抗cd73的抗体及其用途
阅读说明：本技术 抗cd73的抗体及其用途 (anti-CD 73 antibodies and uses thereof ) 是由 王忠民 张鹏 李百勇 夏瑜 于 2021-04-22 设计创作，主要内容包括：本发明涉及抗CD73抗体及其应用。具体地,所述抗体的重链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NOs：15-17所示的HCDR1-HCDR3；并且所述抗体的轻链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NOs：18-20所示的LCDR1-LCDR3。(The present invention relates to anti-CD 73 antibodies and uses thereof. Specifically, the heavy chain variable region of the antibody comprises an amino acid sequence shown as SEQ ID NOs: HCDR1-HCDR3 shown at 15-17; and the variable region of the light chain of the antibody comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NOs: LCDR1-LCDR3 shown at 18-20.)
技术领域
本发明涉及免疫学领域。具体地，涉及抗CD73抗体及其用途。
背景技术
胞外-5′-核苷酸酶(Ecto-5′-nucleotidase)，即CD73蛋白，是NT5E基因编码的一种蛋白分子量为70KD的多功能糖蛋白，其通过糖基磷脂酰肌醇(glyocsyl phosphatidylinositol，GPI)锚定于细胞膜上(Zimmermann H.Biochem J.1992；285：345-365)。
CD73广泛分布在人体组织细胞表面，目前研究已经发现CD73高表达于多种实体肿瘤，如肿瘤微环境的癌细胞、树突细胞、调节型T细胞(Treg)、自然杀伤细胞(NK细胞)、髓系起源的抑制细胞(MDSC)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)等。肿瘤微环境的一个重要特征是低氧，低氧诱导低氧诱导因子-1(HIF-1)等分子的上调，进而导致CD73在肿瘤微环境广泛表达(Synnestvedt K，et al.J Clin Invest.2002；110：993-1002.)。对临床肿瘤样本的分析显示，CD73高表达是一种潜在的生物标志物，与多种类型肿瘤的不良预后密切相关，包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、肾癌、胃癌、头颈癌等。
CD73既有水解酶活性，又有非水解酶作用。CD73的酶与非酶功能同时存在于肿瘤的相关过程中，并且互相促进，维持肿瘤的演进。越来越多的研究发现，CD73是体外肿瘤细胞增殖、转移和侵袭，体内肿瘤血管生成和肿瘤免疫逃逸机制的关键调控分子，其中很重要的一个免疫抑制机制是由CD73-腺苷(Adenosine)代谢信号通路介导的，CD73上游的CD39可以催化ATP产生腺苷单磷酸(AMP)，所产生的AMP被CD73转化为腺苷，而腺苷会结合下游的腺苷受体(A2AR)，A2AR通过激活蛋白激酶A(PKA)和Csk激酶，抑制LCK、MAPK、PKC等一系列与免疫激活相关的信号通路，抑制T细胞的免疫杀伤作用，从而发挥免疫抑制作用，使肿瘤实现免疫逃逸(Antonioli L，et al.Nat Rev Cancer.2013；13：842-857.)。临床前动物模型研究显示，免疫细胞和非免疫细胞表达的CD73均可以促进肿瘤的免疫逃逸，发展和转移，其中Treg细胞相关的CD73-腺苷信号对CTL(细胞毒性T细胞)和NK细胞功能的抑制最为明显。
对于实体瘤治疗而言，要克服耐药提高疗效，很重要的一个方面就是解除肿瘤微环境(Tumor micro environment，TME)对免疫效应细胞的抑制作用。TME是非常复杂的系统，由多种细胞、胞间质、酶、细胞因子、代射产物等构成，有显著的低氢、低pH以及高压的特点，与正常组织差异巨大。放化疗杀伤肿瘤细胞所造成的低氧或ATP富集会促进CD39-CD73腺苷信号的级联反应，有利于各种促癌类细胞的增殖和功能，而不利于抑癌类细胞(Regateiro，F.S.，Cobbold，S.P.&Waldmann，H.Clin.Exp.Immunol.2013；171：1-7)。
在动物模型中使用靶向CD73的抗体或基因敲除CD73可以有效阻断肿瘤生长和转移。近来，利用CD73单克隆抗体、小干扰RNA技术、特异性抑制剂APCP等在动物实验的抗肿瘤治疗中取得了显著疗效，为抗肿瘤治疗提供了新的途径。体内试验的证据显示，对于肿瘤患者，靶向阻断CD73将成为有效的治疗手段。
CD73过表达与肿瘤亚型、预后及患者的药物反应之间的联系已经表明CD73可作为未来个体肿瘤治疗、检测的一个重要标志物。因此，对CD73靶点的研究是不可或缺的。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，利用哺乳动物细胞表达系统表达出重组的人CD73作为抗原免疫小鼠，经小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞。发明人通过对大量样本的筛选，得到了杂交瘤细胞株LT014(保藏编号为CCTCC NO：C2018137)。
本发明人惊奇地发现，杂交瘤细胞株LT014能够分泌产生与人CD73特异性结合的特异性单克隆抗体(命名为19F3)，并且该单克隆抗体能够十分有效地以非底物竞争的方式抑制CD73的酶活反应，降低腺苷的产生，促进T细胞活性，发挥抑制肿瘤生长的效果。进一步地，本发明人创造性地制得了抗人CD73的人源化抗体(命名为19F3H1L1，19F3H2L2，19F3H2L3)；在前述人源化抗体的基础上，通过在重链恒定区引入氨基酸突变，得到了消除了ADCC活性的新的人源化抗体(命名为19F3H1L1(hG1DM)，19F3H2L2(hG1DM)，19F3H2L3(hG1DM))。
本发明人还惊奇地发现，本发明的抗体例如19F3H1L1，19F3H2L2，19F3H2L3具有诱导细胞膜表达的CD73内吞的活性，可以降低CD73的活性，并且进一步突变的例如19F3H2L3(hG1DM)不与引起抗体介导的细胞毒作用的FcγRIIIa结合，显著提升了安全性。本发明的抗体具有用于治疗肿瘤的潜力。
本发明的一个方面涉及抗CD73(例如人CD73)抗体或其抗原结合片段，所述抗CD73抗体包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10所示重链可变区包含的HCDR1，HCDR2和HCDR2；和SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14所示轻链可变区包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3，
优选地，根据IMGT编号系统，所述抗CD73抗体包含：
HCDR1，其包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列，与所述序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，
HCDR2，其包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，与所述序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，
HCDR3，其包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，与所述序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，
LCDR1，其包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列，与所述序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，
LCDR2，其包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列，与所述序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，和
LCDR3，其包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列，与所述序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成。
在本发明的一些实施方案中，所述抗体的重链可变区包含下述序列，或由下述序列组成：
SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10所示的序列，与SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：10所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10所示的序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；并且
所述抗体的轻链可变区包含下述序列，或由下述序列组成：
SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14所示的序列，与SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12或SEQ IDNO：14所示序列所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；或
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。
在本发明的一些实施方案中，所述抗体的重链恒定区序列如SEQ ID NO：21所示，即在Ig gamma-1链C区，ACCESSION：P01857的基础上，在第234号位点引进了亮氨酸到丙氨酸的点突变(L234A)，第235号位点引进了亮氨酸到丙氨酸的点突变(L235A)；轻链恒定区序列如SEQ ID NO：22所示，即为Ig kappa链C区，ACCESSION：P01834；或重链恒定区采用Iggamma-1chain C region，ACCESSION：P01857，轻链恒定区为Igkappa chain C region，ACCESSION：P01834)。
轻链和重链的可变区决定抗原的结合；每条链的可变区均含有三个高变区，称互补决定区(CDR)(重链(H)的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，轻链(L)的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；其由Kabat等人命名，见Bethesda M.d.，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，Fifth Edition，NIH Publication 1991；1-3：91-3242。
优选地，CDR也可以由IMGT编号系统定义，请参见Ehrenmann，Francois，QuentinKaas，and Marie-Paule Lefranc.IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign∶adatabase and a tool for immunoglobulins or antibodies，T cell receptors，MHC，IgSF and MhcSF.Nucleic acids research 2009；38(suppl_1)：D301-D307。
通过本领域技术人员所熟知的技术手段，例如通过VBASE2数据库根据IMGT定义分析单克隆抗体序列的CDR区的氨基酸序列。
本发明涉及的抗体19F3、19F3H1L1、19F3H2L2、19F3H2L3具有相同的CDR：
其重链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
HCDR1：GYSFTGYT(SEQ ID NO：15)，
HCDR2：INPYNAGT(SEQ ID NO：16)，
HCDR3：ARSEYRYGGDYFDY(SEQ ID NO：17)；
其轻链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
LCDR1：QSLLNSSNQKNY(SEQ ID NO：18)，
LCDR2：FAS(SEQ ID NO：19)，
LCDR3：QQHYDTPYT(SEQ ID NO：20)。
在本发明的一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。
在本发明的一些实施方案中，所述抗体为人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)。
在本发明的一些实施方式中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv、dAb、Fab/c、互补决定区片段、单链抗体(例如，scFv)、人源化抗体、嵌合抗体或双特异性抗体。
本发明的另一个方面涉及分离的多肽，其选自以下各项组成的组：
(1)分离的多肽，其包含SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示的序列，其中所述多肽作为抗CD73抗体的一部分，特异性结合CD73，所述抗体还包含SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：20所示的序列；
(2)分离的多肽，其包含SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的序列，其中所述多肽作为抗CD73抗体的一部分，特异性结合CD73，所述抗体还包含SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，和SEQ ID NO：17所示的序列；
(3)分离的多肽，其包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10所示的序列或与所述序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗CD73抗体的一部分，特异性结合CD73，所述抗体还分别对应包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：12所示的序列或与所述序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；
(4)分离的多肽，其包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：12所示的序列或与所述序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗CD73抗体的一部分，特异性结合CD73，所述抗体还分别对应包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10所示的序列或与所述序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；
(5)分离的多肽，其包含SEQ ID NO：10所示的序列或与所述序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗CD73抗体的一部分，特异性结合CD73，所述抗体还分别对应包含SEQID NO：14所示的序列或与所述序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；
(6)分离的多肽，其包含SEQ ID NO：14所示的序列或与所述序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗CD73抗体的一部分，特异性结合CD73，所述抗体还分别对应包含SEQID NO：10所示的序列或与所述序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列。
本发明的另一方面涉及一种分离的核酸分子，其编码本发明任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或所述分离的多肽。
本发明的再一方面涉及一种载体，其包含本发明的分离的核酸分子。
本发明的再一方面涉及一种宿主细胞，其包含本发明的分离的核酸分子，或者本发明的载体。
本发明的再一方面涉及一种偶联物，其包括抗体以及偶联部分，其中，所述抗体为本发明任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述偶联部分为纯化标签(如His标签)，可检测的标记；优选地，所述偶联部分为放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、有色物质、聚乙二醇或酶。
本发明的再一个方面，涉及融合蛋白或多特异性抗体(优选双特异性抗体)，其包含本发明任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明的再一方面涉及一种试剂盒，其包括本发明任一项所述的抗体或其抗原结合片段、本发明的偶联物、融合蛋白或多特异性抗体；优选地，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述抗体；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、有色物质或酶。
本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的抗体或其抗原结合片段、本发明的偶联物、融合蛋白或多特异性抗体在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测CD73在样品中的存在或其水平。
本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明任一项所述的抗体或其抗原结合片段、本发明的偶联物、融合蛋白或多特异性抗体；可选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。优选地，所述药物组合物为适于通过皮下注射、皮内注射、静脉内注射、肌内注射或病灶内注射施用的形式。
本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的抗体或其抗原结合片段、本发明的偶联物、融合蛋白或多特异性抗体在制备治疗和/或预防肿瘤(例如实体瘤，优选非小细胞肺癌、前列腺癌(包括转移性去势抵抗前列腺癌(mCRPC))、三阴性性乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌(包括结直肠癌微卫星稳定(MSS))、胃癌、黑色素癌、头颈癌、肾细胞癌或胰管腺癌)的药物中的用途，或者在制备用于诊断肿瘤的药物中的用途。
本发明的再一方面涉及杂交瘤细胞株LT014，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2018137。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语EC50是指半最大效应浓度(concentration for 50％ofmaximal effect)，是指能引起50％最大效应的浓度。
如本文中所使用的，术语“抗体”是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为K和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda M.d.(1987 and 1991))，或Chothia&LeskJ.Mol.Biol.1987；196：901-917；Chothia等人Nature 1989；342：878-883或者IMGT编号系统定义，见Ehrenmann，Francois，Quentin Kaas，and Marie-Paule Lefranc.″IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign：a database and a tool forimmunoglobulins or antibodies，T cell receptors，MHC，IgSF and MhcSF.″Nucleicacids research 2009；38(suppl_1)：D301-D307.的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(G，MilsteinC.Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefinedspecificity[J].nature，1975；256(5517)：495)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.Patent4,816,567)。
如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或反应性的非人源(例如，小鼠、大鼠或兔)抗体。此外，受体抗体的构架区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容，可参见例如，Jones et al.，Nature1986；321：522-525；Reichmann et al.，Nature 1988；332：323-329；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，1992；2：593-596；和ClarkM.Antibody humanization：a case of the‘Emperor’s new clothes’？[J].Immunol.Today，2000；21(8)：397-402。
如本文中所使用的，术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草杆菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，GS细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。
如本文中所使用的，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10- 9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原(例如，PD-1蛋白)。可以使用本领域技术人员知悉的方法测定KD，例如使用Fortebio分子相互作用仪测定。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR，19thed.Pennsylvania：Mack Publishing Company，1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如肿瘤)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如肿瘤)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。
发明的有益效果：
本发明的单克隆抗体能够很好地特异性与CD73结合，并且能够十分有效地、以非底物竞争的方式抑制CD73的酶活反应，降低腺苷的产生，促进T细胞活性及肿瘤抑制效果。
生物材料保藏说明：
杂交瘤细胞株LT014(又称CD73-19F3)，其于2018年6月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2018137，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。
附图说明
图1.19F3H2L3与HNT5E(1-552)-his亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM。
图2.19F3H2L2与HNT5E(1-552)-his亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM。
图3.MEDI9447与HNT5E(1-552)-his亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM。
图4.FACS检测19F3H2L3与MDA-MB-231细胞表面CD73的结合活性。
图5.MDA-MB-231细胞中加入抗CD73抗体的酶活性的检测结果。
图6.U87-MG细胞中加入抗CD73抗体的酶活性的检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，为可以通过市场购买获得的常规产品。例如MDA-MB-231细胞和U87-MG细胞可以购自ATCC。
在本发明的下述实施例中，使用的BALB/c小鼠购自广东省医学实验动物中心。
在本发明的下述实施例中，所用的阳性对照抗体MEDI9447(Oleclumab)，生产自中山康方生物医药有限公司，其序列与Medlmmune Limited公开专利，公开号：US20160129108A1中所述的抗体SEQ ID NOs：21-24相同。
在本发明的下述实施例中，所用的AD2购自Biolegend(货号：Cat.344002)。
实施例1：抗CD73抗体19F3的制备
1、杂交瘤细胞株LT014的制备
制备抗CD73抗体所用的抗原为人NT5E-His(NT5E为GenbankID：NP_002517.1，位置：1-552)。取免疫后的小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，制成杂交瘤细胞。以人NT5E(NT5E为GenbankID：NP_002517.1，位置：1-552)-Biotin作为抗原，对杂交瘤细胞进行间接ELISA法筛选，获得能够分泌与CD73特异性结合的抗体的杂交瘤细胞。对筛选得到的杂交瘤细胞，经过有限稀释法得到稳定的杂交瘤细胞株。将以上杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株LT014，其分泌的单克隆抗体命名为19F3。
杂交瘤细胞株LT014(又称CD73-19F3)，其于2018年6月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2018137，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。
2、抗CD73抗体19F3的制备
用CD培养基(Chemical Defined Medium)对上面制得的LT014细胞株分别进行培养(CD培养基，内含1％青链霉素，于5％CO2，37℃细胞培养箱中进行培养)。7天后收集细胞培养上清，通过高速离心、微孔滤膜抽真空过滤，并使用HiTrap protein A HP柱进行纯化，制得抗体19F3。
实施例2：抗CD73的抗体19F3的序列分析
按照培养细胞细菌总RNA提取试剂盒(Tiangen，货号DP430)的方法，从实施例1中培养的LT014细胞株中提取mRNA。
按照InvitrogenIII First-Strand Synthesis System for RT-PCR试剂盒说明书合成cDNA，并进行PCR扩增。
PCR扩增产物直接进行TA克隆，具体操作参考pEASY-T1 Cloning Kit(TransgenCT101)试剂盒说明书进行。
将LT014细胞株进行抗CD73的抗体19F3的TA克隆的产物直接进行测序，测序结果如下：
重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：1所示，长度为363bp。
其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，长度为121aa；
其中重链CDR1的序列如SEQ ID NO：15所示，重链CDR2的序列如SEQ ID NO：16所示，重链CDR3的序列如SEQ ID NO：17所示。
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：3所示，长度为339bp。
其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，长度为113aa；
其中轻链CDR1的序列如SEQ ID NO：18所示，轻链CDR2的序列如SEQ ID NO：19所示，轻链CDR3的序列如SEQ ID NO：20所示。
实施例3：抗人CD73的人源化抗体的轻链和重链设计和制备
1.抗人CD73的人源化抗体19F3H1L1、19F3H2L2和19F3H2L3的轻链和重链设计
根据人CD73蛋白的三维晶体结构(Hage T，Reinemer P，Sebald W.Crystals of a1：1complex between human interleukin-4and the extracellular domain of itsreceptor alpha chain.Eur J Biochem.1998；258(2)：831-6.)以及实施例2获得的抗体19F3的序列，通过计算机模拟抗体模型，根据模型设计突变，得到抗体19F3H1L1、19F3H2L2、19F3H2L3的可变区序列(抗体恒定区序列，来自NCBI的数据库，重链恒定区均采用Iggamma-1chain C region，ACCESSION：P01857；轻链恒定区为Ig kappa chain C region，ACCESSION：P01834)。
设计的可变区序列如下：
(1)人源化单克隆抗体19F3H1L1的重链可变区和轻链可变区序列重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：5所示，长度为363bp。
其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，长度为121aa，其中重链CDR1的序列如SEQ ID NO：15所示，重链CDR2的序列如SEQ ID NO：16所示，重链CDR3的序列如SEQ ID NO：17所示。
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：7所示，长度为339bp。
其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，长度为113aa，其中轻链CDR1的序列如SEQ ID NO：18所示，轻链CDR2的序列如SEQ ID NO：19所示，轻链CDR3的序列如SEQ ID NO：20所示。
(2)人源化单克隆抗体19F3H2L2的重链可变区和轻链可变区序列重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：9所示，长度为363bp。
其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，长度为121aa，其中重链CDR1的序列如SEQ ID NO：15所示，重链CDR2的序列如SEQ ID NO：16所示，重链CDR3的序列如SEQ ID NO：17所示。
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：11所示，长度为339bp。
其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，长度为113aa，其中轻链CDR1的序列如SEQ ID NO：18所示，轻链CDR2的序列如SEQ ID NO：19所示，轻链CDR3的序列如SEQ ID NO：20所示。
(3)人源化单克隆抗体19F3H2L3的重链可变区和轻链可变区序列重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：9所示，长度为363bp。
其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，长度为121aa，其中重链CDR1的序列如SEQ ID NO：15所示，重链CDR2的序列如SEQ ID NO：16所示，重链CDR3的序列如SEQ ID NO：17所示。
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO：13所示，长度为339bp。
其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示，长度为113aa，其中轻链CDR1的序列如SEQ ID NO：18所示，轻链CDR2的序列如SEQ ID NO：19所示，轻链CDR3的序列如SEQ ID NO：20所示。
2.人源化抗体19F3H1L1、19F3H2L2和19F3H2L3的制备
重链恒定区均采用Ig gamma-1chain C region，ACCESSION：P01857；轻链恒定区均采用Ig kappa chain C region，ACCESSION：P01834。
将19F3H1L1重链cDNA和轻链的cDNA、19F3H2L2重链cDNA和轻链的cDNA、以及19F3H2L3的重链cDNA和轻链的cDNA，分别克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中，分别获得pUC57simple-19F3H1、pUC57simple-19F3L1；pUC57simple-19F3H2、pUC57simple-19F3L2和pUC57simple-19F3L3。参照《分子克隆实验指南(第二版)》介绍的标准技术，EcoRI&HindIII酶切合成的重、轻链全长基因，通过限制酶(EcoRI&HindIII)的酶切亚克隆到表达载体pcDNA3.1中获得表达质粒pcDNA3.1-19F3H1，pcDNA3.1-19F3L1，pcDNA3.1-19F3H2，pcDNA3.1-19F3L2，和pcDNA3.1-19F3L3，并进一步对重组表达质粒的重/轻链基因进行测序分析。随后将含有相应的轻、重链重组质粒设计基因组合(pcDNA3.1-19F3H1/pcDNA3.1-19F3L1，pcDNA3.1-19F3H2/pcDNA3.1-19F3L2，和pcDNA3.1-19F3H2/pcDNA3.1-19F3L3)分别共转染293F细胞后收集培养液进行纯化。测序验证正确后，制备去内毒素级别的表达质粒并将质粒瞬时转染HEK293细胞进行抗体表达，培养7天后收集细胞培养液，采用Protein A柱进行亲和纯化获得人源化抗体。
3.人源化抗体19F3H1L1(hG1DM)、19F3H2L2(hG1DM)和19F3H2L3(hG1DM)的制备
19F3H1L1(hG1DM)、19F3H2L2(hG1DM)和19F3H2L3(hG1DM)的抗体的轻链恒定区为Ig kappa链C区，ACCESSION：P01834，见SEQ ID NO：22。
重链恒定区在Ig gamma-1chain C region，ACCESSION：P01857的基础上，在第234号位点引进了亮氨酸到丙氨酸的点突变(L234A)，第235号位点引进了亮氨酸到丙氨酸的点突变(L235A)，见SEQ ID NO：21，获得了命名为19F3H1L1(hG1DM)、19F3H2L2(hG1DM)和19F3H2L3(hG1DM)的人源化抗体。
将19F3H1L1(hG1DM)重链cDNA和轻链的cDNA、19F3H2L2(hG1DM)重链cDNA和轻链的cDNA、以及19F3H2L3(hG1DM)的重链cDNA和轻链的cDNA，分别克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中，分别获得pUC57simple-19F3H1(hG1DM)、pUC57simple-19F3L1；pUC57simple-19F3H2(hG1DM)、pUC57simple-19F3L2和pUC57simple-19F3L3。参照《分子克隆实验指南(第二版)》介绍的标准技术，EcoRI&HindIII酶切合成的重、轻链全长基因，通过限制酶(EcoRI&HindIII)的酶切亚克隆到表达载体pcDNA3.1中获得表达质粒pcDNA3.1-19F3H1(hG1DM)，pcDNA3.1-19F3L1，pcDNA3.1-19F3H2(hG1DM)，pcDNA3.1-19F3L2，和pcDNA3.1-19F3L3，并进一步对重组表达质粒的重/轻链基因进行测序分析。随后将含有相应的轻、重链重组质粒设计基因组合(pcDNA3.1-19F3H1(hG1DM)/pcDNA3.1-19F3L1，pcDNA3.1-19F3H2(hG1DM)/pcDNA3.1-19F3L2，和pcDNA3.1-19F3H2(hG1DM)/pcDNA3.1-19F3L3)分别共转染293F细胞后收集培养液进行纯化。测序验证正确后，制备去内毒素级别的表达质粒并将质粒瞬时转染HEK293细胞进行抗体表达，培养7天后收集细胞培养液，采用Protein A柱进行亲和纯化获得人源化抗体。
实施例4：ELISA方法测定抗CD73抗体与抗原人NT5E-Biotin的结合活性
实验步骤：将链霉亲和素，2μg/ml包被酶标板后，4℃孵育12小时。孵育结束后使用PBST漂洗包被了抗原的酶标板1次，后使用1％BSA的PBST溶液作为酶标板封闭液，封闭2小时。酶标板结束封闭后用PBST洗板3次。再加入抗原人NT5E-Biotin 0.5μg/ml，置于37℃条件下孵育30分钟后用PBST洗板3次。在酶标板孔内加入PBST溶液梯度稀释的抗体，抗体稀释梯度详见表1。加入待测抗体的酶标板置于37℃条件下孵育30分钟，孵育完成后用PBST洗板3次。洗板后加入1∶5000比例稀释的HRP标记羊抗人IgG(H+L)(Jackson，货号：109-035-088)或者1∶5000比例稀释的HRP标记羊抗鼠IgG(H+L)(Jackson，货号：115-035-062)二抗工作液，置于37℃条件下孵育30分钟。孵育完成后使用PBST洗板4次，后加入TMB(Neogen，308177)避光显色5min，加入终止液终止显色反应。立即把酶标板放入酶标仪中，选择450nm光波长读取酶标板各孔的OD数值。用SoftMax Pro 6.2.1软件对数据进行分析处理。
检测抗CD73抗体与抗原人NT5E-Biotin结合的各剂量的OD值见表1。以抗体浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标进行曲线拟合，计算抗体的结合EC50，结果如下表1所示。
实验结果显示，抗体19F3 H1L1、19F3 H2L2、19F3 H2L3以及鼠源抗体19F3均能有效与人NT5E-Biotin结合，结合效率呈剂量依赖关系。在基本相同的实验条件下，19F3 H1L1与人NT5E-Biotin结合的EC50为0.049nM，19F3 H2L2与人NT5E-Biotin结合的EC50为0.064nM，19F3 H2L3与人NT5E-Biotin结合的EC50为0.061nM，同靶点阳性药MEDI9447与人NT5E-Biotin结合的EC50为0.048nM，以及鼠源抗体19F3与人NT5E-Biotin结合的EC50为0.018nM，
以上实验结果表明，在相同实验条件下19F3 H1L1、19F3 H2L2、19F3H2L3以及鼠源抗体19F3分别与人NT5E-Biotin的结合活性与同靶点阳性药MEDI9447相当，提示19F3H1L1、19F3 H2L2、19F3 H2L3具有有效结合CD73的功能。
表1 19F3H1L1、19F3H2L2、19F3H2L3和鼠源19F3与HNT5E-Biotin的结合活性检测结果
实施例5：使用Fortebio分子相互作用仪测定人源化抗体19F3H2L3、19F3H2L2、MEDI9447与抗原人HNT5E(1-552)-his结合的动力学参数。
样品稀释缓冲液为PBST，pH7.4。5μg/mL抗体固定于Protein A传感器上，固定时间为15s。传感器在缓冲液中平衡120s。固定在传感器上的抗体与抗原人NT5E(1-552)-his结合，浓度为3.125-200nM(两倍稀释)，时间120s。抗原抗体在缓冲液中解离，时间600s。传感器采用10mM甘氨酸，pH1.5溶液再生。检测温度为37度，检测频率为0.6Hz，样品板震动速率为1000rpm。数据以1∶1模型拟合分析，得到亲和力常数。
人源化抗体19F3H2L3、19F3H2L2、MEDI9447(作为对照抗体)与人CD73的亲和力常数测定结果见表2，检测结果如图1～3所示。
实验结果如表2和图1～3所示，人源化抗体19F3H2L3、19F3H2L2、MEDI9447与人CD73的亲和力常数依次为1.04E-10M，2.36E-10M，2.59E-10M，1.04E-10M。
以上实验结果表明：19F3H2L3、19F3H2L2与HNT5E(1-552)-his的结合能力相当，提示人源化抗体19F3H2L3、19F3H2L2与人CD73均有较强的结合能力。
表2. 19F3H2L3、19F3H2L2与HNT5E(1-552)-his亲和力常数测定
待测抗体
KD(M)
kon(1/Ms)
S E(kon)
kdis(1/s)
S E(kdis)
Rmax(nm)
19F3 H2L3
2.36E-10
4.82E+05
7.74E+03
1.14E-04
5.87E-06
0.34-0.41
19F3 H2L2
2.59E-10
4.80E+05
6.44E+03
1.24E-04
4.86E-06
0.35-0.39
MEDI9447
1.04E-10
2.34E+05
3.20E+03
2.44E-05
5.02E-06
0.59-0.82
KD为亲和力常数；KD＝kdis/kon
实施例6.FACS检测19F3H2L3抗体的结合能力
常规胰酶消化对数期MDA-MB-231细胞，离心，PBSA重悬；将细胞分装至1.5mL离心管，每管30万细胞，5600rpm离心5min，去上清；加入PBSA稀释的CD73抗体100uL，终浓度分别为100，33.33，11.11，3.7，1.23，0.41，0.14，0.05nM，轻柔混匀后于冰上孵育1h；加入500uLPBSA，5600rpm离心5min，去上清；加入500倍稀释的FITC标记羊抗人IgG二抗(Jackson，Cat.109-095-098)重悬细胞沉淀，冰上避光孵育0.5h；加入500uL PBSA，5600rpm离心5min，去上清；加入200uLPBSA重悬细胞沉淀，并转移至流式管，流式细胞仪(BD FACSCaliburTM)上机检测。
实验结果如表3和图4所示，19F3H2L3与同靶点阳性药MEDI9447结合MDA-MB-231内源表达CD73的能力相当，结合呈剂量依赖关系。在相同的实验条件下，19F3H2L3与MDA-MB-231内源表达CD73的结合EC50为3.423nM，MEDI9447与MDA-MB-231内源表达CD73的结合EC50为1.433nM。
以上实验结果表明，在相同实验条件下19F3H2L3与MDA-MB-231内源表达CD73结合活性与同靶点阳性药MEDI9447的结合活性相当，提示19F3H2L3具有有效结合CD73的功能。
表3.FACS检测19F3H2L3与MDA-MB-231细胞表面CD73结合能力
吸光度(nM)
0.05
0.14
0.41
1.23
3.70
11.11
33.33
100.00
EC<sub>50</sub>
MEDI9447
28.38
43.18
90.96
266.72
454.45
518.94
545.63
580.76
1.433
19F3H2L3
20.04
31.49
61.09
135.31
264.86
407.09
485.32
480.42
3.423
实施例7：抗CD73抗体对抑制细胞内源表达CD73酶活性的检测
1、抗CD73抗体对MDA-MB-231细胞内源表达CD73酶活性的抑制活性检测
实验步骤如下：取状态良好的对数期MDA-MB-231细胞，用无血清的RPMI-1640培养液将细胞重悬、计数；将MDA-MB-231细胞接种至96孔板，3×104个细胞/100μl/孔；用无血清RPMI-1640培养液稀释抗体，起始浓度200ug/ml，按2.5倍进行梯度稀释；将抗体加入96孔板，每孔50ul，37℃孵育1小时。1小时后，每孔加入50ul RPMI-1640稀释的600uM AMP；3小时后取25ul细胞培养液上清，转移至新96孔板，每孔加入25ul100uM的ATP；和50ul CTG(One Solution Assay，promega，Cat：G8461)显色液，进行显色，多标记微孔板检测仪(PerkinElmer2140-0020)读取数据。
实验结果：结果如图5所示，19F3H2L3和同靶点阳性对照药MEDI9447均可呈剂量依赖性抑制MDA-MB-231内源表达的CD73酶催化AMP为腺苷A的活性，从而剂量依赖性降低产生的平均萤光强度RLU。
以上实验结果说明加入的AMP在无CD73抗体处理情况下，可被MDA-MB-231内源表达于细胞表面的CD73酶催化而转化为腺苷A，从而解除对荧光素酶活性的抑制。而加入抗体后，由于CD73被抗体结合，而降低了其酶催化活性，使AMP不能转化为腺苷。提示抗CD73抗体以非底物竞争的方式有效抑制CD73的酶活反应，降低腺苷的产生。
2、在U87-MG细胞中加入抗CD73抗体的酶活性的检测
实验步骤如下：取状态良好的对数期U87-MG细胞，用无血清的RPMI-1640培养液将细胞重悬、计数；将U87-MG细胞接种至96孔板，3×104个细胞/100μl/孔；用无血清RPMI-1640培养液稀释抗体，起始浓度200ug/ml，按2.5倍进行梯度稀释；将抗体加入96孔板，每孔50ul，37℃孵育1小时；1小时后，每孔加入50ul RPMI-1640稀释的600uM AMP；3小时后取25ul细胞培养液上清，转移至新96孔板，每孔加入25ul 100uM的ATP和50ul CTGOne Solution Assay，promega，Cat：G8461)显色液，进行显色，于多标记微孔板检测仪(PerkinElmer2140-0020)读取数据。
实验结果：结果如图6所示，19F3H2L3和同靶点阳性对照药MEDI9447均可呈剂量依赖性抑制MDA-MB-231内源表达的CD73酶催化AMP为腺苷的活性，从而剂量依赖性降低产生的平均萤光强度RLU。
以上实验结果说明加入的AMP在无CD73抗体处理情况下，可被U87-MG内源表达于细胞表面的CD73酶催化而转化为腺苷，从而解除对荧光素酶活性的抑制。而加入抗体后，由于CD73被抗体结合，而降低了其酶催化活性，使AMP不能转化为腺苷。提示抗CD73抗体以非底物竞争的方式有效抑制CD73的酶活反应，降低腺苷的产生。
实施例8：抗CD73抗体与介导抗体依赖的细胞毒效应的FcγRIIIa的动态亲和力测定
样品稀释缓冲液为PBS，0.02％Tween-20，0.1％BSA，pH7.4。0.5μg/mL的FcγRIIIa(来源于Sino Biological，又称为CD16a)固定在SA传感器上，时间120s，传感器在缓冲液中平衡60s，固定在传感器上的CD16a与各抗体结合，抗体浓度为31.3-500nM(两倍梯度稀释)，时间60s，抗体抗原在缓冲液中解离，时间60s。传感器使用10mM NaOH再生。检测温度为30℃，频率为0.6Hz。数据以1∶1模型拟合分析，得到亲和力常数。
结果如表4所示，19F3H2L3(hG1DM)与FcγRIIIa无结合，而MEDI9447与FcγRIIIa具有结合活性，提示19F3H2L3(hG1DM)引起表达有CD73的细胞的抗体依赖的细胞毒效应的风险较低，而MEDI9447存在引起抗体依赖的细胞毒效应的风险。
CD73在血管内皮和正常组织有大量表达，与FcγRIIIa结合介导抗体依赖的细胞毒效应将会导致血管内皮细胞和正常组织的损伤，对抗体药物的安全性有显著影响。
表4.抗CD73抗体与介导抗体依赖的细胞毒效应的FcγRIIIa的动态亲和力测定
KD＝kdis/kon
序列表
19F3重链可变区的核酸序列，下划线表示CDR序列：(SEQ ID NO：1)
19F3重链可变区的氨基酸序列，下划线表示CDR序列：(SEQ ID NO：2)
19F3轻链可变区的核酸序列，下划线表示CDR序列：(SEQ ID NO：3)
19F3轻链可变区的氨基酸序列，下划线表示CDR序列：(SEQ ID NO：4)
19F3H1L1重链可变区的核酸序列，下划线表示CDR序列：(SEQ ID NO：5)
19F3H1L1重链可变区的氨基酸序列，下划线表示CDR序列：(SEQ ID NO：6)
19F3H1L1轻链可变区的核酸序列，下划线表示CDR序列：(SEQ ID NO：7)
19F3H1L1轻链可变区的氨基酸序列，下划线表示CDR序列：(SEQ ID NO：8)
19F3H2L2及19F3H2L3重链可变区的核酸序列，下划线表示CDR序列：(SEQ ID NO：9)
19F3H2L2及19F3H2L3重链可变区的氨基酸序列，下划线表示CDR序列：(SEQ IDNO：10)
19F3H2L2轻链可变区的核酸序列，下划线表示CDR序列：(SEQ ID NO：11)
19F3H2L2轻链可变区的氨基酸序列，下划线表示CDR序列：(SEQ ID NO：12)
19F3H2L3轻链可变区的核酸序列：(SEQ ID NO：13)
19F3H2L3轻链可变区的氨基酸序列，下划线表示CDR序列：(SEQ ID NO：14)
19F3和19F3H1L1、19F3H2L2及19F3H2L3的CDR区
HCDR1：GYSFTGYT(SEQ ID NO：15)
HCDR2：INPYNAGT(SEQ ID NO：16)
HCDR3：ARSEYRYGGDYFDY(SEQ ID NO：17)
LCDR1：QSLLNSSNQKNY(SEQ ID NO：18)
LCDR2：FAS(SEQ ID NO：19)
LCDR3：QQHYDTPYT(SEQ ID NO：20)
19F3H1L1(hG1DM)、19F3H2L2(hG1DM)和19F3H2L3(hG1DM)的重链恒定区序列(330aa，突变位点用下划线加粗标出)：
19F3H1L1(hG1DM)、19F3H2L2(hG1DM)和19F3H2L3(hG1DM)的轻链恒定区序列(107aa)：
19F3H2L3(hG1DM)重链全长
19F3H2L3(hG1DM)轻链全长