阅读说明：本技术 氨基酸高效绿色生产提取工艺 (Efficient green production and extraction process of amino acid ) 是由 赵兰坤 赵凤良 王小平 魏冉冉 刘世周 程士清 于 2020-05-21 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物工程技术领域,氨基酸高效绿色生产提取工艺,其包括：收L-丙氨酸发酵液,离心,收集上清液；将上清液通过陶瓷膜进行微滤,收集滤过液；往滤过液中添加活性炭脱色,板框过滤,收集脱色液；然后通过强酸性阳离子交换树脂,L-丙氨酸被交换到树脂上,随后用氨水将树脂上的L-丙氨酸完全洗脱下来,通过浓缩结晶、离心、干燥获得成品。本发明工艺能够提高发酵生产强度,进而降低发酵丙氨酸的生产成本。(The invention belongs to the technical field of bioengineering, and discloses an efficient and green production and extraction process of amino acid, which comprises the following steps: collecting L-alanine fermentation liquor, centrifuging, and collecting supernatant; microfiltering the supernatant through a ceramic membrane, and collecting filtrate; adding activated carbon into the filtrate for decolorization, filtering with a plate frame, and collecting the decolorized solution; then passing through strong acid cation exchange resin, L-alanine is exchanged on the resin, then ammonia water is used for completely eluting the L-alanine on the resin, and the finished product is obtained by concentration, crystallization, centrifugation and drying. The process can improve the fermentation production intensity and further reduce the production cost of fermentation alanine.)

氨基酸高效绿色生产提取工艺

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及氨基酸高效绿色生产提取工艺。

背景技术

L-丙氨酸无色至白色结晶性粉末，溶于水、乙醇，不溶于乙醚和丙酮。主要用于生化研究、组织培养、肝功能测定、增味剂、可增加调味品的调味效果、还可用作酸味矫正剂，改善有机酸的酸味。丙氨酸在医药领域的用途也随之被发现，临床研究表明，丙氨酸预防肾结石、协助葡萄糖的代谢，有助缓和低血糖，改善身体能量。丙氨酸还广泛用于合成新型甜味剂及某些手性药物中间体的原料。

目前,丙氨酸通常使用化学法来进行工业化生产，但此方法转化率低，副产物多，且容易产生工业三废，污染环境。相比之下，可再生资源微生物发酵法是一种更具有发展潜力的绿色生产方法。微生物发酵是生产丙氨酸的主要方法。

CN110982857A公开了一种L-丙氨酸的发酵生产方法，采用一次性投料发酵工艺，将发酵所需的糖源、氮源、无机盐等一次性投入发酵罐，灭菌降温后，再移入种子，发酵培养生产L-丙氨酸。通过对发酵条件的优化，例如提高投糖量、控制培养风量，在保证培养所需的氧气量同时，控制发酵过程中培养温度、pH值等，提高了L-丙氨酸发酵产酸率，缩短了发酵周期。

CN109468254A采用基因工程方法对菌株进行了修饰，对筛选得到在高浓度葡萄糖下生长产酸的突变株FMME-A232进行改造，强化葡萄糖的转运路径，使用pEtac质粒串联表达葡萄糖转运蛋白EI蛋白和EIIAClc蛋白得到大肠杆菌重组菌，该大肠杆菌重组菌能够提高葡萄糖的消耗速率，使得该菌株发酵周期由55h降至45h，提高了L-丙氨酸的生产效率。

CN109055451A公开了一种L-丙氨酸的生物发酵方法，包括如下步骤：采用种子培养基培养L-丙氨酸菌株，所述种子培养基中采用酵母浸粉和硫酸铵作为氮源。本发明通过优化种子培养阶段的发酵工艺，提高种子的活力，进而有效提高了L-丙氨酸的生产强度，而且不会额外增加原料成本。通过优化种子培养阶段的发酵工艺，包括优化培养基和发酵模式，提高了L-丙氨酸的生产强度，降低了生物制备L-丙氨酸的生产成本，发酵周期缩短为25h。

现有技术对发酵法的改进大多是针对缩短发酵周期和提高产率两点进行。但是，每一个发酵周期都需要微生物种子培养液，微生物的种子培养提高了一个发酵周期的成本，增加了操作程序，降低了生产效率。

发明内容

本发明目的在于提高发酵生产强度，进而降低发酵丙氨酸的生产成本。

本发明是通过如下技术方案来实现的。

氨基酸高效绿色生产提取工艺，其包括

收L-丙氨酸发酵液，离心，收集上清液；将上清液通过陶瓷膜进行微滤，收集滤过液；往滤过液中添加活性炭脱色，板框过滤，收集脱色液；然后通过732型强酸性阳离子交换树脂，L-丙氨酸被交换到树脂上，随后用氨水将树脂上的L-丙氨酸完全洗脱下来，通过浓缩结晶、离心、干燥获得成品。

具体地，所述L-丙氨酸发酵液的制备方法为：

1）将产L-丙氨酸的大肠杆菌种子液接种至含有基础发酵培养基的发酵罐后，开始发酵，发酵时间为45h，发酵罐中的发酵液泵入微滤膜内，细胞被截留返回到发酵罐，含有丙氨酸的发酵液从微滤膜中透析出来，被收集到收集罐；

2）激活培养基进入发酵罐，开始第二批发酵，发酵时间为35h，发酵罐中的发酵液泵入微滤膜内，细胞被截留返回到发酵罐，含有丙氨酸的发酵液从微滤膜中透析出来，被收集到收集罐；

3）激活培养基进入发酵罐，开始第三批发酵，发酵时间为35h，发酵罐中的发酵液泵入微滤膜内，细胞被截留返回到发酵罐，含有丙氨酸的发酵液从微滤膜中透析出来，被收集到收集罐；

4）激活培养基进入发酵罐，开始第四批发酵，发酵时间为25h，发酵罐中的发酵液泵入微滤膜内，细胞被截留返回到发酵罐，含有丙氨酸的发酵液从微滤膜中透析出来，被收集到收集罐；

整个发酵过程中，当发酵液中葡萄糖浓度低于5g/L时，流加葡萄糖溶液使得发酵液中的葡萄糖浓度维持在5-10 g/L，自动流加氨水保持pH 7.0±0.3。

优选地，所述离心为：用碟片式离心机以4000rpm离心5min。

优选地，所述陶瓷膜的截留分子量为1万Da，

优选地，所述脱色为：活性炭的添加量为1g：100ml过滤液，脱色温度为60℃，脱色时间为60min。

进一步地，所述基础发酵培养基组分为：葡萄糖80g/L，玉米浆20g/L，氯化铵5g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L，氯化钙0.1g/L，一水硫酸锰10mg/L，生物素100μg/L。

进一步地，所述激活培养基的组分为：在基础发酵培养基的基础上添加天冬氨酸、碳酸镁以及乳糖任意二者以上的组合物

优选地，所述激活培养基的组分为：基础发酵培养基+天冬氨酸+碳酸镁+乳糖。

更优选地，所述激活培养基的组分为：基础发酵培养基+天冬氨酸1g/L+碳酸镁0.5g/L+乳糖2g/L。

与现有技术的发酵提取工艺相比，本发明采用分批发酵生产丙氨酸取得的优点和积极效果为：

1、本发明生产工艺中，使用了细胞循环使用的循环分批发酵技术，在下一批发酵中生物量大，形成高密度发酵，高密度发酵导致发酵周期缩短，生产强度提高。

2.由于菌体细胞被回收，循环利用，所以循环分批发酵只需要一次种子培养过程，节约率大量时间和物质、能量。

3.采用循环分批发酵可以连续进行很长时间，减少了以往批与批之间清洗灭菌发酵罐的过程，减少非生产时间。

4.发酵过程与提取过程耦合，及时分离代谢产物，减少产物反馈抑制，有利于保持细胞活性，提高生产效率。

5．本发明通过对培养基进行优化，添加了天冬氨酸、碳酸镁以及乳糖，三者协同效果强，对大肠杆菌有明显的生长促进作用，维持了菌株生物量的持续增长，保证了菌株的产酸活力。

附图说明

图1：不同培养基对菌株活力的影响。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

实施例1

利用大肠杆菌发酵获得含丙氨酸发酵

一、实验方法

菌种：以大肠杆菌E.coli MG1655为试验菌株。

菌种活化：

将菌株从-80℃冰箱拿出保菌管，试管斜面活化培养2代，32℃培养箱培养16h，至试管斜面上布满菌苔；

种子培养：

活化好的菌种传代接种至茄形瓶中，32℃培养12h，然后用无菌水洗下接种至包含3L种子培养基的5L种子罐中，进行一级种子扩培，自动控制温度32±0.5℃、通过通气流量和搅拌转速调节溶解氧30±10%、通过耦连pH电极自动流加25%氨水保持pH 7.0±0.3，培养20h至OD₆₀₀=25，为一级种子。显微镜镜检无杂菌，按照10%比例接种至包含20L种子培养基得30L种子罐，进行二级种子扩培，方法同上。待二级种子培养至OD₆₀₀=25时，镜检无杂菌，按照10%接种至包含120L发酵培养基200L发酵罐。

活化和种子培养时使用的培养基为：葡萄糖25g/L，酵母粉10g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，七水硫酸镁0.4g/L，一水硫酸锰10mg/L，维生素B₁0.1mg/L。

分批补料发酵：

二级种子接种至含有120L发酵培养基的200L发酵罐后，开始发酵。当发酵液中葡萄糖浓度低于5g/L时，流加80%（m/v）葡萄糖溶液，时发酵液中的葡萄糖浓度维持在5-10 g/L。其他方法同种子培养。

基础发酵培养基为：葡萄糖80g/L，玉米浆20g/L，氯化铵5g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L，氯化钙0.1g/L，一水硫酸锰10mg/L，生物素100μg/L。

第1批次使用基础发酵培养基，第2-4批次使用激活培养基。

循环分批发酵：

循环分批发酵实验装置主要包括一个发酵罐，一套陶瓷微滤膜，三个补料罐（葡萄糖、氨水和培养基）和一个收集罐。

在本批发酵结束后，发酵罐中的发酵液连续泵入陶瓷微滤膜内，细胞被截留返回到发酵罐（细胞被浓缩），含有丙氨酸的发酵液从微滤膜中透析出来，被收集到收集罐。然后新鲜的发酵培养基进入发酵罐，开始新一批发酵。

分离提取：

收集丙氨酸发酵液，用碟片式离心机以4000rpm离心5min，收集上清液和菌体沉淀，菌体沉淀进入饲料加工工序；将上清液通过陶瓷膜进行微滤，截留分子量为1万Da，收集滤过液；往滤过液中添加活性炭，添加量为1g：100ml，脱色温度为60℃，脱色时间为60min，板框过滤，收集脱色液；然后通过732型强酸性阳离子交换树脂(H+型)，L-丙氨酸被交换到树脂上，随后用4％的氨水将树脂上的L-丙氨酸完全洗脱下来，通过浓缩结晶、离心、干燥获得纯度为98%以上的L-丙氨酸成品。

二、检测方法

生物量：

浊度法：取1mL发酵液稀释若干倍,利用可见光分光管光度计在600nm波长下测定光吸收值（梯度稀释至光吸收值为0.2-0.8之间），生物量（OD₆₀₀）=光吸收值*稀释倍数。

温度、溶氧与pH:

利用种子罐和发酵罐自身配备温度电极、溶氧电极和pH电极检测，使用前需标定。各电极依次关联冷却水、搅拌转速和氨水自动控制各参数。

丙氨酸浓度：

采用高效液相分析系统测定。

三、实验结果

为了提高大肠杆菌的生长周期和代谢活力，本研究配置了激活培养基，采用多种激活因子（钙、镁、铁、锌等无机盐，各种氨基酸，不同的碳源，各种稀土元素）对生物量的影响进行了测试，菌株为第一批发酵后的菌体，研究发现，镁离子、天冬氨酸、镝离子以及乳糖对菌体活力有一定的促进作用，但是考虑到镝离子对人体可能具备一定的危害，后续试验不在使用镝。

激活培养基配方是在基础培养基的基础上添加大肠杆菌激活因子，见表1（1为添加，0为不添加）：

表1

[0001] 激活因子浓度	[0002] 组合1	[0003] 组合2	[0004] 组合3	[0005] 组合4
					[0006] 天冬氨酸1g/L	[0007] 1	[0008] 1	[0009] 0	[0010] 1
[0011] 碳酸镁0.5g/L	[0012] 1	[0013] 0	[0014] 1	[0015] 1
					[0016] 乳糖2g/L	[0017] 0	[0018] 1	[0019] 1	[0020] 1

如图1所示，组合4能够在80h以内维持菌株持续增长，保持较好的活力，能够应用于继续发酵产丙氨酸，而基础培养基无法继续激活菌株的活力，组合1-3对菌株生物量也有一定的正向激活作用，但是效果不如组合4。采用组合4的培养基继续发酵，使得丙氨酸的连续生产成为可能。

表2 循环分批发酵参数

如表2所示，进行循环分批发酵，在140 h内共进行发酵4批，其中第一批可以认为分批补料发酵，各批次最终丙氨酸浓度基本保持在70g/L上下不变，其中第四批次有所降低，为68 g/L，第五批次的产量较第四批次下降了40%，无法继续进行发酵。由于细胞通过陶瓷微滤膜被回收，造成各批次细胞生物量不断增加，到第四批时生物量OD₆₀₀=220，比分批补料发酵提高了90%以上，即为高密度发酵方式。同时由于高密度发酵，使发酵时间缩短且越来越短，分批补料发酵发酵周期45h，第二、三批发酵周期35h；第四批发酵周期25h。各批次生产强度和底物转化率不断提高。第四批生产强度最大，为2.72g/L/h，比分批补料发酵提高72.4%。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。