一种SARS-CoV-2中和性单抗及其应用
阅读说明：本技术 一种SARS-CoV-2中和性单抗及其应用 (SARS-CoV-2 neutralizing monoclonal antibody and its application ) 是由 管轶 桂勋 郑作宜 王双 管静 王荣娟 陈佩雯 焦莎莎 李利峰 张锦超 朱华晨 于 2020-04-15 设计创作，主要内容包括：本公开提供一种SARS-CoV-2中和性单抗或其片段,其能够通过阻断SARS-CoV-2与宿主细胞受体ACEII的结合而发挥中和活性,并且其对SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)的亲和力,高于人ACE2对SARS-CoV-2 S蛋白的亲和力。具体提供了所述抗体的制备方法、轻重链序列结构、病毒中和活性、表位竞争分析等。(The present disclosure provides a SARS-CoV-2 neutralizing mab or fragment thereof, which is capable of exerting neutralizing activity by blocking the binding of SARS-CoV-2 to host cell receptor ACEII, and whose affinity for SARS-CoV-2 spike protein (S protein) is higher than that of human ACE 2. The preparation method of the antibody, the light and heavy chain sequence structure, the virus neutralization activity, the epitope competition analysis and the like are specifically provided.)
技术领域
本发明属于抗体工程领域，具体涉及一种针对冠状病毒的单抗及其应用，特别是涉及一种SARS-CoV-2中和性单抗或其片段、制备方法及应用。
背景技术
尽管康复患者血浆疗法在临床上取得了一定的成效，然而由于抗原患者血浆来源有限、纯化抗体安全隐患高、特异性抗体效价不稳定。效价高、性能稳定、安全性好的单克隆抗体对于控制新冠状病毒疫情具有良好的应用前景。目前现有文献已经公开或教导了针对新冠病毒RBD制备保护性中和单抗的报道。利用新冠病毒刺突蛋白RBD产生抗新冠病毒的保护性中和抗体(如：bioRxiv，“SARS-CoV-2 and SARS-CoV Spike-RBD Structure andReceptor Binding Comparison and Potential Implications on NeutralizingAntibody and Vaccine Development”，20200220)。SARS刺突蛋白RBD和新冠病毒刺突蛋白RBD存在交叉中和表位肽，抗SARS的单克隆抗体CR3022能够结合新冠病毒刺突蛋白RBD(Emerging Microbes&Infections,9(1):382-385,20200217)。采用同源建模的方法明确了新冠病毒病毒CTD1/人ACE2复合物的蛋白-蛋白相互作用界面的热点和关键残基，筛选靶向CTD1区域与ACE2结合表面的候选抑制剂，阻断病毒与人体ACE2蛋白的识别与结合。
迄今为止，阻断新冠病毒结合宿主ACE2的单克隆抗体仍停留在理论研究阶段，尚没有序列结构清楚、阻断新冠病毒结合功能明确的单克隆抗体的现有技术报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明从新冠病毒感染后康复人员PBMC中分离冠状病毒刺突蛋白RBD特异性记忆B细胞、扩增获得抗体轻重链可变区序列，连接导入载体、重组表达获得重组人源单抗，从中选择出与SARS-CoV-2刺突刺突蛋白RBD亲和力高、对SARS-CoV-2刺突蛋白RBD与宿主受体ACEII阻断力强、对病毒侵染细胞的中和活力强的四株单抗MW03、MW04、MW05、MW06。具体而言：
一方面，本发明提供一种SARS-CoV-2中和性单抗或其片段，所述单抗或其片段在不高于10μg/mL浓度时，对滴度为102CCID50的SARS-CoV-2的中和率不低于90％。
进一步，本发明所述中和性单抗或其片段能中和或阻断SARS-CoV-2对 Vero-E6细胞的侵袭和/或感染。
进一步，本发明所述中和性单抗或其片段能够通过阻断SARS-CoV-2与宿主细胞受体ACEII的结合而发挥中和活性，其中阻断SARS-CoV-2与宿主细胞受体 ACEII结合的IC50小于30nM，例如小于25nM，优选小于20nM，更优选小于 15nM。
进一步，本发明所述中和性单抗或其片段能与SARS-CoV-2的S蛋白特异性结合，而与MERS-CoV的S蛋白无特异性结合。
进一步，进一步，本发明所述中和性单抗或其片段与SARS-CoV的S蛋白有交叉结合反应。
第二方面，本发明提供一种SARS-CoV-2中和性单抗或其片段，其特征在于在同等条件下，所述单抗或其片段对SARS-CoV-2S蛋白的亲和力，高于人ACE2 对SARS-CoV-2S蛋白的亲和力。
进一步，本发明所述中和性单抗或其片段对SARS-CoV-2S蛋白的亲和力常数KD值小于1×10-8，优选小于5×10-9，更优选小于1×10-9。
第三方面，本发明提供一种SARS-CoV-2中和性单抗或其片段，其包括的重链可变区(VH)选自SEQ ID NO:2、4、6、8，轻链可变区(VL)选自SEQ ID NO:1、 3、5、7。
进一步，本发明所述中和性单抗或其片段具有以下重链可变区和轻链可变区的组合：
VH为SEQ ID NO:2，VL为SEQ ID NO:1；
VH为SEQ ID NO:4，VL为SEQ ID NO:3；
VH为SEQ ID NO:6，VL为SEQ ID NO:5；或
VH为SEQ ID NO:8，VL为SEQ ID NO:7。
第四方面，本发明提供一种SARS-CoV-2中和性单抗或其片段，其中所述抗体的6个CDRs区与本发明第三方面所述单抗或其片段的6个CDRs区具有100％的氨基酸序列同源性。
第五方面，本发明提供一种SARS-CoV-2中和性单抗或其片段，其中通过 Fortebio表位竞争结合实验检测，所述单抗或其片段与本发明第三方面所述单抗或其片段具有竞争关系。
进一步，本发明所述中和性单抗或其片段与本发明第三方面所述单抗或其片段具有相同的抗原表位。
第六方面，本发明提供一种组合物，其包含一种或多种SARS-CoV-2中和性单抗或其片段，所述单抗或其片段选自由第一方面～第五方面所述中和性单抗或其片段组成的组。
进一步，本发明所述组合物，还包含药学上可接受的载体，从而可以作为药物组合物使用，
优选本发明所述药物组合物为水剂、针剂、粉针剂。
第七方面，本发明提供抗体或其片段在制备治疗冠状病毒感染药物中的应用，其中所述抗体或其片段包含一种或多种本发明第一方面～第五方面所述中和性单抗或其片段组成的组。
进一步，本发明所述的应用，其中所述冠状病毒感染包括SARS-CoV-2、 SARS-CoV。
第八方面，本发明提供一种多核苷酸，其编码本发明第一方面～第五方面所述中和性单抗或其片段。
第九方面，本发明提供一种载体，其包含本发明第八方面所述的多核苷酸。
第十方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含本发明第八方面所述的多核苷酸或本发明第九方面所述的载体。
第十一方面，本发明提供一种制备SARS-CoV-2中和性单抗或其片段的方法，其包括以下步骤：
(1)在适合表达重组SARS-CoV-2中和性单抗或其片段的条件下培养本发明第十方面所述宿主细胞；
(2)从细胞培养物中分离纯化SARS-CoV-2中和性单抗或其片段。
为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿
具体实施方式
部分而列出。
术语“冠状病毒”是指套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科 (Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)的成员。本发明所述冠状病毒主要涉及感染人的冠状病毒，包括HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、 HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2(2019-nCov)，本发明所述冠状病毒特别涉及SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2(2019-nCov)。
术语“特异性”是指在蛋白和/或其他生物异质群体中确定是否存在所述蛋白，例如本发明所述单抗与SARS-CoV-2RBD蛋白的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著的量与样本中存在的其它蛋白结合。
本文中的术语“抗体”意在包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)或单链。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(简称VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的框架区(FR)区分隔开。各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、 CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(C1q)。
术语“单克隆抗体”或“单抗”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。
本文中的术语，抗体的“抗原结合片段”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂VL和VH构成的Fv片段；(v)由VH构成的dAb片段 (Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(vii) 纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fc(scFv)；参见例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；and Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。
本发明的抗原结合片段包括能够特异性结合冠状病毒RBD的那些。抗体结合片段的实例包括例如但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、单链Fv(scFv) 片段和单结构域片段。
Fab片段含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端处的少数残基的添加，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。通过切割在F(ab')2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的二硫键产生Fab'片段。抗体片段的另外化学偶联是本领域普通技术人员已知的。Fab和F(ab')2片段缺乏完整抗体的片段可结晶(Fc)区，从动物的循环中更快速地清除，并且可能具有比完整抗体更少的非特异性组织结合(参见例如，Wahl等人，1983，J.Nucl.Med.24:316)。
如本领域通常理解的，“Fc”区是不包含抗原特异性结合区的抗体的片段可结晶恒定区。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区由两个相同的蛋白质片段组成，衍生自抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域(分别为CH2和CH3 结构域)。IgM和IgE Fc区在每条多肽链中含有三个重链恒定结构域(CH2、 CH3和CH4结构域)。
“Fv”片段是含有完整靶识别和结合位点的抗体的最小片段。该区域由以紧密的非共价结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体(VH-VL二聚体) 组成。在该构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用，以限定在VH-VL二聚体的表面上的靶结合位点。通常，六个CDR对抗体赋予靶结合特异性。然而，在一些情况下，甚至单个可变结构域(或仅包含对于靶特异性的三个CDR的Fv 的一半)可以具有识别且结合靶的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点。
“单链Fv”或“scFv”抗体结合片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。一般地，Fv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其致使scFv能够形成有利于靶结合的结构。
“单结构域片段”由对冠状病毒RBD显示出足够亲和力的单个VH或VL结构域组成。在一个具体实施方案中，单结构域片段是骆驼化的(参见例如， Riechmann，1999，JournalofImmunological Methods 231:25–38)。
本发明的抗冠状病毒RBD的抗体包括衍生化抗体。例如，衍生化抗体通常通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团的衍生化、蛋白酶解切割、与细胞配体或其它蛋白质的连接来修饰。可以通过已知技术进行众多化学修饰中的任一种，所述技术包括但不限于特定的化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，衍生物可以含有一种或多种非天然氨基酸，例如，使用ambrx技术(参见例如，Wolfson，2006，Chem.Biol. 13(10):1011-2)。
“人源抗体”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或动物中分离的抗体，所述动物对于一种或多种人免疫球蛋白是转基因的，并且不表达内源免疫球蛋白。人抗体可以通过本领域已知的各种方法制备，所述方法包括使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。参见美国专利号4,444,887和4,716,111；以及PCT公开WO 98/46645； WO 98/50433；WO 98/24893；WO 98/16654；WO 96/34096；WO96/33735；和 WO 91/10741。还可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白，但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生人抗体。参见例如，PCT公开WO 98/24893； WO92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利号5,413,923；5,625,126； 5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598。另外，使用与上述类似的技术，公司例如LakePharma，Inc. (Belmont，CA)或Creative BioLabs(Shirley，NY)可以从事于提供针对所选抗原的人抗体。可以使用被称为“引导选择”的技术生成识别所选表位的全人抗体。在该方法中，选择的非人单克隆抗体，例如小鼠抗体，用于引导识别相同表位的完全人抗体的选择(参见，Jespers等人，1988，Biotechnology 12:899-903)。
术语“识别抗原的抗体”以及“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异结合抗原的抗体”交替使用。
术语“高亲和性”对于IgG抗体而言，是指对于抗原的KD为1.0x 10-6M以下，优选5.0x 10-8M以下，更优选1.0x 10-8M以下、5.0x 10-9M以下，更优选1.0x 10-9M 以下。对于其他抗体亚型，“高亲和性”结合可能会变化。例如，IgM亚型的“高亲和性”结合是指KD为10-6M以下，优选10-7M以下，更优选10-8M以下。
术语“Kassoc”或“Ka”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而术语“Kdis”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的离解速率。术语“KD”是指解离常数，由Kd与Ka比(Kd/Ka)得到，并以摩尔浓度(M)表示。抗体的KD值可以通过领域内已知的方法确定。优选的确定抗体KD的方式是使用表面等离子共振仪(SPR)测得的，优选使用生物传感系统例如BiacoreTM系统测得。
术语“EC50”，又叫半最大效应浓度，是指引起50％最大效应的抗体浓度。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：
第一，本发明提供SARS-CoV-2中和性单抗或其片段，氨基酸序列结构明确、对冠状病毒RBD亲和力高、抑制或阻断冠状病毒RBD与宿主细胞结合的效果确切，用作药物时具有较低的异源性和较高的临床应用潜力。
第二，本发明提供的SARS-CoV-2中和性单抗或其片段能够特异性结合多种人冠状病毒，包括但不限于SARS-CoV、SARS-CoV-2(2019-nCov)，因此本发明的人源单抗适用于多种人冠状病毒感染的预防和/或治疗。
第三，本发明提供的SARS-CoV-2中和性单抗或其片段是从大量候选人源抗体中分离获得的，能够与宿主细胞ACEII竞争结合SARS-CoV-2，从而中和 SARS-CoV-2对宿主细胞的侵染。根据分子机理、封闭阻断实验、中和实验的效果能够预期本发明提供的SARS-CoV-2中和性单抗或其片段可通过降低 SARS-CoV-2的病毒载量，发挥治疗COVID-19的作用。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：
图1：重组抗体对S1RBD-mFc与ACEII-hFc结合的阻断作用曲线图。
图2：MW03和MW04对S1RBD-His与ACEII-his结合的阻断作用。
图3：MW05和MW06对S1RBD-His与ACEII-his结合的阻断作用。
图4：MW03与冠状病毒S蛋白的交叉反应性分析。
图5：MW04与冠状病毒S蛋白的交叉反应性分析。
图6：MW05与冠状病毒S蛋白的交叉反应性分析。
图7：MW06与冠状病毒S蛋白的交叉反应性分析。
图8：MW04和MW05与bio-MW03的表位竞争作用。
图9：MW03和MW06与bio-MW03的表位竞争作用。
图10：MW04和MW05与bio-MW04的表位竞争作用。
图11：MW03、MW04和MW06与bio-MW04的表位竞争作用。
图12：S1RBD-his的SDS-PAGE电泳图(分离胶浓度12％)。
图13：S1RBD-mFc的SDS-PAGE电泳图(分离胶浓度12％)。
图14：ACEII-hFc的SDS-PAGE电泳图(分离胶浓度12％)。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1.B细胞筛选获得抗新冠状病毒S1RBD特异性抗体
选择新冠状病毒S蛋白编码基因(Accession：QHD43416.1，319-541aa)、 ACEII编码基因(Accession：NP_068576.1，1-615aa)分别构建S1RBD-his、 S1RBD-mFc、ACEII-his和ACEII-hFc的瞬时表达载体，并通过HEK293T细胞进行瞬时表达，并利用相应的纯化标签纯化后用于相关实验(图12-14)。利用 FITC-S1RBD-hFc为抗原，对新型冠状病毒感染康复患者的特异性记忆B细胞进行分选。单细胞PCR技术(方法和引物参考文献NewBiotechnology,2010. Volume 27,Number 2,P110-117以及Human MonoclonalAntibodies书中第 114至117页)扩增抗体轻重链基因，并进行测序分析。将测序正确的抗体轻重链可变区基因合成后克隆入含有轻链恒定区的瞬时表达载体pKN019和含有重链恒定区IgG1基因的瞬时表达载体pKN041，利用HEK293系统进行瞬时表达纯化获得重组抗体MW03-MW06，采用同样方法构建非阻断型专利抗体CR3022(可变区序列来自US2010172917A1公开的一株抗SARS-Cov RBD的单抗，与新冠 S1RBD有交叉结合)。抗体MW03-MW06轻重链可变区的序列如下：
MW03VL:
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSG SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFLFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:1)
MW03VH:
EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGITVSRNYMSWVRQAPGKGLEWVSIIYSGGSTYYADSVK GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGDYYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:2)
MW04VL:
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPPVNTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:3)
MW04VH:
EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGLTVSSNYMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSTFYADSV KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVADAFDIWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:4)
MW05VL:
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGS GSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYSNWPPWTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:5)
MW05VH:
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPIFGSSNYAQK FQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAESPLGGGSGYSVSWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:6)
MW06VL:
DIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKVPKRLIYAASSLQSGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:7)
MW06VH:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSVISGSGGSTYYADS VRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYCCAKGYYYDSSGYYFREDAFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:8)
实施例2.MW03、MW04、MW05和MW06与S1RBD亲和力分析
应用Fortebio蛋白相互作用系统测定抗体与S1-RBD蛋白抗原结合的亲和力,同时以ACEII-hFc(1-615aa)为对照。主要步骤如下：
利用Fortebio公司的Octet QKe system，采用抗人抗体Fc段的捕获抗体 (AHC)生物探针捕获不同浓度的测定抗体与单价S1RBD的结合和解离变化。测定时将4μg/mL浓度的MW03、MW04、MW05和MW06流经AHC探针 (Cat:18-5060，PALL)表面，时间为120s。不同浓度稀释的S1RBD-His作为流动相。结合时间为300s，解离时间为300s。实验完毕，扣除空白对照响应值，用软件进行1：1Langmuir结合模式拟合，计算抗原抗体结合的动力学常数。
结果显示，4个抗体的结合与解离常数如下表所示，4个抗体亲和力均在nM 水平以上，远高于ACEII-Fc融合蛋白。
表1.抗新冠单克隆抗体与S1RBD的亲和力分析
实施例3.MW03、MW04、MW05和MW06对S1RBD/ACEII的阻断活性
2.1 ELSIA分析抗体对ACEII-hFc与S1RBD-mFc结合的阻断作用
将human ACEII-hFc(1-615aa)重组蛋白，浓度0.75μg/mL，100μl/孔，4℃包被过夜，用5％BSA于37℃恒温培养箱封闭120min后，PBST洗板4次。将待测抗体MW03-MW06(起始浓度为40μg/mL，1.5倍连续稀释，12个梯度)和与S1-RBD-mFc 70ng/ml，各取100uL等体积混匀，37℃放置50min后，每个样本取两个100μl平行加入到ACE2-hFc包被孔；37℃恒温培养箱反应60min后， PBST洗板4次；然后加入1:5000稀释的HRP-anti-mouse IgG(Cat:115-035-071, Jackson Immuno Research)，反应45min，PBST洗板4次；加入TMB(Cat:ME142，北京泰天河生物)底物显色15min，2M HCl终止后读板。读取并记录波长450 nM。
结果表明(图1)，4株抗体均能明显抑制ACEII-hFc与S1RBD-mFc的结合，其半数抑制浓度IC50如表2所示：
表2抗体对ACEII-hFc与S1RBD-mFc的结合的半数抑制浓度
IC50(nM)
MW03
11.32
MW04
10.49
MW05
16.35
MW06
25.24
2.2 Fortebio竞争结合实验分析抗体对ACEII-his与S1RBD-his结合的阻断作用
采用AHC生物探针捕获待分析抗体MW03、MW04、MW05和MW06,PBS 平衡后与100nM的S1RBD-his作为流动性，充分结合240s，进一步以ACEII-his 作为第二结合相，充分结合300s后，转入PBS中进行解离。
结果如图2和3所示，4株抗体均能有效阻止单价ACEII-his结合到S1RBD 上。而非阻断型抗体对照CR3022不能阻断ACEII的结合。
实施例4.MW03、MW04、MW05和MW06的交叉反应
将SARS-CoV-2S1RBD-His重组蛋白(科诺信诚科技有限公司表达， lot:20200213A)，SARS-CoV-2S1-His重组蛋白(科诺信诚科技有限公司表达， lot:20200221H)、重组蛋白SARS S1-His：(北京义翘神州，Cat:40150-V08B1) 以及重组蛋白MERS-CoV S1-His(北京义翘神州，Cat:40069-V08H)浓度 1μg/mL；4℃包被过夜，用5％BSA于37℃恒温培养箱封闭60min。将待测抗体和ACE2-hFc(1-615)重组蛋白(起始浓度为10μg/mL，3倍连续稀释，12个梯度)，37℃恒温培养箱反应60min后。PBST洗板4次；然后加入1:5000稀释的HRP-anti-human Fc(Cat：109-035-098，Jackson Immuno Research)，反应45min，加入TMB(Cat:ME142，北京泰天河生物)底物显色15min，2M HCl 终止后读板。以630nM为参比波长，读取并记录波长450nM下孔板的吸光度值OD450nM-630nM。
结果如图4-7所示。MW03、MW04和MW05仅特异性结合新冠状病毒的S蛋白(S1RBD和S1)；MW06可交叉结合SARS的S1蛋白。提示MW06与SARS的S 蛋白存在强交叉反应，其结合表位可能与另3个抗体不同，推测MW06可能对 SARS-S1和ACEII的结合同样具有阻断作用。
实施例5.MW03、MW04、MW05和MW06的表位竞争情况
利用Fortebio对MW03、MW04、MW05和MW06四种抗体进行表位分析。按照Biotin标记试剂盒EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin说明(Cat:21343，Thermo) 对抗体MW04和MW03进行Biotin标记。利用Fortebio公司的Octet QKe system 仪器，采用链霉亲和素(SA)生物探针捕获Biotin的方法测定不同抗体的识别表位。测定时将Biotin标记的MW04和MW03重组抗体(4ug/mL)，流经SA探针 (Cat:18-5019，PALL)表面，时间为240s，每个抗体各loading 4根SA探针。S1RBD-His(KN表达，lot:20200213A)作为流动相，S1RBD-His重组蛋白浓度为200nM，结合240s后；更换流动相为重组抗体MW03、MW04、MW05和MW06，浓度为60nM，结合300s。解离时间为300s。实验完毕，观察各个抗体的识别表位是否存在竞争关系。
Fortebio上进行表位竞争结合实验。结果显示(图8-9)，Bio-MW03与 S1RBD-his结合之后，能阻止MW03自身、MW04及MW05与S1RBD-his的进一步结合，但不能阻止MW06的进一步结合(图9)；同样地，bio-MW04结果也是类似，可以阻断MW04自身、MW03和MW05的进一步结合(图10、11)，但不能阻止MW06与之的结合(图11)。提示MW03、MW04和MW05的具有相似的结合表位区域，而MW06具有完全不同的抗原表位。
实施例6.MW03-MW06对SARS-CoV-2的病毒中和试验方法
病毒中和试验方法如下：
1)取生长状态良好的Vero-E6细胞消化，调整细胞密度为1×105/mL接种于96孔板，100μL/孔(即每孔104个细胞)，放置于37℃、5％CO2培养箱培养 12-16h；
2)12-16h后，按如下方案配置不同浓度的待测抗体样本：
3)12-16h后，弃去孔中培养基，首先分别加入终浓度为不同稀释度(10 倍稀释)的样品50μl，然后每孔加入102CCID50的SARS-CoV-2病毒50μl。同时设置细胞对照，病毒对照；每个样品做2个重复孔。病毒对照和细胞对照孔做6个重复孔。
4)于加样后72h观察和记录细胞病变情况，实验结果如表3所示。
表3抗体中和SARS-CoV-2病毒对宿主细胞的感染
注：所述抗体8B4(MW01)参见第CN202010178099.X号发明专利申请。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 申请人名称
<120> 一种SARS-CoV-2中和性单抗及其应用
<130> None
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 105
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Leu Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 2
<211> 117
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Val Ser Arg Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ile Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 109
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Pro
85 90 95
Val Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 4
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Val Ala Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 6
<211> 125
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ser Ser Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Glu Ser Pro Leu Gly Gly Gly Ser Gly Tyr Ser Val Ser Trp Phe
100 105 110
Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ala Met Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 8
<211> 127
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Cys Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Phe Arg Glu Asp
100 105 110
Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125