一种中和eb病毒的单克隆抗体及其应用

文档序号：1264401 发布日期：2020-08-25 浏览：24次 >En<

阅读说明：本技术 一种中和eb病毒的单克隆抗体及其应用 (Monoclonal antibody for neutralizing EB virus and application thereof ) 是由曾木圣张林琦朱倩莹梁清泰左亚男于 2020-04-30 设计创作，主要内容包括：本发明首次公开了一种EB病毒的抗体,由轻链和重链组成,所述重链的重链可变区中具有3个互补区CDR1、CDR2和CDR3,其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～3所示,所述轻链的轻链可变区中具有3个互补区CDR1’、CDR2’和CDR3’,其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、GNN、SEQ ID NO.5所示。该抗体能够阻断EBV感染B细胞,IC50为203ng/ml,而对埃博拉病毒感染无中和效果,说明该抗体具有很高的特异中和EBV感染B细胞的能力。(The invention discloses an antibody of EB virus for the first time, which consists of a light chain and a heavy chain, wherein the heavy chain variable region of the heavy chain is provided with 3 complementary regions CDR1, CDR2 and CDR3, the amino acid sequences of the complementary regions are respectively shown as SEQ ID No. 1-3, and the light chain variable region of the light chain is provided with 3 complementary regions CDR1 ', CDR2 ' and CDR3 ', the amino acid sequences of the complementary regions are respectively shown as SEQ ID No.4, GNN and SEQ ID No. 5. The antibody can block EBV from infecting B cells, IC50 is 203ng/ml, and the antibody has no neutralization effect on Ebola virus infection, which indicates that the antibody has high capacity of specifically neutralizing EBV infected B cells.)

一种中和EB病毒的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，更具体地，涉及一种中和EB病毒的单克隆抗体S54及其应用。

背景技术

EB病毒最早于1964年由Epstein和Barr从Burkitt淋巴瘤细胞中成功培养并建株。EBV属于γ亚型疱疹病毒，是首个被发现的人类致癌病毒。EBV在人群中的感染非常普遍，据报道全球约有95％以上的成年人携带有EBV。在儿童和青少年中，EBV感染多造成传染性单核细胞增多症。EBV的潜伏感染与人类多种淋巴肿瘤和上皮肿瘤发生有关，如霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤及NK/T细胞淋巴瘤等，上皮肿瘤包括鼻咽癌和大约10％的胃癌等。而对于器官移植病人以及艾滋病患者等免疫抑制病人来说，罹患EBV相关肿瘤的概率大大增加。据统计，全球每年新增约200000例EBV相关的肿瘤病例,美国NIH已于2016年正式将EBV列入第14版致癌物名录。

目前针对EB病毒尚无有效的疫苗，由EBV感染引起的疾病也缺乏特异的治疗手段。传染性单核细胞增多症的治疗大多应用抗病毒药物如阿昔洛韦等，虽然可一定程度上缓解症状，但并不能消除B淋巴细胞内及咽喉部上皮的EB病毒。EBV相关肿瘤的治疗主要为化疗和放疗，但对于复发或转移的患者来说，疗效较差。

单克隆抗体可大量生产，其与抗原结合的高亲和性和高特异性，大大减少了临床应用时的不良反应。同时可以对抗体分子进行改造以增加其抗病毒效力。抗体以其特异性和使用的灵活性成为感染性疾病治疗中非常有前景的手段。而至今仍未有针对EBV囊膜糖蛋白的人源单克隆抗体上市。因此开发抗EBV的人源单克隆抗体，将为EBV感染相关疾病提供更有效的预防和治疗手段。

发明内容

本发明第一个方面的目的，在于利用EB病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)膜蛋白gp350(glycoprotein 350)作为钓饵，筛选展示在酵母表面的人类非免疫单链可变区抗体片段(single chain variable fragment,scFvs)文库，得到可同gp350蛋白特异结合的单克隆抗体。通过EB病毒感染细胞模型，筛选得到了具有中和活性的单克隆抗体。

本发明第二个方面的目的，在于提供编码本发明第一个方面所述抗体的核苷酸序列。

本发明第三个方面的目的，在于提供含有本发明第二个方面所述的核苷酸序列的转基因细胞系。

本发明第四个方面的目的，在于提供一种治疗与EB病毒相关疾病的药物，所述药物的活性成分为本发明第一个方面所述的抗体。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种中和EB病毒的抗体，由轻链和重链组成，所述重链的重链可变区中具有3个互补区CDR1、CDR2和CDR3，其中，CDR1的氨基酸序列为GYTFTTYY(SEQ ID NO.1)，CDR2的氨基酸序列为INPSVGSA(SEQ ID NO.2)，CDR3的氨基酸序列为ARVGPSRYSTSSPY(SEQ ID NO.3)；所述轻链的轻链可变区中具有3个互补区CDR1’、CDR2’和CDR3’，其中，CDR1’的氨基酸序列为SSNIGSNT(SEQ ID NO.4)，CDR2’的氨基酸序列为GNN，CDR3’的氨基酸序列为SSYTSSSSLV(SEQ ID NO.5)。

根据本发明第一个方面所述的抗体，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.11所示。

根据本发明第一个方面所述的抗体，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.13所示。

根据本发明第一个方面所述的抗体，所述抗体的重链的氨基酸序列如SEQ IDNO.15所示。

根据本发明第一个方面所述的抗体，所述抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO.17所示。

本发明的第二个方面，提供一种编码本发明第一个方面所述抗体的核苷酸序列。

根据本发明第二个方面所述的核苷酸序列，编码重链可变区中3个互补区CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。

根据本发明第二个方面所述的核苷酸序列，编码轻链可变区中3个互补区CDR1’的核苷酸序列为AGCTCCAACATCGGAAGTAATACT(SEQ ID NO.9)、CDR2’的核苷酸序列为GGTAATAAT、CDR3’的核苷酸序列为AGCTCATATACAAGCAGCAGCAGTCTGGTC(SEQ ID NO.10)。

根据本发明第二个方面所述的核苷酸序列，编码所述抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

根据本发明第二个方面所述的核苷酸序列，编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

根据本发明第二个方面所述的核苷酸序列，编码所述抗体重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。

根据本发明第二个方面所述的核苷酸序列，编码所述抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

本发明的第三个方面，提供含有本发明第二个方面所述核苷酸序列的转基因细胞系。

本发明的第四个方面，提供一种治疗与EB病毒相关疾病的药物，所述药物的活性成分为本发明第一个方面所述的抗体。

本发明的有益效果是：

本发明首次公开了一种中和EB病毒的抗体，通过酵母表面的人类非免疫单链可变区抗体片段(single chain variable fragment,scFvs)文库中分离特异性结合抗原的酵母单克隆，然后进行单克隆抗体基因的克隆和结构功能研究以及筛选。既避免了由于抗原免疫、杂交瘤融合和单克隆抗体筛选所需要的漫长过程，也可以大大降低动物来源抗体所引起的副作用。

本发明采用该方法，利用gp350筛选展示在酵母表面的人类非免疫单链可变区抗体片段文库，获得可以特异性结合抗原的酵母单克隆，获得抗体可变区基因，然后将抗体可变区基因克隆到含有对应恒定区的真核细胞表达载体上并转染293T细胞，即可得到同gp350蛋白特异结合的单克隆抗体。然后通过EB病毒感染细胞模型，筛选得到了具有抗EBV中和活性的单克隆抗体。

本发明提供的该中和EB病毒的抗体能够阻断EBV感染B细胞，IC50为203ng/ml，而对埃博拉病毒的感染无中和效果，说明该抗体具有很高的特异中和EBV感染B细胞的能力。，

附图说明

图1实施例3中S54抗体对EBV感染Raji细胞的中和效果。

图2实施例3中S54抗体对埃博拉假病毒感染Huh7细胞的中和效果。

具体实施方式

(1)EBV gp350重组蛋白的制备。

将编码EBV gp350蛋白的基因片段在哺乳动物细胞表达系统进行表达和纯化。重组抗原蛋白C端带有6×His-avi tag，使用镍柱进行gp350蛋白的亲和纯化。

(2)利用酵母表面展示scFv筛选技术，筛选获得同gp350蛋白特异结合的酵母单克隆。

从正常人体内分别扩增出的抗体重链和轻链可变区，中间通过G4S linker将两者连在一起构建到酵母展示载体上，即构建成功酵母表面展示scFv文库(本实验使用的酵母表面展示scFv文库来自Michael J.实验室)。将标记有生物素的gp350与酵母表面展示scFv文库共孵育，通过流式分选得到与gp350反应的阳性scFv酵母克隆。提取酵母克隆中scFv表达载体,再分别利用重链轻链特异性引物进行巢式PCR，测序得到抗体基因。

(3)单克隆抗体的表达纯化。

将筛选得到的抗体重链可变区上游与CMV片段、下游与人IgG1的恒定区以及ployA片段，进行overlapping PCR，得到可以表达完整重链的片段；将筛选得到的抗体轻链可变区上游与CMV片段、下游与轻链κ/λ的恒定区以及ploy A片段，进行overlapping PCR，得到可以表达完整轻链的片段。然后将这两个片段构建到PMD18T(Takara)载体中。将带有抗体重链和轻链全长序列的PMD18T质粒共转染293T细胞进行抗体的表达，用protein A beads进行抗体的纯化。

(4)抗体的中和活性检测。

EBV中和抗体的检测采用病毒感染细胞模型进行。将表达纯化的全长抗体按照一定的倍比稀释后同EB病毒共同孵育；将EBV相应的易感细胞铺至上述的共孵育体系中，培养细胞至48-72小时；感染后的细胞，用流式细胞仪检测GFP阳性的细胞比例；利用Prism 5软件计算单克隆抗体的IC50。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的阐述。所举实例只用于解释和理解本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1 EBV gp350重组蛋白的制备

gp350蛋白在EBV B细胞的过程中发挥重要作用。因此，发明人的研究团队选择gp350作为诱饵蛋白来筛酵母表面展示scFv文库，以期获得能阻断EBV感染的中和性抗体。

然后选用EBV-M81毒株的基因组为模板，扩增gp350的序列。

gp350的DNA序列：

ATGCCCATGGGGTCTCTGCAACCGCTGGCCACCTTGTACCTGCTGGGGATGCTGGTCGCTTCCTGCCTCGGAATGGAGGCAGCCTTGCTTGTGTGTCAGTACACCATCCAGAGCCTGATCCATCTCACGGGTGAAGATCCTGGTTTTTTCAATGTTGAGATTCCGGAATTCCCATTTTACCCCACATGCAATGTTTGTACGGCAGATGTCAATGTAACTATCAATTTCGATGTCGGGGGCAAAAAGCATCAACTTGATCTTGACTTTGGCCAGCTGACACCCCATACGAAGGCTGTCTACCAACCTCGAGGTGCATTTGGTGGCTCAGAAAATGCCACCAATCTCTTTCTACTGGAGCTCCTTGGTGCAGGAGAATTGGCTCTAACTATGCGGTCTAAGAAGCTTCCAATTAACGTCACCACCGGAGAGGAGCAACAAGTAAGCCTGGAATCTGTAGATGTCTACTTTCAAGATGTGTTTGGAACCATGTGGTGCCACCATGCAGAAATGCAAAACCCCGTGTACCTGATACCAGAAACAGTGCCATACATAAAGTGGGATAACTGTAATTCTACCAATATAACGGCAGTAGTGAGGGCACAGGGGCTGGATGTCACGTTACCCTTAAGTTTGCCAACGTCAGCTCAAGACTCGAATTTCAGCGTAAAAACACAAATGCTCGGTAATGAGATAGATATTGAGTGTATTATGGAGGATGGCGAAATTTCACAAGTTCTGCCCGGAGACAACAAATTTAACATCACCTGCAGTGGATACGAGAGCCATGTTCCCAGCGGCGGAATTCTCACATCAACGAGTCCCGTGGCCACCCCAATACCTGGTACAGGGTATGCATACAGCCTGCGTCTGACACCACGTCCAGTGTCACGATTTCTTGGCAATAACAGTATCCTGTACGTGTTTTACTCTGGGAATGGACCGAAGGCGAGCGGGGGAGATTACTGCATTCAGTCCAACATTGTGTTCTCTGATGAGATTCCAGCTTCACAGGACATGCCGACAAACACCACAGACATCACATATGTGGGTGACAATGCTACCTATTCAGTGCCAATGGTCACTTCTGAGGACGCAAACTCGCCAAATGTTACAGTGACTGCCTTTTGGGCCTGGCCAAACAACACTGAAACTGACTTTAAGTGCAAATGGACTCTCACCTCGGGGACACCTTCGGGTTGTGAAAATATTTCTGGTGCATTTGCGAGCAATCGGACATTTGACATTACTGTCTCGGGTCTTGGCACGGCCCCCAAAACACTCATTATCACACGAACGGCTACCAATGCCACCACAACAACCCACAAGGTTATATTCTCCAAGGCACCCCATCATCACCATCACCACGGTCTGAACGACATCTTCGAGGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAA(SEQ ID NO.19)。

真核细胞表达载体的构建

将gp350基因片段连入哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1+，方法如下：

1)gp350蛋白基因的扩增

将gp350蛋白本身的信号肽替换为CD5信号肽(signal peptide,SP)，并在信号肽前面加入KOZAK序列，以增强蛋白的表达。蛋白在哺乳动物细胞表达并分泌的过程中信号肽将被切除。由于蛋白存在跨膜区将无法分泌表达出来，因此gp350蛋白的跨膜区不包括在表达蛋白基因内。最后在蛋白末端加入6×His-avi tag，用于后续的纯化操作。因此，重组蛋白的构建为SP-gp350-his-avi。

以EBV-M81-BAC DNA为模板，用下面的引物对gp350进行扩增：

gp350正向引物：

TAGTCCAGTGTGGTGGAATTCGCCACCATGCCCATGGGGTCTCTGCAACCGCTGGCCACCTTGTACCTGCTGGGGATGCTGGTCGCTTCCTGCCTCGGAATGGAGGCAGCCTTGCTTG(SEQ ID NO.20)。

gp350反向引物：

GCCCTCTAGACTCGAGCGGCCGCTTATTCGTGCCATTCGATTTTCTGAGCCTCGAAGATGTCGTTCAGACCGTGGTGATGGTGATGATGGGGTGCCTTGGAGAATATAAC(SEQ ID NO.21)。

选用50μl的PCR反应体系：

扩增完成的目的片段通过琼脂糖凝胶电泳分析，在紫外灯下切割正确分子量的条带，按照试剂盒说明书操作回收PCR产物。

2)目的片段和载体的酶切与连接：

载体使用真核表达质粒pcDNA3.1+。目的片段和载体都采用EcoRI和NotI进行酶切，使用50μl的反应体系：

酶切在37℃进行，时间为3～5hr。片段使用DNA纯化试剂盒回收，载体酶切跑胶后进行胶回收。

使用20μl的体系进行连接反应，反应在37℃进行30min：

3)连接产物的转化

将连接产物加入刚刚融化的DH5α感受态细胞；冰上放置30min；42℃热激90s，放回冰上5min；加入200μl LB培养基于30℃慢摇复苏40min；吸取培养液涂布在氨苄抗性的LB平板上，37℃培养过夜。

4)阳性克隆的筛选

挑取单个菌落接种于5ml加有氨苄的培养基中培养约12hr；使用质粒小提试剂盒提取质粒；酶切鉴定获取阳性克隆；测序验证，获得完全正确的重组质粒。大量提取质粒。

将编码EBV gp350蛋白的基因片段在哺乳动物细胞表达系统进行表达和纯化。重组抗原蛋白C端带有6×His-avi tag，使用镍柱进行gp350蛋白的亲和纯化。

重组蛋白的表达和提取

293F细胞培养至1L，细胞密度至1.5×10^6/ml时用PEI转染试剂转染。将100mlDMEM培养基中加入1mg重组质粒与5ml 1mg/ml PEI充分震荡混匀，室温放置20min后，加入细胞中。培养5天后收细胞上清，4000rpm离心30min，弃去细胞沉淀，上清中含有目的蛋白。

gp350重组蛋白纯化

1)亲和层析

gp350重组蛋白C端带有6×His-avi tag，可以使用镍柱进行亲和纯化。

在高速离心后的上清液中加入镍柱beads，4℃孵育过夜；低速离心除去上清；用含有20mM咪唑的上样缓冲液共100mL淋洗beads；用5个柱体积的含有250mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白。

2)凝胶过滤层析

使用30kD浓缩管对镍柱洗脱的蛋白进行浓缩，至体积小于1ml；样品使用superdex200柱纯化。

最终获得的氨基酸序列：

MPMGSLQPLATLYLLGMLVASCLGMEAALLVCQYTIQSLIHLTGEDPGFFNVEIPEFPFYPTCNVCTADVNVTINFDVGGKKHQLDLDFGQLTPHTKAVYQPRGAFGGSENATNLFLLELLGAGELALTMRSKKLPINVTTGEEQQVSLESVDVYFQDVFGTMWCHHAEMQNPVYLIPETVPYIKWDNCNSTNITAVVRAQGLDVTLPLSLPTSAQDSNFSVKTQMLGNEIDIECIMEDGEISQVLPGDNKFNITCSGYESHVPSGGILTSTSPVATPIPGTGYAYSLRLTPRPVSRFLGNNSILYVFYSGNGPKASGGDYCIQSNIVFSDEIPASQDMPTNTTDITYVGDNATYSVPMVTSEDANSPNVTVTAFWAWPNNTETDFKCKWTLTSGTPSGCENISGAFASNRTFDITVSGLGTAPKTLIITRTATNATTTTHKVIFSKAPHHHHHHGLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO.22)。

gp350重组蛋白的生物素标记

利用试剂EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin(Thermo公司)对gp350蛋白进行生物素标记。在浓度为2mg/ml的gp350中加入10mM biotin试剂，室温反应30min。最后用PBS对反应体系进行透析。

实施例2 酵母文库的筛选

利用酵母文库筛选技术，获得同gp350蛋白特异结合酵母阳性克隆。

(1)材料与设备

酵母表面展示人类非免疫scFv文库是从58个正常人的脾和淋巴结的淋巴细胞内分别扩增出的抗体重链和轻链可变区，中间通过3个G₄S linker将两个基因连在一起构建到酵母展示载体上，即构建成功酵母表面展示scFv文库，该文库的库容量为10⁹(本实验使用的酵母表面展示scFv文库来自Michael J.实验室)；Omega酵母质粒小提试剂盒；Amp+平板；LB培养基；streptavidin-microbeads(miltenyi biotec)；anti-biotin-microbeads(miltenyi biotec)；streptavidin-APC(ebioscience)；anti-biotin-PE(ebioscience)；YPD培养基；SDCAA培养基；SDCAA平板；SGCAA培养基；Yeast strains EBY100；E.colistrains DH5α；pNL6 Plasmid；流式分选仪(Aril II，BD)。

(2)方法

1)诱导好的酵母细胞测OD后，取10¹⁰细胞，离心后，PBS洗1-2遍，再用10ml的PBS重悬并加入100nM的gp350-biotin蛋白。4℃孵育5-10分钟，PBS洗两遍后按照1：2500的稀释度加入streptavidin-microbeads，4℃孵育10分钟。PBS洗两遍，40mlPBS重悬后进行磁珠分选。分选下来的酵母细胞在SD-CAA培养基中扩增以及SG-CAA诱导后，进行第二轮磁珠分选，二抗换成anti-biotin-microbeads。第二轮分选得到的酵母阳性细胞直接取重新加入100nM的gp350蛋白，4℃孵育30分钟，PBS洗两遍，加入streptavidin-APC，4℃孵育30分钟，PBS洗两遍进行流式分选。分选得到的酵母细胞SD-CAA培养基中扩增以及SG-CAA诱导后，进行第二轮流式分选，二抗换成streptavidin-APC和anti-biotin-PE，观测是否有针对streptavidin-APC的酵母富集，得到与gp350结合的人源的scFv酵母阳性克隆。

2)取第三轮流式分选得到的scFv酵母混合液涂板SDCAA，挑取60个单克隆酵母菌落经SDCAA液体培养基扩增及SGCAA培养基诱导后，流式检测验证其与抗原结合活性。

实施例3 单克隆抗体的测序及表达纯化

(1)将实施例2中筛选得到与gp350结合的人源的scFv酵母阳性克隆，提取酵母中的质粒，并测序得到抗体基因。

(2)单克隆抗体的表达纯化。将筛选得到的抗体重链可变区上游与CMV片段、下游与人IgG1的恒定区以及ploy A片段，进行overlapping PCR，得到可以表达完整重链的片段；将筛选得到的抗体轻链可变区上游与CMV片段、下游与轻链κ/λ的恒定区以及ploy A片段，进行overlapping PCR，得到可以表达完整轻链的片段。然后将这两个片段构建到PMD18T(Takara)载体中。将含有来自同一个B细胞扩增出来的抗体重链和轻链全长序列的PMD18T质粒共转染293T细胞进行抗体的表达，用protein A beads进行抗体的纯化。

实施例4 抗体在EBV病毒感染细胞模型中的中和活性检测

1.EBV病毒的制备

(1)培养感染EBV-GFP的Akata细胞至密度为2*10^6/ml，在无血清的1640培养基中，加入终浓度为8ul/ml的羊抗人IgG，37℃，5％CO2环境中培养6h。

(2)6h后将细胞的培养基更换成含5％FBS的1640培养基，37℃，5％CO2环境中继续培养3天。

(3)3天后收取细胞上清，上清经过0.45um滤膜过滤后再用超高速离心机20000rpm，4℃离心2h。

(4)病毒沉淀用无血清的1640培养基重悬。

2.单克隆抗体的中和活性检测

单克隆抗体按照一定的倍比稀释后同EBV病毒在4℃共同孵育3h；

孵育后的病毒液加入到Raji细胞中，培养细胞至48-72小时；

制备Raji细胞悬液，用流式细胞仪检测GFP阳性细胞的百分比；利用Prism 5软件计算抗体的IC50。

3.中和实验检测结果

通过病毒中和能力验证，得到1株对具有中和EBV感染B细胞的抗体S54，其基本信息见表1，中和实验结果见图1和2。

表1 S54抗体序列基本信息

表1中列出了S54抗体的可变区序列信息，包括抗体家族分布、抗体胚系保守性及CDR3氨基酸序列。

从附图1和2的中和实验结果中可以看出，S54能阻断EBV感染B细胞，IC50为203ng/ml，而阴性对照抗体2G4不能阻断EBV感染B细胞。说明S54抗体具有很高的中和EBV感染B细胞的能力。

S54全长重链共470氨基酸，序列如下所示：

其中下划线部分为重链可变区的氨基酸序列；下划线且加粗部分为重链可变区中3个互补区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。

S54全长重链的编码基因共2499个碱基，序列如下所示：

其中下划线部分为重链可变区的核苷酸序列；下划线且加粗部分为重链可变区中3个互补区CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列；下划线且斜体部分为启示、终止密码子。

S54全长轻链共234氨基酸，序列如下所示：

其中下划线部分为轻链可变区的氨基酸序列；下划线且加粗部分为轻链可变区中3个互补区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。

S54全长轻链的编码基因共1741个碱基，序列如下所示：

其中下划线部分为轻链可变区的核苷酸序列；下划线且加粗部分为轻链可变区中3个互补区CDR1’、CDR2’和CDR3’的核苷酸序列；下划线且斜体部分为启示、终止密码子。

S54的重链的重链可变区中具有3个互补区CDR1、CDR2和CDR3，重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的SEQ ID NO.15自N末端第45-52位氨基酸残基、第70-77位氨基酸残基和第116-129位氨基酸残基(对应SEQ ID NO.15加粗部分序列)；轻链的轻链可变区中具有3个互补区CDR1’、CDR2’和CDR3’，轻链可变区中的CDR1’、CDR2’和CDR3’依次为序列表SEQ ID NO.17自N末端第46-51位氨基酸残基、第69-71位氨基酸残基和第108-116位氨基酸残基(对应SEQ ID NO.17的加粗部分序列)。

CDR1的氨基酸序列为：GYTFTTYY(SEQ ID NO.1)；

CDR2的氨基酸序列为：INPSVGSA(SEQ ID NO.2)；

CDR3的氨基酸序列为：ARVGPSRYSTSSPY(SEQ ID NO.3)；

CDR1’的氨基酸序列为：SSNIGSNT(SEQ ID NO.4)；

CDR2’的氨基酸序列为：GNN；

CDR3’的氨基酸序列为：SSYTSSSSLV(SEQ ID NO.5)。

编码CDR1、CDR2、CDR3、CDR1’、CDR2’和CDR3’的核苷酸序列如下所示：

CDR1的核苷酸序列为：GGATACACCTTCACCACATATTAT(SEQ ID NO.6)；

CDR2的核苷酸序列为：ATCAACCCCAGCGTTGGTAGCGCA(SEQ ID NO.7)；

CDR3的核苷酸序列为：

GCGCGAGTAGGTCCGTCAAGATATAGCACTTCGTCACCCTAC(SEQ ID NO.8)；

CDR1’的核苷酸序列为：AGCTCCAACATCGGAAGTAATACT(SEQ ID NO.9)；

CDR2’的核苷酸序列为：GGTAATAAT；

CDR3’的核苷酸序列为：AGCTCATATACAAGCAGCAGCAGTCTGGTC(SEQ ID NO.10)。

S54的重链可变区的氨基酸序列由序列表的SEQ ID NO.15自N末端第20至140位氨基酸残基组成，如下所示(对应SEQ ID NO.15中下划线部分序列)：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYYLHWMRQAPGEGLEWVGLINPSVGSASSAQKFKGRVTMTSDTSTSIAYLEVNSLTSEDTAVYYCARVGPSRYSTSSPYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.11)。

其核苷酸序列如下所示(对应SEQ ID NO.16中下划线部分序列)：

CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCACATATTATTTACACTGGATGCGTCAGGCCCCTGGAGAAGGGCTTGAGTGGGTGGGGCTAATCAACCCCAGCGTTGGTAGCGCAAGCTCCGCACAGAAGTTCAAGGGCAGAGTCACGATGACCAGCGACACGTCCACGAGCATTGCCTATTTGGAGGTAAACAGCCTGACATCTGAAGACACGGCCGTATATTATTGTGCGCGAGTAGGTCCGTCAAGATATAGCACTTCGTCACCCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ IDNO.12)。

S54的轻链可变区由序列表的SEQ ID NO.17自N末端第20至128位氨基酸残基组成，如下所示(对应SEQ ID NO.17中下划线部分序列)：

QLVLTQSPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYGNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSDDEADYYCSSYTSSSSLVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO.13)。

其核苷酸序列如下所示(对应SEQ ID NO.18中下划线部分序列)：

CAGCTTGTGCTGACTCAGTCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGACAGAGGGTCACCATCTCTTGTTCTGGAAGCAGCTCCAACATCGGAAGTAATACTGTAAACTGGTACCAGCAACTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGACGATGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATACAAGCAGCAGCAGTCTGGTCTTCGGCGGAGGGACCAAGCTCACCGTCCTA(SEQ ID NO.14)。

实施例5 抗体在埃博拉假病毒感染细胞模型中的中和活性检测

1.埃博拉(Ebola-Zaire)假病毒的制备

(1)利用埃博拉全长膜蛋白的真核表达质粒(pcDNA3.1+,购自Invitrogen公司)和骨架质粒pNL4-3R-E-luciferase共转染293T细胞；

(2)48小时后收集细胞上清，利用p24定量检测的ELISA试剂盒进行病毒滴度的测定。

2.单克隆抗体的中和活性检测

(4)单克隆抗体按照一定的倍比稀释后同埃博拉假病毒在37℃共同孵育1h；

(5)孵育后的病毒液加入到Huh7细胞中，培养细胞至48-72小时；

(6)裂解细胞Huh7；检测裂解液中的荧光素酶活性，利用Prism 5软件计算抗体的IC50。

3.中和实验检测结果

通过病毒中和能力验证，抗体S54对埃博拉假病毒没有中和能力，抗体2G4作为埃博拉假病毒中和的阳性对照。中和实验结果见图2。

从附图2中可以看出S54不能阻断埃博拉假病毒感染Huh7细胞，而2G4抗体作为阳性对照则能高效阻断埃博拉假病毒的感染，IC50为330ng/ml。综上所述，说明S54是一个对EBV具有高中和活性的特异性抗体。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学肿瘤防治中心(中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究

所）

<120> 一种中和EB病毒的单克隆抗体及其应用

<130>

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Tyr

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Ile Asn Pro Ser Val Gly Ser Ala

1 5

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Ala Arg Val Gly Pro Ser Arg Tyr Ser Thr Ser Ser Pro Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr

1 5

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Ser Leu Val

1 5 10

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggatacacct tcaccacata ttat 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atcaacccca gcgttggtag cgca 24

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcgcgagtag gtccgtcaag atatagcact tcgtcaccct ac 42

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agctccaaca tcggaagtaa tact 24

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agctcatata caagcagcag cagtctggtc 30

<210> 11

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Tyr Leu His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Leu Ile Asn Pro Ser Val Gly Ser Ala Ser Ser Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Ile Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Val Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Gly Pro Ser Arg Tyr Ser Thr Ser Ser Pro Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 12

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

caggtccagc ttgtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60

tcctgcaagg catctggata caccttcacc acatattatt tacactggat gcgtcaggcc 120

cctggagaag ggcttgagtg ggtggggcta atcaacccca gcgttggtag cgcaagctcc 180

gcacagaagt tcaagggcag agtcacgatg accagcgaca cgtccacgag cattgcctat 240

ttggaggtaa acagcctgac atctgaagac acggccgtat attattgtgc gcgagtaggt 300

ccgtcaagat atagcacttc gtcaccctac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360

tca 363

<210> 13

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser

85 90 95

Ser Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 14

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cagcttgtgc tgactcagtc accctcagcg tctgggaccc ccggacagag ggtcaccatc 60

tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga agtaatactg taaactggta ccagcaactc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat ggtaataatc agcggccctc aggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240

tctgacgatg aggctgatta ttactgcagc tcatatacaa gcagcagcag tctggtcttc 300

ggcggaggga ccaagctcac cgtccta 327

<210> 15

<211> 470

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Thr Tyr Tyr Leu His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Gly Leu Ile Asn Pro Ser Val Gly Ser Ala Ser Ser Ala

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Ile Ala Tyr Leu Glu Val Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Gly Pro Ser Arg Tyr Ser Thr Ser Ser Pro

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

130 135 140

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

145 150 155 160

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

165 170 175

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

195 200 205

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

210 215 220

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

225 230 235 240

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

245 250 255

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

260 265 270

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

275 280 285

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

290 295 300

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

305 310 315 320

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

325 330 335

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

340 345 350

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

355 360 365

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

370 375 380

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

385 390 395 400

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

405 410 415

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

420 425 430

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

435 440 445

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

450 455 460

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 16

<211> 2499

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 60

ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 120

tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 180

atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 240

ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 300

gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc 360

ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc 420

tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa 480

aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg 540

tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct 600

gttttgacct ccatagaaga caccgggacc gatccagcct ccgcggccgg gaacggtgca 660

ttggaacgcg gattccccgt gccaagagtg acgtaagtac cgcctataga gtctataggc 720

ccaccccctt ggcttcgtta gaacgcggct acaattaata cataacctta tgtatcatac 780

acatacgatt taggtgacac tatagaataa catccacttt gcctttctct ccacaggtgt 840

ccactcccag gtccaactgc acctcggttc tatcgattga attccaccat gggatggtca 900

tgtatcatcc tttttctagt agcaactgca accggtgtac attcccaggt ccagcttgtg 960

cagtctgggg ctgaggtgaa gaagcctggg gcctcagtga aggtttcctg caaggcatct 1020

ggatacacct tcaccacata ttatttacac tggatgcgtc aggcccctgg agaagggctt 1080

gagtgggtgg ggctaatcaa ccccagcgtt ggtagcgcaa gctccgcaca gaagttcaag 1140

ggcagagtca cgatgaccag cgacacgtcc acgagcattg cctatttgga ggtaaacagc 1200

ctgacatctg aagacacggc cgtatattat tgtgcgcgag taggtccgtc aagatatagc 1260

acttcgtcac cctactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctcagc gtcgaccaag 1320

ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 1380

ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaacctgtga cggtctcgtg gaactcaggc 1440

gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 1500

ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 1560

gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 1620

aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 1680

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 1740

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 1800

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 1860

gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1920

aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1980

cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 2040

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 2100

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 2160

ggctccttct tcctctatag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 2220

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 2280

tccctgtccc cgggtaaatg agtgcgacgg ccggcaagcc cccgctcccc gggctctcgc 2340

ggtcgtacga ggaaagcttg gccgccatgg cccaacttgt ttattgcagc ttataatggt 2400

tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct 2460

agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcat 2499

<210> 17

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 17

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ser Leu Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Gly Thr

20 25 30

Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile

35 40 45

Gly Ser Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser

85 90 95

Gly Leu Gln Ser Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr

100 105 110

Ser Ser Ser Ser Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

115 120 125

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

130 135 140

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

145 150 155 160

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

165 170 175

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

180 185 190

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

195 200 205

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

210 215 220

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

225 230

<210> 18

<211> 1741

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18