阅读说明：本技术 广谱抗微生物的介孔氧化硅席夫碱银配合物纳米材料及其制备方法 (Broad-spectrum antimicrobial mesoporous silica Schiff base silver complex nano material and preparation method thereof ) 是由 陈进 毕洪凯 蔡铃 黄衍强 王建明 刘巧 于 2020-04-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及广谱抗微生物的介孔氧化硅席夫碱银配合物纳米材料及其制备方法。该制备方法包括：制得氨基化介孔氧化硅,制得醛基化介孔氧化硅,制得介孔氧化硅席夫碱银配合物纳米材料成品。该纳米材料对多种细菌真菌具有杀灭作用,能达到广谱、高效、持续杀菌的效果,且在抗菌的同时能防止产生耐药菌株。(The invention relates to a broad-spectrum antimicrobial mesoporous silica Schiff base silver complex nano material and a preparation method thereof. The preparation method comprises the following steps: preparing aminated mesoporous silica, preparing aldehydized mesoporous silica, and preparing the finished product of the mesoporous silica Schiff base silver complex nano material. The nanometer material has the function of killing various bacteria and fungi, can achieve the effects of broad spectrum, high efficiency and continuous sterilization, and can prevent the generation of drug-resistant strains while resisting bacteria.)

广谱抗微生物的介孔氧化硅席夫碱银配合物纳米材料及其制 备方法

技术领域

本发明涉及一种广谱抗微生物的介孔氧化硅席夫碱银配合物纳米材料，以及该纳米材料的制备方法，属于抗微生物材料技术领域。

背景技术

据发明人所知，现有抗菌材料在合成时工艺较为复杂，需要消耗大量人力物力财力，这使其成本居高不下，不利于市场推广。同时，现有抗菌材料的杀菌作用对象有限，往往只对某种细菌有杀灭作用；杀菌持续时间短，难以长时间持续杀菌；大量使用后易产生耐药菌株，反而会威胁人类健康。此外，一些银基抗菌材料因含银量较高，对生物体危害大，不能直接作用于动物或人。因此，亟待研制出能克服以上缺点的抗微生物材料。

本发明的发明人课题组曾于2018年01月03日申请了名称为《纳米粒子复合材料、其合成方法及用途》的中国发明专利，其中记载的复合材料SBA-15/PDA/Ag具有抗菌效果。之后，在进一步的研究中，发明人课题组取得了新的研究成果，能够克服前文提到的现有材料缺点，因此，发明人课题组以该研究成果申请本发明专利。

发明内容

本发明的目的在于：克服现有技术存在的问题，提出一种广谱抗微生物的介孔氧化硅席夫碱银配合物纳米材料的制备方法，合成过程绿色、简单、快捷，所得材料对多种细菌真菌具有杀灭作用，实现广谱、高效、持续杀菌。同时，还提出由该制备方法制得的纳米材料，以及该纳米材料的用途。

本发明解决其技术问题的技术方案如下：

一种广谱抗微生物的介孔氧化硅席夫碱银配合物纳米材料的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

第一步、将介孔氧化硅分散于甲苯中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，于反应条件下反应；反应后，离心并收集固形物；将固形物洗涤、干燥后，得氨基化介孔氧化硅；

第二步、将氨基化介孔氧化硅分散于去离子水中，加入乙醛酸，于反应条件下反应；反应后，离心并收集固形物；将固形物洗涤、干燥后，得醛基化介孔氧化硅；

第三步、将ε-聚赖氨酸分散于无水乙醇中形成混合液，以氢氧化钾调节该混合液的酸碱度呈弱碱性，pH＝8.0±0.5；加入醛基化介孔氧化硅，于反应条件下反应；反应后，向混合液中加入可溶性银盐，然后继续反应；反应结束后，离心并收集固形物；将固形物洗涤、干燥后，得负载有银纳米粒子的ε-聚赖氨酸修饰介孔氧化硅，即介孔氧化硅席夫碱银配合物纳米材料成品。

该方法的合成过程绿色、简单、快捷，而且所需投入的银量较少，使制得的纳米材料中含银量也较低。该方法制得的纳米材料对多种细菌真菌具有杀灭作用，能达到广谱、高效、持续杀菌的效果，且在抗菌的同时能防止产生耐药菌株。而且，与之前发明人课题组发明的复合材料SBA-15/PDA/Ag相比，本发明制得的纳米材料对结核分枝杆菌的灭杀作用更加明显。

本发明进一步完善的技术方案如下：

优选地，第一步中，所述介孔氧化硅与甲苯的质量体积比为0.6±0.01g：80±5ml；所述3-氨丙基三乙氧基硅烷与甲苯的体积比为0.0025±0.001：1；加入3-氨丙基三乙氧基硅烷时逐滴加入；第一步的反应条件为：反应温度70℃±5℃，反应时间至少12小时，反应过程中持续搅拌；离心条件为：离心转速5000±500rpm，离心时间至少5分钟；洗涤条件为：采用乙醇、去离子水分别洗涤至少3次；干燥温度为60℃±5℃。

采用该优选方案，可进一步优化第一步中的各物料比例、各具体条件。其中，3-氨丙基三乙氧基硅烷即APTES。

优选地，第二步中，所述氨基化介孔氧化硅与去离子水的质量体积比为0.5±0.01g：100±10ml；所述乙醛酸与第一步的3-氨丙基三乙氧基硅烷的摩尔比大于1。

采用该优选方案，可进一步优化第二步中的各物料比例。其中，乙醛酸与第一步的3-氨丙基三乙氧基硅烷的摩尔比大于1，可确保投入过量的乙醛酸，以实现更好的反应效果。

优选地，第二步的反应条件为：反应温度40℃±5℃，反应时间至少6小时，反应过程中持续搅拌；离心条件为：离心转速5000±500rpm，离心时间至少5分钟；洗涤条件为：采用去离子水洗涤至少3次；干燥温度为60℃±5℃。

采用该优选方案，可进一步优化第二步中的各具体条件。

优选地，第三步中，所述ε-聚赖氨酸与无水乙醇的质量体积比为120±20mg：60±10ml，所述ε-聚赖氨酸的分子量为3000±500；所述醛基化介孔氧化硅与ε-聚赖氨酸的质量比为0.5-2：1；所述可溶性银盐为硝酸银，所述硝酸银与醛基化介孔氧化硅的质量比为1.4±0.2：1。

采用该优选方案，可进一步优化第三步中的各物料比例。其中，可溶性银盐的投入量明显少于SBA-15/PDA/Ag，这使得本发明制得的纳米材料含银量较低。

优选地，第三步的反应条件为：反应温度80℃±5℃，反应时间至少12小时，反应过程中冷凝回流；继续反应的反应条件为：反应温度80℃±5℃，反应时间至少30分钟，反应过程中冷凝回流；离心条件为：离心转速5000±500rpm，离心时间至少5分钟；洗涤条件为：采用无水乙醇、去离子水分别洗涤至少3次；干燥温度为60℃±5℃。

采用该优选方案，可进一步优化第三步中的各具体条件。

优选地，第一步中，所述介孔氧化硅为SBA-15，且其制备过程为：

S1.将P123加至去离子水中，搅拌至澄清；加入盐酸溶液并混匀；加入正硅酸乙酯并搅拌反应；

S2.将所得混合物移至高温反应釜中进行反应，之后于烘箱中老化，将所得固形物洗涤、干燥；

S3.将固形物研磨成粉，并煅烧即得SBA-15。

采用该优选方案，可进一步明确介孔氧化硅的具体制备过程。

本发明还提出：

采用前文所述制备方法制得的介孔氧化硅席夫碱银配合物纳米材料。

该纳米材料对多种细菌真菌具有杀灭作用，能达到广谱、高效、持续杀菌的效果，抗菌的同时能防止产生耐药菌株。

本发明还提出：

前文所述介孔氧化硅席夫碱银配合物纳米材料的用途，其特征是，所述用途为用于制备抗微生物剂。

该用途为前文所述纳米材料适用于抗微生物功能。

优选地，所述抗微生物剂针对的微生物包括白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、葡萄牙念珠菌、近平滑念珠菌、鲁克斯念珠菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肠沙门氏菌亚种、肺炎克雷伯菌、摩根氏摩根菌、嗜麦芽窄食单胞菌、奇异变形杆菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、卡他莫拉菌、肺炎链球菌、伴放线杆菌和结核杆菌。

采用该优选方案，可进一步明确针对的微生物种类。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明制备方法绿色、简单、快捷，由于所需投入的银量较少，使制得的纳米材料中含银量也较低。本发明纳米材料对多种细菌真菌具有杀灭作用，能达到广谱、高效、持续杀菌的效果，在抗菌的同时能防止产生耐药菌株。

附图说明

图1为本发明实施例4的扫描电镜图(A:SBA-15、B:CLA-1)和透射电镜图(C:SBA-15、D:CLA-1)。

图2为本发明实施例4中CLA-1的能量色散光谱图。

图3为本发明实施例4的CLA-1及各对照组的傅里叶红外光谱图。

图4为本发明实施例4的¹³C固体核磁共振谱图。

图5为本发明实施例5的对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌(共培养72小时后)的生长效果评价结果图。

图6为本发明实施例5的结核分枝杆菌(共培养42天后)的生长效果评价结果图。

图7为本发明实施例6的相应示意图。

图8为本发明实施例7的结果示意图。

图9为本发明实施例8的白念珠菌SC5314对CLA-1和氟康唑(FLC)的抗性发展结果图。

图10为本发明的主要方案图。

具体实施方式

下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。

实施例1

本实施例为制备介孔氧化硅SBA-15。

本实施例的基本制备过程包括：

S1.将P123加至去离子水中，搅拌至澄清；加入盐酸溶液并混匀；加入正硅酸乙酯并搅拌反应。

S2.将所得混合物移至高温反应釜中进行反应，之后于烘箱中老化，将所得固形物洗涤、干燥。

S3.将固形物研磨成粉，并煅烧即得SBA-15。

以下是作为示例的具体制备过程：

称取4.0克P123放入三颈烧瓶中，加入80毫升去离子水，在常温下搅拌至澄清；量取70毫升3.4M HCl加入到上述澄清溶液中，于40℃恒温搅拌1小时；搅拌状态下，逐滴加入9.14毫升正硅酸乙酯，于40℃继续恒温搅拌24小时；将上述反应液转移到高温反应釜中继续反应，之后于100℃烘箱中老化24小时，然后取固形物，分别用水、乙醇洗涤三次且离心去上清，干燥后研磨所得粉末再经550℃高温煅烧6小时去掉模板剂，即为介孔氧化硅SBA-15。保存备用于后续实施例。

实施例2

本实施例为制备醛基化介孔氧化硅。

本实施例的基本制备过程包括：

第一步、将实施例1所得介孔氧化硅分散于甲苯中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，于反应条件下反应；反应后，离心并收集固形物；将固形物洗涤、干燥后，得氨基化介孔氧化硅。记作NH₂-SBA-15。

其中，介孔氧化硅与甲苯的质量体积比为0.6±0.01g：80±5ml；3-氨丙基三乙氧基硅烷与甲苯的体积比为0.0025±0.001：1。加入3-氨丙基三乙氧基硅烷时逐滴加入；具体反应条件为：反应温度70℃±5℃，反应时间至少12小时，反应过程中持续搅拌；离心条件为：离心转速5000±500rpm，离心时间至少5分钟；洗涤条件为：采用乙醇、去离子水分别洗涤至少3次；干燥温度为60℃±5℃。

第二步、将第一步所得氨基化介孔氧化硅分散于去离子水中，加入乙醛酸，于反应条件下反应；反应后，离心并收集固形物；将固形物洗涤、干燥后，得醛基化介孔氧化硅。记作CHO-SBA-15。

其中，氨基化介孔氧化硅与去离子水的质量体积比为0.5±0.01g：100±10ml；乙醛酸与第一步的3-氨丙基三乙氧基硅烷的摩尔比大于1。具体反应条件为：反应温度40℃±5℃，反应时间至少6小时，反应过程中持续搅拌；离心条件为：离心转速5000±500rpm，离心时间至少5分钟；洗涤条件为：采用去离子水洗涤至少3次；干燥温度为60℃±5℃。

以下是作为示例的具体制备过程：

第一步、称取0.6克实施例1的SBA-15，分散于80毫升甲苯中，搅拌均匀后逐滴加入0.2毫升3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，70℃恒温油浴锅中持续搅拌12小时，5000rpm离心5分钟。去除上清液后用乙醇和去离子水分别洗涤3次，经60℃干燥，得氨基化介孔氧化硅，记作NH₂-SBA-15。

第二步、称取0.5克第一步所得NH₂-SBA-15，分散于100毫升去离子水中，加入过量乙醛酸(乙醛酸与第一步的3-氨丙基三乙氧基硅烷的摩尔比大于1，以确保过量)，40℃恒温搅拌6小时，所得混合物经5000rpm离心5分钟，去除上清，去离子水洗3次，经60℃烘干过夜，得醛基化介孔氧化硅，记作CHO-SBA-15。

实施例3

本实施例为制备ε-聚赖氨酸修饰介孔氧化硅，以及负载有银纳米粒子的ε-聚赖氨酸修饰介孔氧化硅。

本实施例的基本制备过程如下：

(1)制备ε-聚赖氨酸修饰介孔氧化硅：

将ε-聚赖氨酸分散于无水乙醇中形成混合液，以氢氧化钾调节该混合液的酸碱度呈弱碱性，pH＝8.0±0.5；加入实施例2所得醛基化介孔氧化硅，于反应条件下反应；反应结束后，离心并收集固形物；将固形物洗涤、干燥后，得ε-聚赖氨酸修饰介孔氧化硅。记作CHO-SBA-15/ε-PL。

(2)制备负载有银纳米粒子的ε-聚赖氨酸修饰介孔氧化硅：

将ε-聚赖氨酸分散于无水乙醇中形成混合液，以氢氧化钾调节该混合液的酸碱度呈弱碱性，pH＝8.0±0.5；加入实施例2所得醛基化介孔氧化硅，于反应条件下反应；反应后，向混合液中加入可溶性银盐，然后继续反应；反应结束后，离心并收集固形物；将固形物洗涤、干燥后，得负载有银纳米粒子的ε-聚赖氨酸修饰介孔氧化硅，即介孔氧化硅席夫碱银配合物纳米材料成品。记作CHO-SBA-15/ε-PL/Ag(又记作CLA-1)。

对于以上(1)、(2)中步骤相同的部分，分别采用相同的参数。

其中，ε-聚赖氨酸与无水乙醇的质量体积比为120±20mg：60±10ml，ε-聚赖氨酸的分子量为3000±500；醛基化介孔氧化硅与ε-聚赖氨酸的质量比为0.5-2：1；可溶性银盐为硝酸银，硝酸银与醛基化介孔氧化硅的质量比为1.4±0.2：1。

具体反应条件为：反应温度80℃±5℃，反应时间至少12小时，反应过程中冷凝回流；继续反应的反应条件为：反应温度80℃±5℃，反应时间至少30分钟，反应过程中冷凝回流；离心条件为：离心转速5000±500rpm，离心时间至少5分钟；洗涤条件为：采用无水乙醇、去离子水分别洗涤至少3次；干燥温度为60℃±5℃。

以下是作为示例的具体制备过程：

(1)制备ε-聚赖氨酸修饰介孔氧化硅：

称取120毫克ε-聚赖氨酸(ε-PL，分子量约为3000)分散到60毫升无水乙醇中搅拌均匀，加入适量氢氧化钾使混合物呈弱碱性，pH＝8.0±0.5；加入120毫克实施例2所得CHO-SBA-15，80℃下冷凝回流12小时；混合物离心(5000rpm下5分钟)，得到的沉淀经无水乙醇和去离子水分别洗涤3次后60℃干燥，得ε-聚赖氨酸修饰介孔氧化硅，记作CHO-SBA-15/ε-PL，是介孔氧化硅席夫碱。

(2)制备负载有银纳米粒子的ε-聚赖氨酸修饰介孔氧化硅：

称取120毫克ε-聚赖氨酸(ε-PL，分子量约为3000)分散到60毫升无水乙醇中搅拌均匀，加入适量氢氧化钾使混合物呈弱碱性，pH＝8.0±0.5；加入120毫克实施例2所得CHO-SBA-15，80℃下冷凝回流12小时；之后，向混合液中加入170mg的硝酸银，80℃回流30分钟，混合物离心(5000rpm下5分钟)，得到的沉淀经无水乙醇和去离子水分别洗涤3次后60℃干燥，得负载有银纳米粒子的ε-聚赖氨酸修饰介孔氧化硅，即介孔氧化硅席夫碱银配合物纳米材料成品，记作CHO-SBA-15/ε-PL/Ag(又记作CLA-1)，是介孔氧化硅席夫碱与银的配合物。

需要说明的是，本示例中硝酸银的投料量占总质量的百分比为41.5％，这基本可以代表本发明的硝酸银投料比例。而背景技术中提及的SBA-15/PDA/Ag，其硝酸银投料比例基本为45.0％，与之相比，本发明的硝酸银投料比例下降约7.8％，有明显下降。

实施例4

对实施例3制得的CLA-1进行特性鉴定，其结果包括扫描电镜(SEM)图、透射电镜(TEM)图、能量色散光谱图、BJH孔径分布测试结果、傅里叶红外光谱图、固体核磁共振谱图。鉴定时采用的对照组选自SBA-15、CHO-SBA-15、CHO-SBA-15/ε-PL。

以下为实施例3示例制得的CLA-1的各项特性鉴定结果(且各对照组：SBA-15由实施例1示例制得，CHO-SBA-15由实施例2示例制得，CHO-SBA-15/ε-PL由实施例3示例制得)：

图1为SBA-15和CLA-1的扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)图，从图中可以看出，SBA-15形貌规整，呈短棒状，经改性及负载ε-聚赖氨酸和银粒子后，短棒状规整结构没有明显改变，表明复合材料制备过程中不会改变SBA-15的形貌特征。透射电镜图可见，CLA-1上出现了黑色的银纳米粒子，表明银成功地进入到了介孔氧化硅的孔道中。

图2为CLA-1的能量色散光谱图，图中可见复合材料含有C、N、O、Si、Ag等元素并且Si和Ag元素分布一致，证明银粒子在介孔氧化硅的孔道中均匀分布。

表1记录了通过BJH孔径分布测试得到的SBA-15、CHO-SBA-15、CHO-SBA-15/ε-PL、以及CLA-1的孔径，可见，随着氨基和醛基的嫁接及ε-聚赖氨酸和银的负载，SBA-15的孔径逐步减小，表明SBA-15上醛基的成功嫁接以及各成分的成功负载。

表1.各样品孔径

图3为CLA-1及各对照组(SBA-15、CHO-SBA-15、CHO-SBA-15/ε-PL)的傅里叶红外光谱图，CLA-1在1558波数处出现新的C＝N特征峰，这是由席夫碱中氮的孤对电子与银离子配位后发生漂移所致。

图4为CHO-SBA-15和CHO-SBA-15/ε-PL的¹³C固体核磁共振谱图，图中可见ε-聚赖氨酸负载后173ppm处的醛基特征峰消失，同时在165ppm处出现了新的C＝N峰，进一步证明了席夫碱结构(-C＝N-)的形成。

此外，其它由实施例3制得的CLA-1的各项特性鉴定结果与以上结果相同或基本相同，且由各项特性鉴定结果得出的结论与以上结论相同。

实施例5

本实施例采用实施例3制得的CHO-SBA-15/ε-PL、CLA-1进行各项抗菌实验。

以下为采用实施例3示例制得的CHO-SBA-15/ε-PL、CLA-1的具体结果。

将CHO-SBA-15/ε-PL、CLA-1分别制成悬浊液、均匀涂布于固体培养基上，再用表面涂布法接种大肠杆菌(E.coli)或金黄色葡萄球菌(S.aureus)，在37℃下共培养，实验结果如图5所示。该结果表明，CHO-SBA-15/ε-PL并没有显示出明显的抗菌性能，而涂布了CLA-1的培养基可维持72小时无大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长。

将不同浓度的CHO-SBA-15/ε-PL、CLA-1分别涂布于斜面培养基后接种结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，培养42天后的结果如图6所示。该结果表明，高浓度的CLA-1对结核分枝杆菌具有明显的杀伤作用，而CHO-SBA-15/ε-PL在各浓度下均未能抑制结核分枝杆菌的生长。

此外，以相同浓度的背景技术提及的SBA-15/PDA/Ag、CLA-1与结核分枝杆菌共培养，观察并记录不同剂量下的菌落数。结果如表2所示，作用剂量为200μL时，两种复合物对结核分枝杆菌均呈现出明显的杀伤作用，而在较低剂量作用下，CLA-1处理组菌落数更少，表明CLA-1对结核分枝杆菌的生长具有明显更强的抑制作用。

表2.SBA-15/PDA/Ag和CLA-1与结核分枝杆菌共培养后的菌落计数结果

采用微量稀释法检测CLA-1对各种细菌的最低抑菌浓度(MIC)，按照美国CLSI抗菌药物敏感试验操作标准(2019版本)检测MIC，实验结果如表3所示，CHO-SBA-15/ε-PL在64μg/mL对各种细菌没有显示出抗菌活性，而CLA-1对各菌株的MIC在4-32μg/ml，包括大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肠沙门氏菌亚种、肺炎克雷伯菌、摩根氏摩根菌、嗜麦芽窄食单胞菌、奇异变形杆菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、卡他莫拉菌、肺炎链球菌和伴放线杆菌。

表3.CHO-SBA-15/ε-PL、CLA-1对各种细菌的抗菌活性

通过测定CHO-SBA-15/ε-PL、CLA-1的最低抑菌浓度(MIC)以评价其对白色念珠菌的体外抑菌活性，以常用抗真菌药物两性霉素B(AMB)作为阳性对照。结果如表4所示，CHO-SBA-15/ε-PL在64微克/毫升(μg/mL)对念珠菌没有显示出抗菌活性，而CLA-1对各菌株具有较阳性对照相同甚至更低的MIC。

表4.CHO-SBA-15/ε-PL、CLA-1和两性霉素B(AMB)对各种念珠菌的抗真菌活性

此外，其它由实施例3制得的CHO-SBA-15/ε-PL、CLA-1的各项实验结果与以上结果相同或基本相同，且由各项实验结果得出的结论与以上结论相同。

以上各项结果表明，CLA-1明显具有广谱长效杀菌效果，其针对的微生物包括白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、葡萄牙念珠菌、近平滑念珠菌、鲁克斯念珠菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肠沙门氏菌亚种、肺炎克雷伯菌、摩根氏摩根菌、嗜麦芽窄食单胞菌、奇异变形杆菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、卡他莫拉菌、肺炎链球菌、伴放线杆菌和结核杆菌。

实施例6

本实施例采用实施例3制得的CLA-1进行体内抗白色念珠菌检测,方法如下：

(1)感染和治疗时间见图7的A图。

(2)菌液配制

将菌株接种于沙氏琼脂培养基上，37℃培养48h，挑取新培养活化的白色念珠菌SC5314或YY1-4菌落溶于1640培养基中，置涡旋仪上震荡、混匀，OD530为2-3，菌悬液浓度约2～3×10⁷CFU/ml，现配现用。

(3)免疫抑制剂处理

由于免疫活性小鼠通常不会被白色念珠菌定植，因此在感染的同时，每天在颈背部皮下注射0.2ml氢化可的松(200mg/kg体重)，共4次注射，每天1次，使小鼠易患念珠菌病。

(4)感染接种

用水合氯醛0.2ml(无菌水溶解水合氯醛，浓度为4％)麻醉小鼠，将动物置于保持在37℃的电热毯上，将小棉球滴加白色念珠菌50μl(1-1.5×10⁶CFU/只)，将棉球放置在舌上60-90分钟。将动物置于仰卧位并监测直至它们从麻醉中恢复。

(5)模型评价

定植量检查：取小鼠舌头，破碎涂板，计算每克组织的定植量。

组织病理学检查：取小鼠舌头，10％福尔马林固定，进行组织病理学检查，分别进行HE和PAS染色。

(6)给药治疗

设置药物浓度和给药组，棉球蘸药液约80～100μl，CLA-1、两性霉素(AMB)、氟康唑(FLC)的药量为2.5mg/Kg，涂抹小鼠口腔、舌头，静置2-3分钟，每天涂抹1次，连续3天。

(7)治疗评价

第3次治疗后隔天取舌头作定植量检查，并做HE和PAS染色病理检查。

(8)治疗结果

结果如图7的B图、C图、D图所示，CLA-1治疗组明显优于AMB和FLC组，白色念珠菌定植量明显下降、舌头组织炎症减少，念珠菌黏附消失。

实施例7

本实施例采用实施例3制得的CLA-1进行毒性检测，药物剂量为10倍治疗剂量(25mg/Kg)，棉签浸湿80～100μl CLA-1，涂布小鼠皮肤，30分钟后观察是否有皮疹等，评价CLA-1对皮肤的毒性；涂布小鼠口腔舌头，30分钟后观察是否有皮疹等，评价CLA-1对小鼠舌头黏膜的毒性；涂布小鼠口腔舌头，每天1次，连续涂布7天，称量体重，评价CLA-1对小鼠体重的毒性；涂布7天后的小鼠采集舌头组织，做病理切片HE染色观察，评价CLA-1对小鼠舌头的病理毒性。经过以上检测，结果如图8所示，该结果表明，小鼠皮肤(图8的A图)、舌头黏膜(图8的B图)均未出现皮疹，小鼠体重无明显变化(图8的C图)，舌头组织切片HE染色结果正常(图8的D图)。这说明CLA-1在10倍治疗剂量(25mg/kg)中毒性还是非常小，可以安全用药。

实施例8

本实施例采用实施例3制得的CLA-1进行耐药性实验。

以下为采用实施例3示例制得的CLA-1的具体结果。

将氟康唑(FLC)、CLA-1分别加入到在0.5×MIC浓度的白色念珠菌悬液中，30℃孵育2天后，用酶标仪测定真菌生长，用细胞接种后续培养物。该过程重复30个周期(60天)，氟康唑(FLC)、CLA-1对白色念珠菌SC5314的MIC变化如图7所示，结果表明白念珠菌在接触氟康唑几天内迅速产生耐药性，而在CLA-1亚致死浓度超过60天的连续传代过程中，未观察到白念珠菌产生耐药性。

此外，其它由实施例3制得的CLA-1的实验结果与以上结果相同或基本相同，且由实验结果得出的结论与以上结论相同。

以上结果表明，CLA-1在抗菌的同时能防止产生耐药菌株。

本发明的主要方案如图8所示，包括：

(1)合成路线：SBA-15——NH₂-SBA-15——CHO-SBA-15——CHO-SBA-15/ε-PL——CHO-SBA-15/ε-PL/Ag(CLA-1)。

(2)CLA-1可对细菌、真菌产生灭杀作用，且能防止产生耐药菌株。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。