阅读说明：本技术 一种内含汉城病毒g2蛋白基因装甲rna标准物质及制备方法 (Armored RNA standard substance containing Hancheng virus G2 protein gene and preparation method thereof ) 是由 马思杰 胡群 童淑梅 邹春颖 谢东华 于 2020-04-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种内含汉城病毒G2蛋白基因装甲RNA标准物质及制备方法,该RNA标准物质利用噬菌体MS2衣壳蛋白能够抵抗外界环境中核糖核酸酶的降解,对其内部RNA片段起保护作的特性。采用原核表达技术表达MS2噬菌体衣壳蛋白包装汉城病毒部分片段基因,制备成稳定、基于汉城病毒G2囊膜蛋白部分片段序列为靶标的装甲RNA标准物质,适用于汉城病毒核酸检测方法的质量控制。本发明制备的汉城病毒装甲RNA标准物质,具备稳定、无生物安全危害、耐RNase酶降解等特点,便于储存、运输和使用,可对汉城病毒检测的病毒提取、RT-PCR全过程进行质量控制,操作简单、安全有效。(The invention discloses an armored RNA standard substance containing Hancheng virus G2 protein genes and a preparation method thereof, wherein the RNA standard substance utilizes the characteristic that phage MS2 capsid protein can resist the degradation of ribonuclease in the external environment and protect the RNA fragments in the RNA standard substance. The MS2 phage capsid protein is expressed by adopting a prokaryotic expression technology to package partial fragment genes of the Hancheng virus, and the armored RNA standard substance which is stable and takes the partial fragment sequence of the envelope protein of the Hancheng virus G2 as a target is prepared, and is suitable for the quality control of the Hancheng virus nucleic acid detection method. The Hancheng virus armored RNA standard substance prepared by the invention has the characteristics of stability, no biological safety hazard, RNase degradation resistance and the like, is convenient to store, transport and use, can control the quality of the whole processes of virus extraction and RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) of Hancheng virus detection, and is simple to operate, safe and effective.)

一种内含汉城病毒G2蛋白基因装甲RNA标准物质及制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种内含汉城病毒G2蛋白基因装甲RNA标准物质及制备方法。

背景技术

近年来，由汉城病毒引发的人感染肾综合征出血热常有报道，已经成为重要的公共卫生问题；汉城病毒(Seoul virus)属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)汉坦病毒属(Hantaan virus)。汉城病毒的主要宿主是褐家鼠，在我国，黑家鼠、黄胸鼠以及小家鼠均能携带汉城病毒。我国是受汉坦病毒危害最为严重的国家，肾综合征出血热发病人数占世界报道病例的90％以上。1981年中国河南和山西交界地区爆发汉城病毒引起的出血热疫情。而且汉城病毒是唯一呈世界性分布的汉坦病毒，在亚洲、欧洲、非洲以及南北美洲均发现汉城病毒的存在。宿主动物鼠类所携带的汉城病毒会通过粪便、尿、唾液或者血液进人破损的皮肤和粘膜、呼吸道以及消化道将病毒传播给人，或者通过蚤、螨等叮咬人导致感染。以PCR技术为代表的分子生物学技术，具有快速、灵敏、成本低等优势，同时利用PCR检测技术对检测结果进行分子流行病学分析可以得到汉城病毒的宿主流行情况，有助于对肾综合征出血热的流行进行防控。

核酸检测必须使用质控品进行质量控制，目前RNA病毒的质控品主要是病毒颗粒、裸露的RNA片段和装甲RNA。病毒颗粒包括减毒、灭活病毒或疫苗。目前，汉坦病毒有减毒活疫苗Z37株。但由于病毒制备需在高规格生物安全实验室内进行，同时由于运输保存的限制，使其作为质控标准物质。国内目前市面在售各类出血热病毒检测试剂盒一般采用合成RNA或DNA，RNA模板容易在环境中受到RNase酶降解，DNA模板无法参与核酸提取过程和反转录过程，不能对检测的全过程进行监控。目前，以噬菌体为基础的内嵌核酸病毒盔甲颗粒因其与全病毒颗粒最为接近，已成为标准物质研制的一个热点。大肠杆菌MS2噬菌体包膜蛋白与操纵子RNA序列有特异性的相互作用，在噬菌体外壳组装的同时将噬菌体基因RNA包装到包膜内，而噬菌体的外壳可以耐受RNase，因此将MS2噬菌体相应cDNA序列克隆至原核表达载体并插入特定病毒序列，经转录、翻译噬菌体衣壳蛋白组装成病毒样颗粒，具备RNase抗性便于存储和运输。

因此，一种内含汉城病毒G2蛋白基因装甲RNA标准物质及制备方法亟待提出。

发明内容

为解决现有质控样品或标准物质的不足，本发明提供一种内含汉城病毒G2蛋白基因装甲RNA标准物质及制备方法，具有稳定、安全、耐核糖核酸等特点，可用于汉城病毒检测的质量控制。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

本发明的第一目的提供一种内含汉城病毒G2蛋白基因装甲RNA标准物质，其特征在于，该装甲RNA的表达载体为pET32a-CP-G2质粒，质粒包含噬菌体MS2CP蛋白序列片段以及汉城病毒G2蛋白序列片段；汉城病毒装甲RNA表达载体pET32a-CP-G2转入大肠杆菌原核表达菌株BL21中，诱导表达，超声波破碎后离心收集沉淀，获得病毒样颗粒。

本发明的第二目的提供一种内含汉城病毒G2蛋白基因装甲RNA标准物质，所述装甲RNA标准物质由以下方法制备而成：

S1、噬菌体MS2 CP蛋白基因扩增：根据噬菌体MS2 CP基因序列设计一对特异性引物CP P1和CP P2，所述引物序列如下所示：

引物CP P1：5’-GCGGTACCGGGTGGGACCCCTTTCGGGGTCCTG-3’；

引物CP P2：5’-TTCCAGTAGCGACAGAAGCAAAAGCTTCC-3’；

以MS2噬菌体序列片段质粒为载体，使用引物CP P1和引物CP P2通过PCR扩增出MS2噬菌体基因序列MS2 CP，其序列如SEQ ID NO:3所示；

S2、表达载体pET32a-CP的获得：将PCR扩增产物和原核表达载体pET-32a用BamHI和Not I双酶切，1.5％琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收酶切后的目的片段，连接后转化DH5α菌株，获得表达载体pET32a-CP；

S3、汉城病毒G2蛋白片段基因序列的获得：人工合成汉城病毒G2基因组序列，其序列如SEQ ID NO:4所示，并在序列的5’端和3’端分别插入BamHI、Not I酶切位点，酶切后连着至pBluescript II SK+质粒载体中，获得目的序列片段pBSK-G2；

S4、表达质粒pBSK-G2的获得：将pET32a-CP和pBSK-G2均使用BamHI、Not I双酶切，1.5％琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收目的片段，连接后转化DH5α菌株，获得汉城病毒装甲RNA表达载体pET32a-CP-G2。

S5、汉城病毒装甲RNA获得：将汉城病毒装甲RNA表达载体pET32a-CP-G2转入大肠杆菌原核表达菌株BL21中，诱导表达，超声波破碎后离心收集沉淀，获得病毒样颗粒。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤S1中MS2噬菌体基因序列MS2 CP包括MS2噬菌体基因组5’非编码区序列、成熟酶蛋白基因序列、衣壳蛋白基因、包装位点和复制酶基因部分序列并对部分序列进行优化调整；在引物CP P1序列的5’端和引物CP P2序列的3’端分别插入Kpn I、BamHI酶切位点。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤S1中PCR反应体系包含以下浓度的以下组分：10X PCR Buffer 2μL、2.5mM each的dNTP 1.6μL、5U/μL的rTaq0.4μL、Mgcl2 1.2μL、20pmol/L的引物CP P1合伙引物CP P2 1μL、DDW 11.8μL、质粒pUC18-MS2 1μL；反应条件依次为94℃5min，94℃30sec，52℃30sec，72℃1min，72℃7min。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤S2中酶切反应体系包含以下浓度的以下组分：10X K Buffer 1μL、15units/μL的BamHI 1μL、10units/μL的Kpn I 1μL、PCR产物和pET32a质粒1μL，DDw 16μL，37℃酶切1h；

步骤S2中连接体系包括以下浓度的以下组分：Ligation MiX 10μL、CP 8μL、pET32a 2μ，4℃过夜反应。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤S4具体包括以下方法：将汉城病毒装甲RNA表达载体pET32a-CP-G2转入大肠杆菌原核表达菌株BL21中，阳性克隆转接种2mL含Amp 100μg/mL的LB液体培养基37℃过夜培养，1:100比例转接种2mL 2×YT液体培养基，37℃200rpm摇4h后，加1mM IPTG，诱导5h后，终止培养；离心收集菌体，超声波破碎后离心取上清，得到粗制的病毒样颗粒。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤S4中酶切反应体系包含以下浓度的以下组分：10X K Buffer 1μL、15units/μL的BamHI 1μL、10units/μL的Not I 1μL、0.1％BSA 1μL，质粒10μL，DDW 6μL，37℃酶切3h；

步骤S4中连接体系包括以下浓度的以下组分：Ligation MiX 10μL、pET32a-CP 2μL、G2 8μL，4℃过夜反应。

本发明的有益效果是：与现有的RNA质控品相比较，本发明的优点在于该装甲RNA的表达载体为pET32a-CP-G2质粒，质粒包含噬菌体MS2 CP蛋白序列片段以及汉城病毒G2蛋白序列片段。噬菌体MS2包膜蛋白与操纵子RNA序列有特异性相互作用，可以在噬菌体外壳组装室将噬菌体基因组RNA包装到包膜内。因此将特定RNA的cDNA克隆于MS2噬菌体包裹蛋白基因序列cDNA下游，噬菌体包膜蛋白组装外壳时将插入的RNA序列的部分噬菌体基因组包装到包膜内，构成噬菌体病毒样颗粒。与现有的RNA质控品相比较，本发明制备的汉城病毒装甲RNA标准物质，具备稳定、无生物安全危害、耐RNase酶降解等特点，便于储存、运输和使用，可对汉城病毒检测的病毒提取、RT-PCR全过程进行质量控制，操作简单、安全有效。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：汉城病毒病毒G2蛋白基因装甲RNA的获得和鉴定。

(1)噬菌体MS2 CP基因扩增

设计合成包含噬菌体MS2 CP蛋白序列片段的引物CP P1和CP P2，其序列如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示，并在序列两端分别插入Kpn I和BamHI酶切位点。以实验室保留的噬菌体MS2质粒pUC18-MS2序列为模版，使用CP P1和CP P2通过PCR扩增出MS2噬菌体基因序列MS2 CP。PCR反应体系：10X PCR Buffer 2μL、dNTP(2.5mM each)1.6μL、rTaq(5U/μL)0.4μL、Mgcl2 1.2μL、引物CP P1/CP P2(20pmol/L)1μL、DDW 11.8μL、质粒pUC18-MS2 1μL。反应条件94℃5min，94℃30sec，52℃30sec，72℃1min(35cycle)，72℃7min。选用1.5％琼脂糖凝胶电泳观察PCR扩增效果，观察是否有1800bp的目的片段，将PCR扩增产物送生物公司测序，测序结果如SEQ ID NO:3所示。

(2)表达载体pET32a-CP的构建

将MS2 CP蛋白序列的PCR扩增产物和原核表达载体pET-32a双酶切，酶切反应体系：10X K Buffer 1μL、BamHI(15units/μL)1μL、Kpn I(10units/μL)1μL，PCR产物/pET32a质粒1μL，DDw 16μL，37℃酶切1h。使用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit纯化回收酶切后的目的片段。用DNA Ligation Kit试剂盒连接，连接体系：Ligation MiX10μL、CP 8μL，pET32a 2μ，4℃过夜反应。将连接质粒转化感受态细胞进行蓝白斑筛选。在转化的LB平板上挑取白色克隆，接种2mL LB液体培养基，37℃过夜培养，使用TaKaRaMiniBEST Plasmid Purification Kit小型质粒提取质粒，使用Kpn I和BamHI双酶切鉴定，酶切体系：10X K Buffer 1μL、Kpn I(10units/μL)1μL、BamHI(15units/μL)1μL、质粒10μL、DDW 7μL，37℃酶切3h，电泳观察酶切结果。

(3)汉城病毒G2蛋白序列合成

设计合成包含汉城病毒G2蛋白序列片段，并在两端分别插入BamHI和Not I，其序列如SEQ ID NO:4所示，将合成的G2蛋白序列酶切插入到pBluescript II SK+载体中(委托上海生工生物公司合成并测序)。

(4)表达载体pET32a-CP-G2构建

将pET32a-CP和pBSK-G2质粒使用BamHI、Not I双酶切，反应体系：10X K Buffer 1μL、BamHI(15units/μL)1μL、Not I(10units/μL)1μL，0.1％BSA1μL，质粒10μL，DDW 6μL，37℃酶切3h电泳观察酶切效果，使用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit胶回收试剂盒回收470bp左右G2片段以及1800bp左右的CP片段，方法参照说明书。将酶切回收的G2和pET32a-CP片段连接。连接条件反应体系：Ligation MiX 10μL、pET32a-CP 2μL，G2 8μL，4℃过夜反应。将连接质粒转化DH5α感受态细胞进行蓝白斑筛选。在转化的LB平板上挑取白色克隆，接种2mL LB液体培养基，37℃过夜培养，TaKaRa MiniBEST Plasmid PurificationKit小型质粒提取质粒，用pET32a M13上下游引物扩增目的片段并测序，得到pET32a-CP-G2质粒。将质粒pET32a-CP-G2转化BL21(DE3)菌株，蓝白斑筛选挑取阳性菌株并用M13引物PCR扩增鉴定，按1:100比例将阳性菌株转接种2mL 2×YT液体培养基，37℃200rpm摇4h后，加1mM IPTG，诱导5h后，终止培养。离心收集菌体，超声波破碎后离心取上清，得到粗制的病毒样颗粒产物。

实施例2：汉城病毒装甲RNA的鉴定。

取20μL汉城病毒使用100U RNase A和2U DNaseI，37℃作用1h,使用QiaGenRNeasy Mini Kit提取试剂盒(购自Qiagen公司)提取RNA，使用汉城病毒通用引物分别进行RT-PCR和PCR扩增，RT-PCR cDNA合成反应体系：RNA 10μL、HT P1(20pmol/L)2μL(其序列如SEQ ID NO:5所示)、10X dNTP(10pmol/L)1μL、RNasin(40U/μL)0.5μL、AMV逆转录酶(10U/μl)1μL、5X AMV逆转录酶缓冲液4μL、DEPC水1.5μL。反应条件：42℃1h，72℃反应10min。DNA扩增：10X PCR Buffer 2μL、dNTP(2.5mM each)1.6μL、rTaq(5U/μL)0.4μL、Mgcl2 1.2μL、引物HT P2/HT P3(20pmol/L)1μL(其序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示)、DDW 11.8μL、cDNA 1μL。反应条件94℃5min，94℃30s，56℃30sec，72℃1min(35cycle)，72℃10min，电泳观察PCR扩增效果。直接PCR反应体系：10X PCR Buffer 2μL、dNTP(2.5mM each)1.6μL、rTaq(5U/μL)0.4μL、Mgcl2 1.2μL、引物HT P2/HT P3(20pmol/L)1μL、DDW 11.8μL、提取RNA 1μL。反应条件94℃5min，94℃30sec，52℃30sec，72℃1min(35cycle)72℃7min，电泳观察PCR扩增效果。

实施例3：装甲RNA质控品稳定性验证。

1、不同环境条件下存储稳定性实验

将粗制的病毒样颗粒产物使用RNase A和DNaseI，完全消化，置于37℃、4℃、-20℃，放置15d、30d、45d、60d、75d、90d后，并以-70℃保存样品作为对照，使用QiaGen RNeasyMini Kit提取RNA，使用使用汉城病毒通用引物扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测实验结果。电泳结果显示，病毒样颗粒在37℃可保存15d，4℃条件可放置30d仍可以观察到电泳条带，-20℃条件下放置75d可观察到电泳条带。

2、不同质控酶消化实验

用实验室保存的临床检测保留的汉城病毒RNA、汉城病毒疫苗以及制备的汉城病毒装甲RNA阳性质控，分两组进行实验，一组加入100U RNase A和2U DNaseI，37℃作用1h。另一组不做处理。使用RNA提取试剂盒提取RNA，使用紫外分光光度计测量浓度，稀释至同一浓度，使用引物HT P2/HT P3进行RT-PCR检测。结果显示：汉城病毒RNA、汉城病毒疫苗未经酶处理有目的条带而经酶处理后均无目的条带，肠道病毒装甲RNA酶处理组和未处理组均有条带。

实施案例4：应用于检测临床鼠类样品携带汉城病毒。

1.临床样本的分离及核酸提取：2018年从宁波港区捕获鼠类样品50只，无菌条件下取得约50mg鼠类肠道内容物样品，加入1mL 1×PBS缓冲液，放入组织研磨仪进行研磨。取200μL匀浆液，参照Qiagen公司RNA提取试剂盒使用说明书提取病毒RNA，用50μL无RNA酶的超纯水溶解，于－80℃保存备用。取50ng进行RT-PCR反应。同时使用实施案例1中制备的汉城病毒装甲RNA质控。

2.RT-PCR反应按照实施例2操作，对扩增产物使用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

3.结果表明使用本方法检测50份鼠类组织样本，1份扩增到特异性条带。阳性质控结果均复合要求，说明制备的汉城病毒可作为肠道病毒属检测的全程有效质控。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。