个具体示例中，上述线粒体定位序列为COX8序列，序列如SEQ ID NO：4所示。可以理解，线粒体定位序列不限于此，还可以是COX10序列、OPA1序列等。可以理解，miRNA表达载体中还可以含有其他元件例如抗性筛选基因等。
在一个具体示例中，miRNA表达载体的序列如SEQ ID NO：5所示，其基于pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO表达载体进行修改得到，目标序列为miR-92b-5p的DNA序列重复三次得到。
本发明一实施例的重组细胞，该重组细胞中含有上述miRNA表达载体，或重组细胞的基因组整合有上述miRNA表达载体。可以理解，重组细胞可以是原核细胞如DH5α等，或真核细胞如U251、U138细胞等。
本发明一实施例的抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物含有上述miRNA表达载体以及药学上可接受的载体或赋形剂。优选地，该抗肿瘤药物用于治疗线粒体相关的肿瘤，例如胶质瘤等。
具体地，药学上可接受的载体或赋形剂指的是一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，适于人体使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。可选地，药学上可接受的载体选自羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯、明胶、硬脂酸镁、甘油、甘露醇、十二烷基硫酸钠、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂和防腐剂中的一种或多种。
本发明一实施例的上述miRNA表达载体的制备方法，包括以下步骤：提供一种基础表达载体，其沿5’端到3’端依次具有第一启动子和第二启动子，然后将线粒体定位序列连接到第二启动子的3’端，将目标序列连接到第一启动子的3’端，得到上述miRNA表达载体。可以理解，制备方法不限于此，本领域技术人员可以根据需要调整制备步骤。
以下为具体实施例。
实施例1
1、提供线粒体定位序列，本实施例选择的序列为线粒体DNA编码基因COX8的编码序列，去掉终止密码子，序列如SEQ ID NO：4所示。
2、将线粒体定位序列(COX8)连接到非编码RNA表达载体pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO中。
根据COX8序列合成片段，设计带有酶切位点的PCR，利用高保真酶(M0531L，NEB公司)进行PCR扩增，获得带有与pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO质粒有互补序列的COX8序列，PCR完成后用TAKARA DNA片段纯化试剂盒(货号：9761)进行纯化(纯化操作步骤详见试剂盒说明书)。
PCR反应体系：
PCR反应条件：
PCR完成后进行纯化，纯化结果如图1所示。
用AfeI(R0652S，NEB公司)对pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO质粒进行单酶切。
反应体系：
37℃反应1小时，琼脂糖凝胶电泳检验酶切效果，结果如图2所示。
利用In-fusion克隆试剂盒(货号9649，TAKARA公司)将COX8片段无缝连接至pHBLV-U6-CMV-ZsGreen-PGK-PURO质粒中，获得表达COX8-ZsGreen融合蛋白的pHBLV-U6-CMV-COX8-sGreen-PGK-PURO(pHBLV-COX8)载体。
反应体系：
50℃，反应15分钟。
3、对重组细胞进行诱导表达，收集菌体。
将连接产物转化DH5α细胞，摇菌后收集菌体。
转化步骤：将连接得到的连接产物2μL与感受态细胞20μL轻轻混匀，冰浴30分钟，42℃热激1分钟，冰浴3分钟，将混合物加入37℃预热的200μL LB培养基中，置于37℃摇床中，220转/分，摇1小时，取100μL溶液均匀涂于氨苄抗性的LB固体培养基上，倒置于37℃培养箱中，培养14～16小时。
挑选固体培养基上单克隆，加入3mL LB培养基中，37℃摇床中，220转/分，摇14～16小时。取1mL菌液进行Sanger测序验证COX8是否成功连接到pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO载体中，验证结果如图3所示。
4、质粒小提，得到线粒体定位的荧光载体pHBLV-U6-MCS-CMV-COX8-ZsGreen-PGK-PURO(pHBLV-COX8)。
将确定构建成功的载体的菌液加入5ml氨苄抗性的液体LB培养基中，220rpm，37℃，摇床摇12～16小时，利用无内毒素质粒小提试剂盒(货号P1001-02，Magen公司)，抽提质粒，获得pHBLV-U6-MCS-CMV-COX8-ZsGreen-PGK-PURO(pHBLV-COX8)载体质粒。
5、提供用于表达has-miR-92b-5p的核苷酸序列。
分别合成对应的pri-miRNA序列、miRNA成熟体、miRNA成熟体三联体、miRNA成熟体五联体序列及其反向互补序列，具体如下所示。退火形成序列双链，退火条件为：95℃，10min。
各步骤中所用引物序列如下所示：
6、分别将pri-miRNA序列、miRNA成熟体、miRNA成熟体三联体、miRNA成熟体五联体连接到pHBLV-COX8及pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO中。
以miRNA成熟体三联体为例，利用pLB载体零背景快速连接试剂盒(VT205-01，北京天根生物)，将hsa-miR-92b-5p成熟体三联体序列双链插入pLB载体中，获得连接产物。将连接产物转化DH5α细胞，摇菌后收集菌体，获得pLB-hsa-miR-92b-5p载体。
转化步骤：将连接得到的质粒2μL与感受态细胞20μL轻轻混匀，冰浴30分钟，42℃热激1分钟，冰浴3分钟，将混合物加入37℃预热的200μL LB培养基中，置于37℃摇床中，220转/分，摇1小时，取100μL溶液均匀涂于氨苄抗性的LB固体培养基上，倒置于37℃培养箱中，培养14～16小时。
挑选LB固体培养基上单克隆，加入3mL LB培养基中，37℃摇床中，220转/分，摇14～16小时。取1mL菌液进行Sanger测序验证hsa-miR-92b-5p是否成功连接到pLB载体中，验证结果如图4所示。
设计带有酶切位点的PCR引物(pU6 F和pU6 R，这一对引物为通用引物，即可扩增任何插入至pLB载体中的miRNA序列)，利用高保真酶(货号M0531L，NEB公司)进行PCR扩增从pLB-hsa-miR-92b-5p中获得带有双酶切位点的hsa-miR-92b-5p成熟体三联体序列，PCR完成后用DNA片段纯化试剂盒(货号9761，TAKARA公司)进行纯化(纯化操作步骤详见试剂盒说明书)。
PCR反应体系：
PCR反应条件：
PCR完成后进行纯化，纯化结果见图1所示。
用BamHI(R0136S，NEB公司)和EcoRI(R3101S，NEB公司)对PCR扩增的带有双酶切位点的hsa-miR-92b-5p成熟体三联体序列和pHBLV-U6-MCS-CMV-COX8-ZsGreen-PGK-PURO质粒进行双酶切。
反应体系：
37℃反应1小时，琼脂糖凝胶电泳检验酶切效果，结果见图5所示。
利用T4连接酶(EL0011，Thermo fisher)分别连接hsa-miR-92b-5p成熟体三联体序列和线性化的pHBLV-COX8或pHBLV-U6-CMV-ZsGreen-PGK-PURO质粒，构建pHBLV-U6-hsa-miR-92b-5p-CMV-COX8-ZsGreen-PGK-PURO(pHBLV-miR92b-COX8)载体和pHBLV-miR92b载体。
反应体系：
室温静置10分钟。
7、将连接产物转化到宿主细胞中，得到重组细胞。
将连接产物转化DH5α细胞，摇菌后收集菌体。
转化步骤：将连接得到的连接产物2μL与感受态细胞20μL轻轻混匀，冰浴30分钟，42℃热激1分钟，冰浴3分钟，将混合物加入37℃预热的200μL LB培养基中，置于37℃摇床中，220转/分，摇1小时，取100μL溶液均匀涂于氨苄抗性的LB固体培养基上，倒置于37℃培养箱中，培养14～16小时。
挑选固体培养基上单克隆，加入3mL LB培养基中，37℃摇床中，220转/分，摇14～16小时。取1mL菌液进行Sanger测序验证hsa-miR-92b-5p成熟体三联体序列是否成功连接到pHBLV-U6-MCS-CMV-COX8-ZsGreen-PGK-PURO载体中，验证结果如图6所示。
8、将菌体裂解，收集细菌质粒，得到线粒体特异性has-miR-92b-5p表达荧光载体pHBLV-miR92b-COX8，序列如SEQ ID NO：5所示。
将确定构建成功的载体的菌液加入100mL氨苄抗性的液体LB中，220rpm，37℃，摇床摇12～16小时。利用无内毒素质粒中提试剂盒(货号K210014，Invitrogen)抽提质粒，获得pHBLV-miR92b-COX8载体质粒和对照载体pHBLV-miR92b载体质粒。
9、转染人胶质瘤细胞U251，采用qRT-PCR和荧光原位杂交鉴定。
将U251细胞接种至10cm的细胞培养皿、6孔板或已放入盖玻片的12孔板中，接种后24小时内进行转染。
10cm细胞培养皿转染体系：
Opti-MEM 2000μL
Lipo stem 40μL
质粒 20ng
6孔板转染体系：
Opti-MEM 250μL
Lipo stem 5μL
质粒 2.5ng
12孔板转染体系：
Opti-MEM 100μL
Lipo stem 2μL
质粒 1ng
操作步骤：轻轻混匀，室温静置10分钟，备用。
弃去培养皿或培养板中细胞培养基，PBS洗3次，加入适量Opti-MEM后，再加入已配好的转染体系，轻轻摇匀，置于37℃5％CO2培养箱中培养5小时，将Opti-MEM更换为10％胎牛血清的DMEM。转染48小时后提取细胞线粒体(37612，QIAGEN，根据试剂盒说明书进行操作)，得到纯化的细胞线粒体，采用Western blot检测线粒体外膜VDAC蛋白以确定线粒体纯度，结果见图7所示。采用Trizol法提取线粒体RNA，逆转录后进行qPCR检测，结果见图8所示。进一步地，pri-miR-92b-5p组(pri-miRNA)、miR-92b-5p成熟体组(miRNA成熟体)、miR-92b-5p三联体组(miRNA成熟体三联体)、miR-92b-5p五联体组(miRNA成熟体五联体)的对比结果如图9所示，可见pri-miR-92b-5p组在线粒体中不表达miR-92b-5p，miR-92b-5p成熟体组表达量非常低，miR-92b-5p三联体组显著表达并且与miR-92b-5p五联体组无显著差异。
提取线粒体蛋白步骤：加入2×loading buffer(货号9172，TaKaRa)，混匀，冰浴5min。
Western blot检测步骤：配置10％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶；30μg蛋白经沸水煮5min后上样，应用不连续缓冲系统进行垂直板电泳，先用80V电泳30min，待进入分离胶后改用120V，电泳直至上样缓冲液中的溴酚蓝电泳至SDS-聚丙烯酰胺凝胶最下缘；电泳后用湿转电转移法将蛋白质转移到PVDF膜上，电转移90V 1.5h，4℃冷室中进行；转移结束后，取出PVDF膜和凝胶，弃去凝胶；5％脱脂奶粉封闭PVDF膜，室温1～2h；加入anti-VDAC(货号PA1-954A，Invitrogen)和anti-tubulin(货号2148S，Cell Signal Technology)，4℃过夜；TBST缓冲液洗3次，每次10min；加入用封闭液稀释羊抗兔二抗(货号SA00001-2，Proteintech)，37℃孵育1h；TBST缓冲液洗3次，每次10min；化学发光显影，成像系统拍照。
Trizol法抽提RNA步骤：加入200μL预冷的氯仿，冰上放置5min；12000rpm，4℃离心15min，吸取400μL上清转移到另一离心管中；加入等体积预冷的异丙醇，迅速用力上下颠倒混匀，冰上放置30min；12000rpm，4℃离心10min，弃上清；加入1mL的75％无酶水乙醇，上下颠倒混匀后，冰上放置5min；7500rpm，4℃降速离心5min；弃上清，室温干燥5～10min，待残余的乙醇挥发完全后，加入35μL的无酶水；分光光度计检测RNA浓度。
利用M-MLV逆转录试剂盒(货号2641Q，TAKARA)进行micro RNA逆转录合成cDNA。
反应体系：
利用SYBR荧光定量PCR试剂盒(货号RR820A，TAKARA)进行实时荧光定量PCR，用2-ΔΔCt表示has-miR-92b-5p的表达。
反应体系：
反应条件：
12孔板转染体系：
50μL Opti-MEM加入2μL lipo2000
50μL Opti-MEM加入1μg质粒
操作步骤：轻轻混匀，室温静置5分钟，再将两管液体混匀，室温孵育10分钟，备用。
弃去培养皿或培养板中细胞培养基，2mL PBS洗2次，2mL DMEM洗一次，加入9mLDMEM后，再加入转染试剂，轻轻摇匀，置于37℃5％CO2培养箱中培养5小时，将DMEM更换为新鲜培养基。转染48小时后取出盖玻片，进行荧光原位杂交检测。
荧光原位杂交步骤(D-0010G型原位杂交检测试剂盒，外显子公司)：在含有盖玻片的12孔板中加入500μL PBS，漂洗，弃去PBS；重复一次；加入500μL4％多聚甲醛固定15分钟，弃液体，加入500μL PBS洗5分钟；加入300μL试剂盒中solution B，处理5分钟；弃去液体，加入500μL PBS，洗5分钟；加入500μL 4％多聚甲醛固定15分钟后，弃液体，加入500μL PBS洗5分钟，共洗2次；加入300μL miRNA杂交液，置于55℃水浴锅，预杂交2小时；DIG标记探针以1:50稀释，85℃3min，37℃2min，取出冰上待用；在洁净的载玻片上滴加50μL DIG标记的miR-92b-5p探针，取出预杂交完成的细胞爬片，沥干预杂交液，倒扣于探针液上，Rubber胶封住片周，置于湿盒内，避光，37℃孵育24小时；撕开Rubber胶，取出细胞爬片，放于12孔板孔中，加入500μL 1×Wash buffer，漂洗5分钟，再于42℃预热的1×Wash buffer中洗2分钟，最后置于1×wash buffer洗8分钟；吸干盖玻片上的液体后加入300μL Blocking buffer，置于湿盒中，37℃孵育30分钟；anti-DIG二抗探针以1:25稀释，载玻片上滴加50μL anti-DIG二抗探针溶液，取出细胞爬片，沥干Blocking buffer，倒扣于探针液上，放入湿盒，避光，37℃孵育1小时；取出细胞爬片，放于12孔板孔中，500μL1×Wash buffer，洗7分钟，共3次；取出细胞爬片，晾干，在一洁净的载玻片上滴加20μL DAPI防淬灭封片剂，将细胞爬片倒置于载玻片上，孵育5分钟后，置于激光共聚焦显微镜下拍照观察，如图10所示。
对比例1
基于类似的方法，将miR-92b-5p成熟体三联体连接到单启动子载体pmcherry-N1上，然后在在miR-92b-5p成熟体三联体上游插入线粒体定位序列COX8，构建得到pmcherry-COX8-miR-92b-5p-N1表达载体。载体构建完成后检测发现，转染该载体的U251细胞中miR-92b-5p的表达与载体对照(pmcherry-N1)、空白对照(blank)无差异，如图11所示，证明构建得到的pmcherry-COX8-miR-92b-5p-N1载体不能在线粒体中表达miRNA。
实施例2
本实施例与实施例1的方法基本相同，区别在于将miR-92b-5p的成熟体三联体替换成miR-25-5p或miR-34a-5p的成熟体三联体，操作步骤不变，构建成相应的线粒体特异性miRNA过表达载体。结果如图12～17所示，证明miR-25-5p或miR-34a-5p成功在宿主细胞的线粒体中定向显著表达。
miR-25-5p成熟体序列为：
AGGCGGAGACTTGGGCAATTG
miR-34a-5p成熟体序列为：
TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州市妇女儿童医疗中心(广州市妇幼保健院、广州市儿童医院、广州市妇婴医院、广州市妇幼保健计划生育服务中心)
<120> miRNA表达载体及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agggacggga cgcggtgcag tg 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aggcggagac ttgggcaatt g 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggcagtgtc ttagctggtt gt 22
<210> 4
<211> 210
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgtccgtcc tgacgccgct gctgctgcgg ggcttgacag gctcggcccg gcggctccca 60
gtgccgcgcg ccaagatcca ttcgttgccg ccggagggga agcttgggat catggaattg 120
gccgttgggc ttacctcctg cttcgtgacc ttcctcctgc cagcgggctg gatcctgtca 180
cacctggaga cctacaggag gccagagtga 210
<210> 5
<211> 8636
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcggccgcgt cgacaatcaa cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actggtattc 60
ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg 120
ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc 180
tttatgagga gttgtggccc gttgtcaggc aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg 240
acgcaacccc cactggttgg ggcattgcca ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg 300
ctttccccct ccctattgcc acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga 360
caggggctcg gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt gtcggggaag ctgacgtcct 420
ttccatggct gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg 480
tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc 540
ctcttccgcg tcttcgcctt cgccctcaga cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc 600
cgctggtatt cgagctcggt acctttaaga ccaatgactt acaaggcagc tgtagatctt 660
agccactttt taaaagaaaa ggggggactg gaagggctaa ttcactccca acgaagacaa 720
gatctgcttt ttgcttgtac tgggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc 780
tctggctaac tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa 840
gtagtgtgtg cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag 900
tcagtgtgga aaatctctag cacgcgcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg 960
tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa 1020
gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct 1080
ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga 1140
ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc 1200
gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 1260
tcaggggata acgcaggaaa gaacatagct tgggactcat gggagctgct ggttctcttt 1320
cactgacatc tgcaaagaca acaatgccag ggagagattt gtgtgggcat gacaggtttt 1380
gcaatattac tcttaagcct agacgatgat tacagcccac aagagatgac agcaacccca 1440
agcttgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 1500
ttttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 1560
gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 1620
gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 1680
aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 1740
ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 1800
taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 1860
tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 1920
gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 1980
taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 2040
tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 2100
tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 2160
ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 2220
taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 2280
tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt 2340
cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc 2400
gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc 2460
cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg 2520
ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac 2580
aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg 2640
atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 2700
tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact 2760
gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc 2820
aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat 2880
acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 2940
ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 3000
tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 3060
aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 3120
catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 3180
atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg 3240
aaaagtgcac cccaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat 3300
cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact 3360
catcaatgta tcttatcatg tccacctgac gtcgggtctc tctggttaga ccagatctga 3420
gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 3480
tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 3540
agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 3600
cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 3660
caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 3720
aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 3780
aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 3840
caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 3900
gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 3960
cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 4020
ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 4080
aagcggccgc tgatcttcag acctggagga ggagatatga gggacaattg gagaagtgaa 4140
ttatataaat ataaagtagt aaaaattgaa ccattaggag tagcacccac caaggcaaag 4200
agaagagtgg tgcagagaga aaaaagagca gtgggaatag gagctttgtt ccttgggttc 4260
ttgggagcag caggaagcac tatgggcgca gcgtcaatga cgctgacggt acaggccaga 4320
caattattgt ctggtatagt gcagcagcag aacaatttgc tgagggctat tgaggcgcaa 4380
cagcatctgt tgcaactcac agtctggggc atcaagcagc tccaggcaag aatcctggct 4440
gtggaaagat acctaaagga tcaacagctc ctggggattt ggggttgctc tggaaaactc 4500
atttgcacca ctgctgtgcc ttggaatgct agttggagta ataaatctct ggaacagatt 4560
tggaatcaca cgacctggat ggagtgatgg agtgggacag agaaattaac aattacacaa 4620
gcttaataca ctccttaatt gaagaatcgc aaaaccagca agaaaagaat gaacaagaat 4680
tattggaatt agataaatgg gcaagtttgt ggaattggtt taacataaca aattggctgt 4740
ggtatataaa attattcata atgatagtag gaggcttggt aggtttaaga atagtttttg 4800
ctgtactttc tatagtgaat agagttaggc agggatattc accattatcg tttcagaccc 4860
acctcccaac cccgagggga cccgacaggc ccgaaggaat agaagaagaa ggtggagaga 4920
gagacagaga cagatccatt cgattagtga acggatctcg acggtatcgc ctttaaaaga 4980
aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat agcaacagac 5040
atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaaattc aaaattttcg ggtttattac 5100
agggacagca gagatccagt ttatcgatct gggcaggaag agggcctatt tcccatgatt 5160
ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct gttagagaga taattagaat taatttgact 5220
gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag 5280
tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag 5340
tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg tggaaaggac gaggatcctt tcagcaagat 5400
agggacggga cgcggtgcag tgagggacgg gacgcggtgc agtgagggac gggacgcggt 5460
gcagtgatct ttctagaaga tctcctacaa tattctcagc tgccatggga attctagtta 5520
ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac 5580
ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc 5640
aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt 5700
ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac 5760
gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac 5820
cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt 5880
gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc 5940
aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt 6000
tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg 6060
ggaggtctat ataagcagag ctggtttagt gaaccgtcag atccgctagc atgtccgtcc 6120
tgacgccgct gctgctgcgg ggcttgacag gctcggcccg gcggctccca gtgccgcgcg 6180
ccaagatcca ttcgttgccg ccggagggga agcttgggat catggaattg gccgttgggc 6240
ttacctcctg cttcgtgacc ttcctcctgc cagcgggctg gatcctgtca cacctggaga 6300
cctacaggag gccagagtgg ctaccggtcg ccaccatggc ccagtccaag cacggcctga 6360
ccaaggagat gaccatgaag taccgcatgg agggctgcgt ggacggccac aagttcgtga 6420
tcaccggcga gggcatcggc taccccttca agggcaagca ggccatcaac ctgtgcgtgg 6480
tggagggcgg ccccttgccc ttcgccgagg acatcttgtc cgccgccttc atgtacggca 6540
accgcgtgtt caccgagtac ccccaggaca tcgtcgacta cttcaagaac tcctgccccg 6600
ccggctacac ctgggaccgc tccttcctgt tcgaggacgg cgccgtgtgc atctgcaacg 6660
ccgacatcac cgtgagcgtg gaggagaact gcatgtacca cgagtccaag ttctacggcg 6720
tgaacttccc cgccgacggc cccgtgatga agaagatgac cgacaactgg gagccctcct 6780
gcgagaagat catccccgtg cccaagcagg gcatcttgaa gggcgacgtg agcatgtacc 6840
tgctgctgaa ggacggtggc cgcttgcgct gccagttcga caccgtgtac aaggccaagt 6900
ccgtgccccg caagatgccc gactggcact tcatccagca caagctgacc cgcgaggacc 6960
gcagcgacgc caagaaccag aagtggcacc tgaccgagca cgccatcgcc tccggctccg 7020
ccttgcccta actcgagacc ggggtagggg aggcgctttt cccaagcatc tgactggttt 7080
agaccctgat gcccatgcgc cctcccgtag agggggcggc ggctggccac catatcaagc 7140
acatcccccg gtaggcgcaa ccggctccgt tcttttggtg ggccccttcc gcgccacctt 7200
ctactcctcc cctagtcagg agttcccccc cgccccgaag ctcgccgtcg ttgcaggacg 7260
tggacaaatg gaagtacacg tcccactagt ctcggtgcag atgggaccgc accccttaac 7320
aatgaaagcg ggtaggcctg ttgagcaacc gccaatagca gtttgtctcc ttcgctttct 7380
ggctaaaagc ttggaagggt gtgggtccgg ggccggcttc gggcggtctc agggcggggg 7440
gagccgaagg ccccggagcc ggatttgccc cttaaaagac atttgcgcgc tgaccccctc 7500
gggtagggga ggcgcttttc ccaaggcagt ctggagcatg cgctttagca gccccgctgg 7560
cacttggcgc tacacaagtg gcctctggcc tcgcacacat tccacatcca ccggtagcgc 7620
caaccggctc cgttctttgg tggccccttc gcgccacctt ctactcctcc cctagtcagg 7680
aagttccccc ccgccccgca gctcgcgtcg tgcaggacgt gacaaatgga agtagcacgt 7740
ctcactagtc tcgtgcagat ggacagcacc gctgagcaat ggaagcgggt aggcctttgg 7800
ggcagcggcc aatagcagct ttgctccttc gctttctggg ctcagcagct gggaagggtg 7860
ggtccggggg cgggctcagg ggcgggctca ggggcggggc gggcgcccga aggtcctccg 7920
gaggcccggc attctgcacg cttcaaaagc gcacgtctgc cgcgctgttc tcctcttcct 7980
catctccggg cctttcgacc tgcatccatc tagatctcga gcagctgaag cttaccatga 8040
ccgagtacaa gcccacggtg cgcctcgcca cccgcgacga cgtccccagg gccgtacgca 8100
ccctcgccgc cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca caccgtcgat ccggaccgcc 8160
acatcgagcg ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac gcgcgtcggg ctcgacatcg 8220
gcaaggtgtg ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt ctggaccacg ccggagagcg 8280
tcgaagcggg ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat ggccgagttg agcggttccc 8340
ggctggccgc gcagcaacag atggaaggcc tcctggcgcc gcaccggccc aaggagcccg 8400
cgtggttcct ggccaccgtc ggcgtctcgc ccgaccacca gggcaagggt ctgggcagcg 8460
ccgtcgtgct ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg ggtgcccgcc ttcctggaga 8520
cctccgcgcc ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg cttcaccgtc accgccgacg 8580
tcgaggtgcc cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg caagcccggt gcctga 8636