阅读说明：本技术 一种含有lpxM基因的重组质粒及其制备方法和重组大肠杆菌 (Recombinant plasmid containing lpxM gene, preparation method thereof and recombinant escherichia coli ) 是由 郭美锦 张宁 洪琦 韦炎龙 于 2020-06-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种含有lpxM基因的重组质粒pCC1L及其制备方法,所述所述重组质粒pCC1L为在质粒pCC1FOS的基础上连接有lpxM基因。本发明还公开了一种重组大肠杆菌,转化所述重组质粒pCC1L得到的重组大肠杆菌。本发明的重组质粒上连接有lpxM基因,重组质粒可转化至大肠杆菌中,促进大肠杆菌的生长；本发明中的重组大肠杆菌,能够实现大肠杆菌的高生长和番茄红素的高生产。(The invention discloses a recombinant plasmid pCC1L containing lpxM gene and a preparation method thereof, wherein the recombinant plasmid pCC1L is connected with the lpxM gene on the basis of plasmid pCC1 FOS. The invention also discloses a recombinant Escherichia coli obtained by transforming the recombinant plasmid pCC 1L. The recombinant plasmid is connected with an lpxM gene, and can be transformed into escherichia coli to promote the growth of the escherichia coli; the recombinant escherichia coli can realize high growth of the escherichia coli and high production of lycopene.)

一种含有lpxM基因的重组质粒及其制备方法和重组大肠杆菌

技术领域

本发明涉及基因重组技术领域，尤其涉及一种含有lpxM基因的重组质粒及其制备方法和利用该重组质粒得到的重组大肠杆菌。

背景技术

番茄红素(Lycopene，C₄₀H₅₆)是一种深红天然色素，是C40萜类化合物，相对分子质量为536.9，属于类胡萝卜素，有提高免疫力、抗衰老、保护视力、预防心血管疾病和癌症等功用，是目前极为畅销的保健品之一，多存在于血浆、肝、肾上腺、肺、前列腺以及皮肤中。番茄红素是一种具有高经济价值的类胡萝卜素，在饲料、食品、保健品、化妆品及医药等行业得到广泛应用。

目前，工业上主要通过植物萃取法、化学合成法和微生物合成法这三个途径来生产番茄红素。植物萃取法是现今国内最为常用的方法，该方法以番茄果实或残渣为原料，利用有机试剂萃取得到番茄红素。但是，果实中的番茄红素含量通常低于总碳元素的1％，因此该方法的成本高。此外，以植物为原料占用大量土地，并受到气候限制。虽然化学合成法可以降低番茄红素的生产成本，工艺也成熟，但是该方法合成的副产物多，番茄红素产品中残留的化学反应物质结构不清楚且无法去除，所以利用该方法制备的番茄红素产品作为食品、保健品等不适合长期使用。微生物合成法即是利用微生物生产番茄红素，这种方法不受外界限制，具有极大的发展空间。同时，微生物作为可再生原料，在环境资源保护方面也占据优势。研究最彻底的物种之一E.coli凭借遗传背景清晰、生长速度快、基因工程技术简单成熟的优点，成为生产番茄红素的常用宿主。

因此，亟需提供一种重组大肠杆菌，能够实现大肠杆菌的高生长和番茄红素的高生产，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有lpxM基因的重组质粒pCC1L及其制备方法和重组大肠杆菌，实现在高生产番茄红素基础上促进大肠杆菌高生长，进一步提高了番茄红素产率。

为了实现上述目的，本发明采取了以下技术方案。

本发明提供了一种含有lpxM基因的重组质粒pCC1L，所述重组质粒pCC1L为在质粒pCC1FOS的基础上连接有lpxM基因。

本发明还提供了一种重组质粒pCC1L(Cm^R)的制备方法，包括如下步骤：

(1)质粒pET3b-lpxM的构建步骤如下：

①目的基因的扩增：以含有lpxM基因的目的片段为模板，以lpxM3和lpxM5为引物，PCR扩增至1.2kb片段；

LPXM5：AAGAAGGAGATATACATatggaaacgaaaaaaaataatagc；

LPXM3：TTAGCAGCCGGATCCttatttgatgggataaagatcttt；

②质粒pET3b的扩增：以质粒pET3b为模板，以pET5和pET3为引物，PCR扩增至4.6kb片段；

pET5：GGATCCGGCTGCTAACAAA；

pET3：ATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTA；

③体外重组：将含有lpxM基因的目的片段连接至所述质粒pET3b上，得到质粒pET3b-lpxM；

④转化，鉴定：

将重组得到的质粒pET3b-lpxM转化到感受态DMT涂布AmpR平板；以T7/T7t为引物进行PCR鉴定；鉴定含有1.2kb的片段为阳性克隆，提取质粒pET3b-lpxM；

T7：TAATACGACTCACTATAGGG；

T7t：TGCTAGTTATTGCTCAGCGG；

(2)重组质粒pCC1L的构建步骤如下：

以所述质粒pET3b-lpxM为模板，以BI5和BI3为引物，PCR约1.2kb，电泳胶回收LPXMCC片段，与pCC1FOS体外重组获得质粒pCC1L(Cm^R)；

BI5：GTTTTCCCAGTCACGACAAGGAGATGGCGCCCAA；

BI3：CCATGATTACGCCAAGCCGGATATAGTTCCTCCTTT。

本发明还提供一种包含上述重组质粒pCC1L的重组大肠杆菌，通过将所述重组质粒pCC1L(Cm^R)转化至大肠杆菌DH416中制得。

进一步，所述重组大肠杆菌采用25μg/mL的氯霉素(Cm)进行筛选。

进一步，所述重组大肠杆菌的发酵方法，包括如下步骤：

1)培养：

对转化有重组质粒pCC1L的重组大肠杆菌进行培养，具体为：挑取单菌落至含有5mL液体LB培养基的大试管中，在37℃，220rpm下孵育10-12h；在42℃的条件下消除辅助质粒；

2)发酵：

挑取单菌落至含有5mL的液体LB培养基的大试管中，在30℃、220rpm条件下过夜培养；次日，转接至自诱导培养基(FMGAT培养基)中培养，使发酵初始OD₆₀₀为0.05，在30℃、220rpm条件下培养24h。

进一步，所述LB培养基包括：蛋白胨、酵母粉和NaCl。

进一步，所述LB培养基包括：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L的NaCl。

进一步，所述自诱导培养基包括：蛋白胨、酵母粉、NaH₂PO₄·2H₂O、K₂HPO₄·3H₂O、NaCl、吐温80、甘油、MgSO₄、葡萄糖、L-阿拉伯糖；其中，所述MgSO4与所述葡萄糖单独配成母液。

进一步，所述自诱导培养基(FMGAT培养基)包括：15g/L蛋白胨、12g/L酵母粉、3g/L的NaH₂PO₄·2H₂O、7g/L的K₂HPO₄·3H₂O、2.5g/L的NaCl、5g/L吐温80、10g/L甘油、50g/L的MgSO₄、200g/L葡萄糖、200g/L的L-阿拉伯糖。

进一步，所述FMGAT培养基中，所述MgSO₄与所述葡萄糖单独配成母液。

本发明中，将所述质粒pCC1FOS转化至所述大肠杆菌DH416中，可采用本领域常规的转化方法。

本发明中，所述目的基因片段的获得可以采用常规的方法得到。

本发明中，采用的所述质粒pET3b和所述质粒pCC1FOS均为市售产品。

本发明具体实施例中，所述质粒pET3b购自Novagen公司；所述质粒pCC1FOS购自Epicentre公司。

本发明中的DH416菌株敲除了lpxM位点。

番茄红素及其他萜类化合物有着共同的前体：异戊烯基焦磷酸(Isopentenyldiphosphate,IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(Dimethylallyl diphosphate,DMAPP)。这两种物质在生物体内由甲羟戊酸(Mevalonate，MVA)途径或2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(Methy-D-erythritol 4-phosphate，MEP)途径获得(图9)。MEP途径主要存在于革兰氏阴性细菌和绿藻的细胞质体中，前体是3-磷酸甘油醛(Glyceraldehyde 3-phosphate)和丙酮酸(Pyruvate)；MVA途径主要存在于多数真核生物、古细菌和革兰氏阳性球菌的胞浆中，前体是乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)。因此通过在大肠杆菌中导入异源MVA途径，增加前体积累，可以有效提高番茄红素产量。

本发明的有益效果在于：

本发明的方法将lpxM基因成功连接至质粒上得到重组质粒pCC1L，并将重组质粒成功转化至大肠杆菌中得到重组大肠杆菌，促进了菌体的生长，进一步提高了番茄红素产量。通过本发明能够实现大肠杆菌的高生长和番茄红素的高生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明中的重组质粒及转化的示意图。

图2为本发明中的lpxM基因片段与pET3b骨架的大小示意图。

图3为本发明中lpxM-pET3b重组体系PCR产物鉴定结果。

图4为本发明中的重组质粒pCC1L的PCR产物鉴定结果。

图5为本发明中番茄红素标准曲线图。

图6为本发明试验例3中的菌体生长对比柱状图。

图7为本发明试验例4中的菌体生长对比柱状图。

图8为DH411和DH416发酵后的菌体生长和番茄红素生产对比图。

图9为本发明中番茄红素代谢途径示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

参考图1，本实施例提供了一种含有lpxM基因的重组质粒pCC1L，所述重组质粒pCC1L为在质粒pCC1FOS的基础上连接有lpxM基因。

所述重组质粒pCC1L(Cm^R)的制备方法，包括如下步骤：

(1)质粒pET3b-lpxM的构建步骤如下：

①目的基因的扩增：以含有lpxM基因的目的片段为模板，以lpxM3和lpxM5为引物，PCR扩增至1.2kb片段；

LPXM5：AAGAAGGAGATATACATatggaaacgaaaaaaaataatagc；

LPXM3：TTAGCAGCCGGATCCttatttgatgggataaagatcttt；

②质粒pET3b的扩增：以质粒pET3b为模板，以pET5和pET3为引物，PCR扩增至4.6kb片段；

pET5：GGATCCGGCTGCTAACAAA；

pET3：ATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTA；

③体外重组：将含有lpxM基因的目的片段连接至所述质粒pET3b上，得到质粒pET3b-lpxM；

④转化，鉴定：

将重组得到的质粒pET3b-lpxM转化到感受态DMT涂布AmpR平板；以T7/T7t为引物进行PCR鉴定；鉴定含有1.2kb的片段为阳性克隆，提取质粒pET3b-lpxM；

T7：TAATACGACTCACTATAGGG；

T7t：TGCTAGTTATTGCTCAGCGG；

(2)重组质粒pCC1L的构建步骤如下：

以所述质粒pET3b-lpxM为模板，以BI5和BI3为引物，PCR约1.2kb，电泳胶回收LPXMCC片段，与pCC1FOS体外重组获得质粒pCC1L(Cm^R)；

BI5：GTTTTCCCAGTCACGACAAGGAGATGGCGCCCAA；

BI3：CCATGATTACGCCAAGCCGGATATAGTTCCTCCTTT。

实施例2

参考图1，本实施例提供了一种包含上述重组质粒pCC1L的重组大肠杆菌，通过将所述重组质粒pCC1L(Cm^R)转化至大肠杆菌DH416中制得。所述重组大肠杆菌采用25μg/mL的氯霉素(Cm)进行筛选。

所述重组大肠杆菌的发酵方法，步骤如下：

1)培养：

对转化有重组质粒pCC1L的重组大肠杆菌进行培养，具体为：挑取单菌落至含有5mL液体LB培养基的大试管中，在37℃，220rpm下孵育10-12h；在42℃的条件下消除辅助质粒；

2)发酵：

挑取单菌落至含有5mL的液体LB培养基的大试管中，在30℃、220rpm条件下过夜培养；次日，转接至自诱导培养基(FMGAT培养基)中培养，使发酵初始OD₆₀₀为0.05，在30℃、220rpm条件下培养24h，得到发酵液。

所述LB培养基包括：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L的NaCl。

所述自诱导培养基(FMGAT培养基)包括：15g/L蛋白胨、12g/L酵母粉、3g/L的NaH₂PO₄·2H₂O、7g/L的K₂HPO₄·3H₂O、2.5g/L的NaCl、5g/L吐温80、10g/L甘油、50g/L的MgSO₄、200g/L葡萄糖、200g/L的L-阿拉伯糖。所述FMGAT培养基中，所述MgSO₄与所述葡萄糖单独配成母液。

试验例1

①实施例1中的lpxM基因与pET3b骨架的大小见图2所示；其中，图2a和图2b分别为lpxM基因片段与pET3b骨架的大小。

本试验例对实施例1中的pET3b-lpxM重组体系进行PCR产物鉴定，结果如图3所示。

图3中，阳性克隆约1.2kb，阴性克隆均无条带。

根据对图2和图3的分析，可知pET3b-lpxM，中成功连接有lpxM基因。

②本试验例中，将实施例1中的pET3b-lpxM与pCC1FOS片段进行体外重组后得到的重组质粒pCC1L转化到DMT感受态，用T7/T7t进行PCR结果鉴定，结果见图4。

如图4所示，阳性克隆条带约为1200bp，阴性克隆无条带。本发明中，利用体外重组技术能够得到很高的克隆阳性率，同时利用E.coli DMT作为宿主扩增质粒，消除甲基化模板。

试验例2

本试验例，对实施例2中所述重组大肠杆菌发酵得到的所述发酵液进行番茄红素发酵水平的检测(利用丙酮萃取法获得番茄红素，利用紫外分光光度法检测番茄红素)：

将发酵液吸取到离心管中，在11,340×g下离心3min，弃上清液；利用去离子水洗涤菌体，在11,340×g下离心3min，弃上清液；利用丙酮在黑暗条件下萃取番茄红素，萃取反应在55℃下进行10分钟，确保菌体由红色变为白色；随后，样品在11,340×g下离心10分钟；最后利用紫外分光光度计在OD_474nm下检测番茄红素含量。为计算番茄红素得率(mg/gDCW)，系数取0.37gDCW/OD_600nm。

本实验室规定的番茄红素标准曲线如图5，OD_474nm在0.2-0.8范围内，番茄红素浓度和OD_474nm呈线性关系。本实施例中的番茄红素样品浓度均稀释至此范围内检测。

试验例3

本试验例中，将实施例1中的装载有lpxM基因的质粒pET3b-lpxM转化到DH416菌株中(此处的DH416菌株敲除了lpxM位点)，然后按照实施例2中的发酵方法进行发酵，发酵24h，得到发酵液；进行两组平行试验，记为重组体系1和重组体系2。对得到的发酵液进行细胞生长状况的检测，检测OD₆₀₀。

对照组为：以转化有空载质粒PET3b的DH416菌株和敲除了lpxM位点的DH416菌株，分别记为对照组1和对照组2。记录实验结果，如图6所示。

根据图6可知：本发明中重组大肠杆菌这一重组体系的OD₆₀₀最多能达到28.6；而高产番茄红素菌株DH416仅能达到9.25，比重组大肠杆菌的生长水平低约3倍；而未装载lpxM基因的空质粒pET3b的生长水平最高达到26，是DH416的2.8倍。

DH416是敲除了lpxM位点，即用整合表达元件替换对应的基因DNA序列，整合位点对菌株生长及番茄红素的合成具有通用性，因此，在过表达lpxM基因后明显能看到菌体生长水平有着很大的提升。

因为番茄红素显红色，所以能很直观地判断产量。从发酵液颜色也可以看出，重组体系的转化菌的番茄红素产量和得率明显不高，而DH416的发酵液颜色很深，番茄红素产量较高。

试验例4

本试验中，将实施例1中的装载有lpxM基因的重组质粒pCC1L转化到DH416菌株中(此处的DH416菌株敲除了lpxM位点)，然后按照实施例2中的发酵方法进行发酵，得到发酵液；进行两组平行试验，记为重组体系1和重组体系2；对得到的发酵液进行细胞生长状况的检测，检测OD₆₀₀。

对照组为：转化有空载质粒pCC1FOS的DH416菌株和敲除了lpxM位点的DH416菌株，分别记为对照组1和对照组2，并对发酵液进行OD₆₀₀检测。记录实验结果，见图7所示。

本试验中，重组质粒pCC1L转化至大肠杆菌中，选取阳性克隆菌株进行发酵24h，发酵初始的OD₆₀₀是0.05，测得的生长结果与pET3b多拷贝的结果(见图6)基本相似。由此判断lpxM基因确实影响生长，过表达会促进菌体生长。

试验例5

本试验中，对高产番茄红素菌种DH416和低产番茄红素菌种DH411的菌体生长、番茄红素产量以及得率进行比较。其中，DH416是已经敲除了lpxM基因的番茄红素高产菌株。

方法：菌株发酵方法同实施例2：两种菌同样转接到培养基中，只有菌种不同，单一变量发酵24小时，固定时间取样测定菌体生长和番茄红素产量以及得率，最后的结果见图8。

结果：DH416番茄红素水平可以达到98mg/L，在15小时左右达到最大，是DH411的近15倍，番茄红素得率在15h左右达到约82mg/g DCW，而DH411几乎贴近于0，得率很低；而DH411的生长几乎一直增加，是DH416的3倍之多，DH416在9h的时候就已经停止生长进入稳定期了，而生产番茄红素则是到15h才趋于稳定，只顾生产而生长受影响。可见，DH416菌株的细胞生长较差。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。