一种新型的抗肿瘤转换受体t细胞
阅读说明：本技术 一种新型的抗肿瘤转换受体t细胞 (Novel anti-tumor transformation receptor T cell ) 是由 卢铀 薛建新 仝瑞占 于 2021-07-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种新型的抗肿瘤转换受体T细胞,属于肿瘤的免疫治疗领域。本发明的新型抗肿瘤转换受体T细胞,其核心在于表达一种人工重组的受体蛋白,该受体蛋白依次由下列片段构成：(1)靶向细胞膜的信号肽,(2)抗PD-L1单链抗体段,(3)CD28跨膜及胞内段；所述部分(2)的序列如SEQ ID NO.5～8任一所示。本发明的抗肿瘤转换受体T细胞能将癌细胞表面的PD-L1抑制信号转化为激活信号,激活T细胞,发挥免疫治疗作用。(The invention discloses a novel anti-tumor transformation receptor T cell, and belongs to the field of tumor immunotherapy. The novel anti-tumor transformation receptor T cell of the invention has the core of expressing an artificial recombinant receptor protein which is sequentially composed of the following segments: (1) a cell membrane targeting signal peptide, (2) an anti-PD-L1 single-chain antibody segment, (3) a CD28 transmembrane and intracellular segment; the sequence of the part (2) is shown in any one of SEQ ID NO. 5-8. The anti-tumor transformation receptor T cell can convert a PD-L1 inhibition signal on the surface of a cancer cell into an activation signal, activate the T cell and play a role in immunotherapy.)
技术领域
本发明属于肿瘤的免疫治疗领域，具体涉及一种新型的抗肿瘤转换受体T细胞。
背景技术
近年来，细胞过继免疫治疗(adoptive cellular immunotherapy,ACI)在血液系统肿瘤和实体肿瘤治疗中的应用研究引起了人们的普遍关注。特别是CAR-T(chimericantigen receptor T cell)在血液系统恶性肿瘤的临床治疗取得显著疗效，比如靶向CD19的CAR-T已经批准用于治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)和复发或难治型大B细胞淋巴瘤。然而，CAR-T技术针对实体瘤无法取得与血液肿瘤同样的疗效，其原因是实体瘤具有更为复杂的免疫抑制微环境，包括乏氧、低营养的代谢环境、PD-L1/PD-1等介导免疫抑制的通路等。
目前以PD-1和PD-L1为靶点的免疫检查点抑制剂药物在临床上获得重大进展，通过阻断PD-1和PD-L1免疫检查点通路，恢复T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。但是由于晚期肿瘤患者T细胞的数量有限，并且T细胞杀伤肿瘤细胞时缺少共刺激信号，导致T细胞在杀伤肿瘤细胞时因耗竭而死亡，因而大大限制了PD-1和PD-L1为靶点的抗体药物的临床疗效。
研究一种可以增强T细胞的增殖和扩增能力，适用于实体瘤治疗的产品具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的问题是：提供一种新型的抗肿瘤转换受体T细胞(PDL1/CD28 T细胞)及其制备方法和应用。转换受体T细胞可通过与PDL1结合来传递激活信号(来自转换受体下游的CD28分子)而不是抑制信号，进而逆转PDL1通路对T细胞的免疫抑制，进一步增强T细胞的杀伤能力和增殖活性。
本发明技术方案如下：
一种PD-L1抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5～8任一所示。
一种基因片段，它编码氨基酸序列如SEQ ID NO.5～8任一所示蛋白。
如前述的基因片段，所述基因片段的序列如SEQ ID NO.1～4任一所示。
一种抗肿瘤转换受体，其序列依次包括如下4部分：
(1)靶向细胞膜的信号肽段；
(2)抗PD-L1单链抗体段；
(3)CD28跨膜段；
(4)CD28胞内段；
所述部分(2)的序列如SEQ ID NO.5～8任一所示。
如前述的抗肿瘤转换受体，所述部分(2)的序列如SEQ ID NO.5所示。
如前述的抗肿瘤转换受体，所述部分(1)的序列如SEQ ID NO.15所示；
和/或，所述部分(3)的序列如SEQ ID NO.17所示；
和/或，所述部分(4)的序列如SEQ ID NO.18所示。
如前述的抗肿瘤转换受体，所述部分(2)和部分(3)之间还有连接肽段，优选地，所述连接肽段序列如SEQ ID NO.16所示。
如前述的抗肿瘤转换受体，序列如SEQ ID NO.14所示。
编码前述抗肿瘤转换受体的基因片段。
一种重组病毒，所述病毒携带前述基因片段。
如前述的重组病毒，所述病毒为慢病毒。
一种重组T细胞，所述T细胞携带前述基因片段和/或前述抗肿瘤转换受体。
前述的PD-L1抗体、抗肿瘤转换受体、重组病毒或T细胞在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
如前述的用途，所述肿瘤为实体瘤；优选的，所述实体瘤为肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、肝癌、鼻咽癌、食管癌、宫颈癌、乳腺癌或胃癌。
本发明的有益效果：
本发明的抗肿瘤转换受体，缩短了PD-L1抗体的长度，可将PD-L1对T细胞的抑制信号转化为激活信号，增强T细胞的活性和增殖能力，使其具备治疗实体瘤的能力。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的
具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为重组慢病毒载体pHBLV-EF1A-αPD-L1-CD28-T2A-Mcherry结构示意图。
图2为慢病毒转染293T细胞的检测结果图，其中，a为倒置显微镜观察图，b为荧光显微镜观察图。
图3为慢病毒感染T细胞的检测结果图。
图4为αPDL1/CD28 T细胞、空载T细胞、对照T细胞与CD3抗体+PD-L1蛋白作用24小时后CD69的表达情况。
图5为αPDL1/CD28 T细胞、空载T细胞、对照T细胞与CD3抗体+PD-L1蛋白作用24小时后4-1BB的表达情况。
图6为αPDL1/CD28 T细胞、空载T细胞、对照T细胞在不同条件下作用24小时后上清中IL2、IFNγ、TNFα的分泌情况。
图7为αPDL1/CD28 T细胞、空载T细胞、对照T细胞在不同条件下刺激48小时后的凋亡情况。
图8为αPDL1/CD28 T细胞、空载T细胞、对照T细胞在不同条件下刺激48小时后的记忆表型情况。
图9为cell proliferation dye标记的αPDL1/CD28 T细胞、空载T细胞、对照T细胞在CD3抗体+PD-L1蛋白作用后不同时间点的增殖情况。
图10为αPDL1/CD28 T细胞、空载T细胞、对照T细胞在不同条件下刺激后的CD107a分泌情况。
图11为各组T细胞与PDL1结合力的检测结果。
图12为各组T细胞经条件刺激后的活化指标的表达结果。
图13为各组T细胞经条件刺激后记忆表型的结果。
图14为各组T细胞经条件刺激后CD107a分泌的结果。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1、抗肿瘤转换受体T细胞的制备
一、慢病毒构建
1.构建慢病毒载体质粒
1.1设计PD-L1抗体基因序列
共4条，分别为：
第一条PD-L1抗体基因序列(SEQ ID NO.1)：
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGGCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGAAGTATCAGCAGTTTCGACGCAGTGCTCTGGTACCGCCGGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGATTGGGTCGCAACTTCTTTTACCGCCGGTCACACAATCTATGAAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAGGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAAACTGAGGACACAGGCGACTATTATTGTAATGCGAGGCGACTAGGTGCGCACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAAGAC
第二条PD-L1抗体基因序列(SEQ ID NO.2)：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGAGCTGCGTGGCTAGCGGCTCTCATCTTAGCTTCGACGCCGTGCTGTGGTACAGGCAGGCTCCTGGCAAGCAGCGGGATTGGGTGGCCACCAGCTTCACAGCTGGCTATACTATCTACGAGGACTCTGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCCGCGATAACGCTAAGAATACAGTGTATCTGCAGATGAACTCTCTGCGCGCCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGTAATGCCAGGCGGCTGGGCGCTCATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTTCC
第三条PD-L1抗体基因序列(SEQ ID NO.3)：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGAGCTGCGTGGCTAGCGGCTCTGTTTCCAGCTTCGACGCCGTGCTGTGGTACAGGCAGGCTCCTGGCAAGCAGCGGGATTGGGTGGCCACCAGCTTCACAGCTGGTTATACCATCTACGAGGACTCTGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCCGCGATAACGCTAAGAATACAGTGTATCTGCAGATGAACTCTCTGCGCGCCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGTAATGCCAGGCGGCTGGGCGCTCATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTTCC
第四条PD-L1抗体基因序列(SEQ ID NO.4)：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGAGCTGCGTGGCTAGCGGCTCTGATGTGAGCTTCGACGCCGTGCTGTGGTACAGGCAGGCTCCTGGCAAGCAGCGGGATTGGGTGGCCACCAGCTTCACAGCTGGCTGGGAGATCTACGAGGACTCTGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCCGCGATAACGCTAAGAATACAGTGTATCTGCAGATGAACTCTCTGCGCGCCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGTAATGCCAGGCGGCTGGGCGCTCATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTTCC
对应的氨基酸序列：
第一条PD-L1抗体(SEQ ID NO.5)：
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGSISSFDAVLWYRRAPGKQRDWVATSFTAGHTIYEDSVKGRFTISRDNARNTVYLQMNSLKTEDTGDYYCNARRLGAHYWGQGTQVTVSSEPKTPKPQD
第二条PD-L1抗体(SEQ ID NO.6)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGSHLSFDAVLWYRQAPGKQRDWVATSFTAGYTIYEDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCNARRLGAHYWGQGTLVTVSS
第三条PD-L1抗体(SEQ ID NO.7)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGSVSSFDAVLWYRQAPGKQRDWVATSFTAGYTIYEDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCNARRLGAHYWGQGTLVTVSS
第四条PD-L1抗体(SEQ ID NO.8)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGSDVSFDAVLWYRQAPGKQRDWVATSFTAGWEIYEDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCNARRLGAHYWGQGTLVTVSS
1.2合成αPD-L1-CD28基因片段
通过全基因合成方法，合成将PD-L1抗体基因序列分别与信号肽、CD28铰链段、CD28跨膜段、CD28胞内段相连接的DNA序列，顺序为信号肽-PD-L1抗体-CD28铰链段-CD28跨膜段-CD28胞内段。
以第一条PD-L1抗体基因所对应αPD-L1-CD28为例，其DNA序列(SEQ ID NO.9)为：
注：小写非斜体部分(SEQ ID NO.10)为信号肽段；大写加粗部分为抗PD-L1段序列；小写斜体部分(SEQ ID NO.11)为CD28铰链(hinge)段，起连接作用；划线部分(SEQ IDNO.12)为CD28跨膜段；大写斜体部分(SEQ ID NO.13)为CD28胞内段。
第一条αPD-L1-CD28基因片段编码的蛋白序列(SEQ ID NO.14)为：
注：小写非斜体部分(SEQ ID NO.15)为信号肽段；大写加粗部分为抗PD-L1段序列；小写斜体部分(SEQ ID NO.16)为CD28铰链(hinge)段，起连接作用；划线部分(SEQ IDNO.17)为CD28跨膜段；大写斜体部分(SEQ ID NO.18)为CD28胞内段。
将得到的αPD-L1-CD28基因片段克隆到pHBLV-EF1A-MCS-T2A-Mcherry慢病毒载体上，如图1所示，构建重组pHBLV-EF1A-αPD-L1-CD28-T2A-Mcherry慢病毒载体。
分别取1支100μL的感受态细胞(购自北京擎科生物科技有限公司)，将1μg目的质粒pHBLV-EF1A-αPD-L1-CD28-T2A-Mcherry加入感受态细胞中，并将各1μg的慢病毒包装辅助质粒pSPAX2、PMD2G，分别加入100μL的感受态细胞中，经充分混匀后，分别置于冰上孵育30分钟，然后立即于42℃水浴锅中热击45秒，再于冰浴中放置2分钟。然后分别加入含50μg/mL的氨苄青霉素溶液的LB培养基(目的质粒pHBLV-EF1A-αPD-L1-CD28-T2A-Mcherry与包装质粒pSPAX2、PMD2G均为氨苄青霉素抗性)，充分混匀后，置于37℃摇床，以220rpm/min恒温振荡培养12～16小时。
采用QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit试剂盒，采用Nanodrop超微量分光光度计分别测定目的质粒、包装质粒的浓度和纯度，然后置于-20℃冰箱保存。
2.慢病毒的包装
293T细胞的准备：接种对数生长期的293T细胞于6孔板中，调整细胞密度为5×105细胞/孔，37℃、5％CO2培养箱中培养，待细胞密度达70-80％即用于转染。
采用Lipofiter 3.0(购自汉恒生物科技(上海)有限公司，产品货号为HB-LF3-1000)进行慢病毒包装，具体步骤如下：
①向250μL DMEM培养基中加入4μg质粒(0.8μg pMD2.G+1.6μgpsPAX+1.6μg目的质粒)，用枪轻轻吹打混匀；另250μL DMEM中加入6μLLipofiter 3.0，用枪吹打混匀，室温放置5min；
②将上述两种溶液混合，用枪轻轻吹打混匀；
③室温孵育20min；
④将上述混合液均匀加至6孔板的一个孔中，混匀；
⑤细胞培养箱中培养6-12h，更换新鲜培养基；
⑥转染24h后荧光显微镜观察293T细胞的红色荧光蛋白表达情况(如图2所示)，转染48h后收病毒。
3.慢病毒浓缩液的制备
使用0.22μm(Millipore)滤头过滤病毒。使用PEG Virus Precipitation Kit试剂盒浓缩病毒(美国BioVision公司，货号K904-50/200)。向收取的病毒中，按体积加入PEGSolution(5×)(20ml过滤后的病毒上清+5ml PEG)，混匀，置于4℃过夜静置。离心收取的病毒上清(4℃，4000rpm/15分钟)，以沉淀病毒。倒掉上清，用Virus Re-suspension Solution溶解，分装，-80℃冻存。
二、慢病毒感染T细胞
1.T细胞培养基
ImmunoCultTM-XF T Cell Expansion Medium(STEMCELL公司，货号为10981)，添加10ng/ml的白介素2(STEMCELL公司，货号为78036)。
2.方法
取T细胞接种于24孔细胞培养板中，接种浓度为1×106个/孔，按细胞：磁珠比例为1：3加入Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Gibco公司，货号为11131D)激活T细胞。加入磁珠24小时后，将T细胞转移至包被了RetroNectin(Recombinant Human FibronectinFragment)的孔板中，加入慢病毒浓缩液(感染复数＝30)，并加入促感试剂HitransG A(上海吉凯基因医学科技股份有限公司，货号genechem REVG004)，混匀后，置于37℃培养箱中培养。每隔2天进行一次T细胞传代，收获扩增的T细胞，命名为αPDL1/CD28T细胞。
以下用实验例的形式对本发明αPDL1/CD28 T细胞的有益效果做进一步说明，因四种PDL1抗体序列结果相似，实验例1～8采用的PD-L1抗体基因为SEQ ID NO.4所示基因。
实验例1、αPDL1/CD28 T细胞感染效率的检测
1、细胞准备
αPDL1/CD28 T细胞、空载T细胞(在实施例1的基础上省略αPD-L1-CD28基因片段，转入慢病毒空载体)、对照T细胞。
2、抗体检测
分别向每种细胞悬液中加入终浓度为1μg/ml的biotinylated human PD-L1蛋白，冰上避光孵育30分钟后，用洗涤缓冲液洗涤1次，以300g离心5分钟，去除上清，加入50μl 1：200PBS稀释的streptavidin APC conjugate(Thermo Fisher Scientific公司，货号SA1005)，混匀后冰上避光孵育30分钟。用洗涤缓冲液洗涤1次，以300g离心5分钟，去除上清，用200μL PBS缓冲液重悬细胞。用流式细胞仪分别对样本进行检测分析。
3、结果
结果如图3所示。检测结果表明，αPDL1/CD28 T细胞中识别PD-L1的比例为71.7％，而空载T细胞、对照T细胞几乎不能识别PD-L1；αPDL1/CD28 T细胞表达RFP的比例为75.5％，空载T细胞表达RFP的比例为89％，对照T细胞不表达RFP。
4、结论
本发明的αPDL1/CD28 T细胞可较好地识别PD-L1。
实验例2、αPDL1/CD28 T细胞活化状态的表型分析
1、方法
准备一块96孔板，每孔加入60μl包被液，包被液成分为1μg/ml的CD3抗体(Miltenyi公司，货号170-076-309)和/或25μg/ml的PD-L1蛋白(Sino Biological公司，货号10084-H05H)，4℃过夜。
分别取实施例1获得的慢病毒感染T细胞(即αPDL1/CD28 T细胞)和空载T细胞、对照T细胞种入各孔中，每孔细胞数为2×105，置于37℃孵箱内培养。
24h后收集各孔细胞，用洗涤缓冲液洗涤1次，以300g离心5分钟，去除上清，再用100μL洗涤缓冲液重悬细胞，得到细胞悬液。
1)CD69的检测：分别向细胞悬液的样本中，加入PE-Cy7标记的小鼠抗人CD69单抗(购自美国BD Biosciences公司，产品货号为557745)5μL，冰上避光孵育30分钟后，用洗涤缓冲液洗涤两次，以300g离心5分钟，去除上清，然后加入200μL PBS缓冲液重悬细胞，用流式细胞仪分别对各样本进行检测。
2)4-1BB的检测：分别向细胞悬液的样本中，加入APC标记的小鼠抗人4-1BB单抗(购自美国BD Biosciences公司，产品货号为550890)5μL，冰上避光孵育30分钟后，用洗涤缓冲液洗涤两次，以300g离心5分钟，去除上清，然后加入400μL PBS缓冲液重悬细胞，用流式细胞仪分别对各样本进行检测。
2、结果
CD69和4-1BB的检测结果如图4、图5所示。可见，CD3抗体刺激后，各组T细胞CD69、4-1BB表达均有提高；但经CD3抗体+PD-L1蛋白作用后，αPDL1/CD28 T细胞CD69、4-1BB的表达进一步升高，但空载T细胞、对照T细胞CD69、4-1BB的表达下降。
3、结论
CD3抗体可诱导T细胞活化，CD69、4-1BB是T细胞活化的标志物，而PD-L1蛋白可结合T细胞表面的PD-1，抑制T细胞活化。
本实验例结果表明，αPDL1/CD28 T细胞能够将PD-L1蛋白的抑制性信号转变为激活信号，提高T细胞对PD-L1阳性肿瘤的杀伤能力。
实验例3、αPDL1/CD28 T细胞分泌细胞因子的检测
1、方法
准备一块96孔板，每孔加入60μl包被液，包被液成分为1μg/ml的CD3抗体(Miltenyi公司，货号170-076-309)和/或25μg/ml的PD-L1蛋白(Sino Biological公司，货号10084-H05H)，4℃过夜。
分别取实施例1获得的慢病毒感染T细胞(即αPDL1/CD28 T细胞)和空载T细胞、对照T细胞种入各孔中，每孔细胞数为2×105，置于37℃孵箱内培养。
取培养24h后的培养上清，采用ELISA试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司，货号77-7025、88-7316)检测培养上清中IL2、IFNγ、TNFα的含量。
2、结果
细胞因子检测结果如图6所示，经CD3抗体+PD-L1蛋白作用后，相较于空载T细胞、对照T细胞，αPDL1/CD28 T细胞培养上清中IL2、IFNγ、TNFα显著升高。
3、结论
IL2、IFNγ、TNFα是T细胞活化后产生的可增强NK细胞活性的因子，CD3抗体和PD-L1作用下，αPDL1/CD28 T细胞分泌细胞因子提高，利于抗肿瘤治疗。
实验例4、αPDL1/CD28 T细胞的凋亡表型检测
1、方法
准备一块96孔板，每孔加入60μl包被液，包被液成分为1μg/ml的CD3抗体(Miltenyi公司，货号170-076-309)和/或25μg/ml的PD-L1蛋白(Sino Biological公司，货号10084-H05H)，4℃过夜。
分别取实施例1获得的慢病毒感染T细胞(即αPDL1/CD28 T细胞)和空载T细胞、对照T细胞种入各孔中，每孔细胞数为2×105，置于37℃孵箱内培养。
48h后收集各孔细胞，用洗涤缓冲液洗涤1次，以300g离心5分钟，去除上清，再用100μL洗涤缓冲液重悬细胞，得到细胞悬液。
采用Annexin V/PI细胞凋亡试剂盒进行流式染色，用流式细胞仪分别对各样本进行检测分析。
2、结果
结果如图7所示，经CD3抗体+PD-L1蛋白作用后，相较于空载T细胞、对照T细胞，αPDL1/CD28 T细胞早期凋亡、晚期凋亡的比例均有下降。
3、结论
本发明的αPDL1/CD28 T细胞寿命长，相比普通T细胞能长期地发挥抗肿瘤作用。
实验例5、αPDL1/CD28 T细胞的记忆表型检测
1、方法
准备一块96孔板，每孔加入60μl包被液，包被液成分为1μg/ml的CD3抗体(Miltenyi公司，货号170-076-309)和/或25μg/ml的PD-L1蛋白(Sino Biological公司，货号10084-H05H)，4℃过夜。
分别取实施例1获得的慢病毒感染T细胞(即αPDL1/CD28 T细胞)和空载T细胞、对照T细胞种入各孔中，每孔细胞数为2×105，置于37℃孵箱内培养。
48h后收集各孔细胞，用洗涤缓冲液洗涤1次，以300g离心5分钟，去除上清，再用100μL洗涤缓冲液重悬细胞，得到细胞悬液。
分别向细胞悬液的样本中，加入PE标记的小鼠抗人CD62L单抗(购自美国BDBiosciences公司，产品货号为555544)20μL、PerCP-Cy5.5标记的小鼠抗人CD45RO单抗(购自美国BD Biosciences公司，产品货号为560607)。冰上避光孵育30分钟后，用洗涤缓冲液洗涤两次，以300g离心5分钟，去除上清，然后加入200μL PBS缓冲液重悬细胞。用流式细胞仪分别对各样本进行检测分析。
2、结果
如图8所示，经CD3抗体+PD-L1蛋白作用后，αPDL1/CD28 T细胞的记忆表型有明显改变，T细胞明显减少，效应记忆和中央记忆T细胞明显增多。
3、结论
经CD3抗体+PD-L1蛋白作用，αPDL1/CD28 T细胞能更多地转化为记忆表型T细胞，更迅速地发挥免疫功能，抗癌作用更强。
实验例6、αPDL1/CD28 T细胞的增殖表型检测
1、方法
准备一块96孔板，每孔加入60μl包被液，包被液成分为1μg/ml的CD3抗体(Miltenyi公司，货号170-076-309)和/或25μg/ml的PD-L1蛋白(Sino Biological公司，货号10084-H05H)，4℃过夜。
分别取实施例1获得的慢病毒感染T细胞(即αPDL1/CD28 T细胞)和空载T细胞、对照T细胞种入各孔中，采用eBiosience Cell Proliferation dye(Thermo FisherScientific公司，货号65-0840)标记各组T细胞，种于包被好的板内，置于37℃孵箱内培养。
分别于种板后第4、8天收集细胞，用洗涤缓冲液洗涤1次，以300g离心5分钟，去除上清，然后加入200μL PBS缓冲液重悬细胞。用流式细胞仪分别对各样本进行检测分析。
2、结果
如图9所示，经CD3抗体+PD-L1蛋白作用后，αPDL1/CD28 T细胞增殖染料峰左移。
3、结论
经CD3抗体+PD-L1蛋白作用后，αPDL1/CD28 T细胞增殖能力提高。
实验例7αPDL1/CD28 T细胞分泌CD107a的功能检测
1、方法
准备一块96孔板，每孔加入60μl包被液，包被液成分为1μg/ml的CD3抗体(Miltenyi公司，货号170-076-309)和/或25μg/ml的PD-L1蛋白(Sino Biological公司，货号10084-H05H)，4℃过夜。
分别取实施例1获得的慢病毒感染T细胞(即αPDL1/CD28 T细胞)和空载T细胞、对照T细胞种入各孔中，每孔加入5μl CD107a-APC抗体混匀，500rpm离心3min，置于37℃孵箱内培养。
1小时后，用无血清的培养基1:150比例稀释GolgiStop(购自美国BD Biosciences公司，产品货号为554724)，按10μl/孔加入到96孔板中，混匀后置于37℃孵箱内培养。
2.5小时后，从96孔板中吸出细胞制备单细胞悬液，加入CD3-BV510、CD8-FITC抗体染色，2μl/孔，冰上避光孵育30分钟后，用洗涤缓冲液洗涤两次，以300g离心5分钟，去除上清，然后加入200μL PBS缓冲液重悬细胞。用流式细胞仪分别对各样本进行检测分析。
2、结果
T细胞分泌CD107a检测结果如图10所示，相较于空载T细胞和对照T细胞，αPDL1/CD28 T细胞经CD3抗体+PDL1蛋白刺激后CD107a分泌显著增多，而空载T细胞和对照T细胞CD107a分泌在PDL1作用后受到抑制。
3、结论
αPDL1/CD28 T细胞具有更强的分泌CD107a的能力。
实验例8αPDL1/CD28 T细胞与其它转换受体T细胞的功能实验对比
1、方法
转换受体T细胞已有文献报道，其转换受体结构为PD1-CD28。通过慢病毒感染的方式同期制备αPDL1/CD28 T细胞、PD1/CD28 T细胞、空载T细胞，行实验例1、2、5、7，对αPDL1/CD28 T细胞和PD1/CD28 T细胞进行功能对比。
2、结果
各组T细胞与PDL1结合力的检测结果如图11所示。在αPDL1/CD28 T细胞、PD1/CD28T细胞感染效率相当的情况下(红色荧光标签表达均约70％)，αPDL1/CD28 T细胞对PDL1的结合能力明显高于PD1-CD28-T细胞。
各组T细胞经条件刺激后的活化指标的表达结果如图12所示。αCD3作用24h后，各组T细胞活化指标表达显著增加；随着PDL1剂量的提高，空载T细胞活化指标表达显著降低，而αPDL1/CD28 T细胞、PD1/CD28 T细胞活化指标表达进一步升高，表明其对PDL1抑制信号的转换作用。在αCD3+PDL1刺激的同等条件下，αPDL1/CD28 T细胞细胞的活化指标表达高于PD1-CD28-T细胞。
各组T细胞经条件刺激后记忆表型的结果如图13所示。αCD3作用24h后，各组T细胞比例明显下降、中央记忆细胞比例增高；随着PDL1剂量的提高，空载T细胞比例增加、中央记忆T细胞比例降低，而αPDL1/CD28 T细胞和PD1/CD28 T细胞的比例持续下降、中央记忆T细胞比例持续升高。在αCD3+PDL1刺激的同等条件下，αPDL1/CD28 T细胞的比例低于PD1/CD28 T细胞，而中央记忆比例高于PD1/CD28 T细胞。
各组T细胞经条件刺激后CD107a分泌的结果如图14所示。αCD3作用4h后，各组T细胞分泌CD107a显著增加；随着PDL1剂量的提高，空载T细胞107a显著降低，而αPDL1/CD28 T细胞和PD1/CD28 T细胞CD107a分泌进一步升高，表明其转换PDL1抑制信号的作用。在αCD3+PDL1刺激的同等条件下，αPDL1/CD28 T细胞的CD107a分泌高于PD1/CD28 T细胞。
综上，本发明的αPDL1/CD28 T细胞，在经CD3抗体和PD-L1蛋白作用后，将PD-L1蛋白的抑制信号转化为激活信号，促进T细胞因子的分泌，减少T细胞凋亡，增加记忆表型T细胞，提高T细胞增殖能力。相比普通T细胞，本发明的αPDL1/CD28 T细胞具备更强的抗肿瘤能力，具备治疗实体瘤的能力。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学华西医院
<120> 一种新型的抗肿瘤转换受体T细胞
<130> GYKH1352-2021P0113537CCZ
<150> 2020113667589
<151> 2020-11-26
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagg ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgtag cctctggaag tatcagcagt ttcgacgcag tgctctggta ccgccgggct 120
ccagggaagc agcgcgattg ggtcgcaact tcttttaccg ccggtcacac aatctatgaa 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaggaacac ggtgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaaac tgaggacaca ggcgactatt attgtaatgc gaggcgacta 300
ggtgcgcact actggggcca ggggacccag gtcaccgtct cctcagaacc caagacacca 360
aaaccacaag ac 372
<210> 2
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaggtgcagc tggtggagtc cggaggagga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg 60
agctgcgtgg ctagcggctc tcatcttagc ttcgacgccg tgctgtggta caggcaggct 120
cctggcaagc agcgggattg ggtggccacc agcttcacag ctggctatac tatctacgag 180
gactctgtga agggcaggtt caccatctcc cgcgataacg ctaagaatac agtgtatctg 240
cagatgaact ctctgcgcgc cgaggacaca gccgtgtact attgtaatgc caggcggctg 300
ggcgctcatt attggggcca gggcaccctg gtgacagtgt cttcc 345
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gaggtgcagc tggtggagtc cggaggagga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg 60
agctgcgtgg ctagcggctc tgtttccagc ttcgacgccg tgctgtggta caggcaggct 120
cctggcaagc agcgggattg ggtggccacc agcttcacag ctggttatac catctacgag 180
gactctgtga agggcaggtt caccatctcc cgcgataacg ctaagaatac agtgtatctg 240
cagatgaact ctctgcgcgc cgaggacaca gccgtgtact attgtaatgc caggcggctg 300
ggcgctcatt attggggcca gggcaccctg gtgacagtgt cttcc 345
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<212> DNA
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Ser Ser Phe Asp
20 25 30
Ala Val Leu Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ser Phe Thr Ala Gly His Thr Ile Tyr Glu Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Asp Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Arg Arg Leu Gly Ala His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser His Leu Ser Phe Asp
20 25 30
Ala Val Leu Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ser Phe Thr Ala Gly Tyr Thr Ile Tyr Glu Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
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85 90 95
Ala Arg Arg Leu Gly Ala His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Val Ser Ser Phe Asp
20 25 30
Ala Val Leu Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ser Phe Thr Ala Gly Tyr Thr Ile Tyr Glu Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
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115
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Asp Val Ser Phe Asp
20 25 30
Ala Val Leu Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ser Phe Thr Ala Gly Trp Glu Ile Tyr Glu Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
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Ala Arg Arg Leu Gly Ala His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
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115
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<212> DNA
<213> 人工序列
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atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
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cgggctccag ggaagcagcg cgattgggtc gcaacttctt ttaccgccgg tcacacaatc 240
tatgaagact ccgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaacgccag gaacacggtg 300
tatctgcaaa tgaacagcct gaaaactgag gacacaggcg actattattg taatgcgagg 360
cgactaggtg cgcactactg gggccagggg acccaggtca ccgtctcctc agaacccaag 420
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atccca 66
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accattatcc atgtgaaagg gaaacacctt tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct 120
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gcctttatta ttttctgggt g 81
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
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Ser Ile Ser Ser Phe Asp Ala Val Leu Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly
50 55 60
Lys Gln Arg Asp Trp Val Ala Thr Ser Phe Thr Ala Gly His Thr Ile
65 70 75 80
Tyr Glu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
85 90 95
Arg Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr
100 105 110
Gly Asp Tyr Tyr Cys Asn Ala Arg Arg Leu Gly Ala His Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro
130 135 140
Gln Asp Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp
145 150 155 160
Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu
165 170 175
Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu
180 185 190
Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val
195 200 205
Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His
210 215 220
Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys
225 230 235 240
His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
245 250 255
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<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
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Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
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Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
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<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu
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Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro
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Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
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<213> 人工序列
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Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
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<213> 人工序列
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Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
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Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
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