一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源单克隆抗体、其嵌合抗原受体及应用
阅读说明：本技术 一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源单克隆抗体、其嵌合抗原受体及应用 (Fully human monoclonal antibody of glypican 3, chimeric antigen receptor and application thereof ) 是由 蒋小滔 刘璇 吴砂 于 2021-07-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源单克隆抗体,其包括重链CDR1-CDR3和轻链CDR1-CDR3,其中,所述重链CDR1-CDR3包括氨基酸序列1-3；所述轻链CDR1-CDR3包括氨基酸序列4-6。本发明还涉及有关该磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源单克隆抗体的制备方法；以及基于该磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源单克隆抗体的全人源嵌合抗原受体。本发明还涉及该磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源单克隆抗体作为药物在抗肿瘤、抗肝癌领域的应用。(The invention relates to a fully human monoclonal antibody to glypican 3 comprising heavy chain CDRs 1-CDR3 and light chain CDRs 1-CDR3, wherein the heavy chain CDRs 1-CDR3 comprise amino acid sequences 1-3; the light chain CDRs 1-CDR3 include amino acid sequences 4-6. The invention also relates to a preparation method of the fully human monoclonal antibody of the glypican 3; and a fully human chimeric antigen receptor based on the fully human monoclonal antibody to glypican 3. The invention also relates to the application of the fully human monoclonal antibody of glypican 3 as a medicament in the fields of tumor resistance and liver cancer resistance.)
技术领域
本发明属于生物基因领域，具体涉及一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源单克隆抗体、其嵌合抗原受体及应用。
背景技术
中国是肝癌大国，2020年，中国有39万人死于肝癌，在所有癌症中排第二位，仅次于肺癌，给人民群众的身体健康带来严重威胁。
手术、放疗和化疗，是目前临床上治疗肿瘤的三大传统治疗方法。手术可以切除肉眼可见或影像学可见的肿瘤，但对于通过血液循环和淋巴循环转移的、肉眼或影像学不可见的肿瘤细胞则无能为力。而且肝癌术后的复发率非常高，其5年生存率只有10％左右。放疗和化疗都属于非特异性疗法，除了杀伤肿瘤细胞外，对正常组织和细胞尤其是分裂旺盛的造血干细胞抑制明显，从而带来明显的副作用。2008年，索拉菲尼(Sorafenib)成为第一个被批准用于临床治疗肝癌的分子靶向药物；2017年12月，瑞戈菲尼(Stivarga)作为二线治疗肝癌的靶向药物在中国获批上市。然而它们的实际疗效仍远不能令人满意，患者总体生存时间只能延长2-3个月。因此，亟需开发出新的、有效的肝癌治疗方法。
嵌合抗原受体T细胞(ChimericAntigenReceptor-Tcell，简称CAR-T)是近几年发展起来的免疫治疗方法，已在血液肿瘤的治疗中显示出极强的抗肿瘤效果。图1示出了嵌合抗原受体(CAR)结合T细胞形成CAR-T的过程示意图。可见CAR-T结合了抗体与T细胞各自的优点，其优点为(1)其胞外区为抗体的可变区，可以特异性识别肿瘤抗原；(2)胞内区为T细胞活化信号分子CD3ζ及辅助刺激分子CD28或4-1BB。2017年8月和10月，美国FDA相继批准了世界上第一和第二个CAR-T产品，分别用于治疗儿童及青年的急性淋巴细胞性白血病和成人弥漫性大B细胞淋巴瘤。在全世界范围内，以CAR-T为治疗手段的临床试验近几年呈爆炸式增长。截止2021年6月，全世界登记注册的CAR-T临床试验(https://clinicaltrials.gov/)就达1220项之多，其中在中国开展的就有448项，占36.72％。2021年6月22日，中国国家药品监督管理局(NMPA)正式批准复星凯特CAR-T产品阿基仑赛注射液(即抗人CD19的CAR-T细胞注射液)上市，这意味着中国终于迎来了细胞免疫治疗元年。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，简称GPC3)是一种硫酸乙酰肝素糖蛋白，主要表达于细胞膜表面。图2示出了磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的结构示意图。GPC3核心蛋白包含580个氨基酸，分子量为70kD，中间为Furin蛋白酶酶切位点。Furin蛋白酶裂解Arg358和Cys359形成40kD的氨基末端亚基和30kD的羧基末端亚基，两个亚基以二硫键相连接；羧基末端通过与糖基磷脂酰肌醇(GPI)共价结合而锚定于细胞膜上，两条硫酸乙酰肝素侧链分别位于Cys495和Cys508上。
GPC3表达具有较高的特异性，在成人肝癌以及多种儿童恶性实体瘤如卵黄囊肿瘤、肝母细胞瘤、未分化肉瘤、威尔姆斯肉瘤、横纹肌肉瘤以及未成熟畸胎瘤等高表达；在正常人组织中几乎不表达，因此其有望成为肝癌和儿童恶性实体瘤免疫治疗的理想靶点之一。
在已有报道中，CN109021108A公开了一种抗GPC3全人源化抗体、其CAR及应用。然而，其缺陷在于：在筛选抗体的过程中，其使用的是全长GPC3，而天然的全长GPC3其羧基末端靠近细胞膜，被大量的多糖覆盖(如图2所示)，导致难以被抗体识别，从而影响抗肿瘤效果。
因此，亟需在已有报道的基础上，提供更为优化的技术方案，从而克服上述缺陷。
发明内容
基于此，本发明公开了一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源单克隆抗体，以及通过分子生物学、合成生物学和免疫学方法，制备了基于该磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源单克隆抗体的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3全人源CAR。与现有技术相比，其具有以下进步：(1)本发明所涉及的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源单克隆抗体，是用40KD的氨基端亚基作为筛选抗原而获得，其识别表位为GPC3的氨基端亚基。而氨基端亚基位于羧基端亚基的外侧，更容易被免疫细胞识别，从而更好的介导对肿瘤细胞的杀伤。(2)本发明所涉及的全人源单克隆抗体，其对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的亲和力为0.667nM，比现有技术中所公开的抗体都要高，识别抗原的能力更强。
本发明所涉及的术语“单克隆抗体”，是指由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。
本发明所涉及的术语“嵌合抗原受体”，是指一种人造受体，经过基因工程改造，赋予免疫细胞(如T淋巴细胞)靶向特定抗原的新能力。这些受体是嵌合的，因为它们将抗体中特异性识别抗原的结构域和T细胞激活功能域结合到一个受体中。
本发明所涉及的术语“重链CDR”，即，重链的互补决定区，是指抗体重链可变区的核心保守结构，是决定抗体结合抗原的关键区域，包括CDR1，CDR2和CDR3。
本发明所涉及的术语“轻链CDR”，即，轻链的互补决定区，是指抗体轻链可变区的核心保守结构，是决定抗体结合抗原的关键区域，包括CDR1，CDR2和CDR3。
本发明的一个目的在于，提供一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源单克隆抗体。
一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源单克隆抗体，其包括重链CDR1-CDR3和轻链CDR1-CDR3，
其中，
所述重链CDR1-CDR3包括氨基酸序列1-3；
所述轻链CDR1-CDR3包括氨基酸序列4-6；
所述氨基酸序列1-6如SEQ ID No.1-SEQ ID No.6所示。
进一步地，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。
进一步地，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
进一步地，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源单克隆抗体选自单域结构抗体、Fab片段抗体、F(ab')2片段抗体、单链可变区片段抗体或双特异性抗体的一种。
本发明的另一个目的，在于提供上述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源单克隆抗体的制备方法，其包括如下步骤：
S1.将磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的氨基末端连接氨基酸序列，得到经修饰的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗原，
S2.将所述经修饰的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗原进行噬菌体展示技术筛选实验，得到磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源单克隆抗体。
进一步地，所述经修饰的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗原的氨基酸序列如SEQ IDNo.14所示。
进一步地，所述筛选次数为1-5次。
本发明的另一个目的，在于提供一种全人源CAR，其是基于上述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源单克隆抗体制备而成。
进一步地，所述全人源CAR，包含CD8铰链区的氨基酸序列，即SEQ ID No.9所示氨基酸序列。
进一步地，所述全人源CAR，包含人CD28跨膜区的氨基酸序列，即SEQ ID No.10所示氨基酸序列。
进一步地，所述全人源CAR，包含人4-1BB胞内区的氨基酸序列，即SEQ ID No.11所示氨基酸序列。
进一步地，所述全人源CAR，包含人CD3ζ胞内区免疫受体络氨酸活化基序氨基酸序列，即SEQ ID No.12所示氨基酸序列；
优选地，所述全人源CAR氨基酸序列如SEQ ID No.13所示。
本发明的另一个目的，在于提供上述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源单克隆抗体，作为抗肿瘤的药物的应用。
本发明的另一个目的，在于提供上述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源单克隆抗体，作为抗肝癌的药物的应用。
本发明具有以下有益效果：
(1)以磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的氨基端作为筛选抗原，其筛选到所得的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源单克隆抗体能更好的识别肿瘤细胞；基于该磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源单克隆抗体的CAR-T细胞具有更好的杀伤肿瘤细胞的效果；
(2)本发明所涉及的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源单克隆抗体，其对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的亲和力为0.667nM，比现有技术中所公开的抗体都要高，识别抗原的能力更强。
附图说明
图1示出了CAR结合T细胞形成CAR-T的过程示意图。
图2示出了磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的结构示意图。
图3示出了磷脂酰肌醇蛋白聚糖3氨基端亚基原核表达载体构建示意图。
图4示出了SDS-PAGE检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖3氨基端亚基的表达。
其中：第一列M1：蛋白标记；第二列NC：未加IPTG诱导的细菌裂解物；第三列1：加IPTG后，15℃下诱导16h的细菌裂解液；第四列2：加IPTG后，37℃下诱导4h的细菌裂解液；第五列NC1：未加IPTG诱导的细菌裂解物离心后的上清液；第六列3：加IPTG后，15℃下诱导16h的细菌裂解液离心后的上清液；第七列4：加IPTG后，37℃下诱导4h的细菌裂解液离心后的上清液；第八列NC2：未加IPTG诱导的细菌裂解物离心后的沉淀物；第九列5：加IPTG后，15℃下诱导16h的细菌裂解液离心后的沉淀物；第十列6：加IPTG后，37℃下诱导4h的细菌裂解液离心后的沉淀物。
图5示出了SDS-PAGE检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖3氨基端亚基的表达。
其中，第一列M：蛋白标记；第二列1：加IPTG后，15℃下诱导16h的细菌裂解液离心后的沉淀物；第三列2：加IPTG后，37℃下诱导4h的细菌裂解液离心后的沉淀物；一抗为鼠抗His单克隆抗体，二抗为HRP标记样抗鼠。
图6示出了三轮筛选后ELISA检测噬菌体与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3氨基端亚基的结合试验。
图7示出了噬菌体阳性克隆ELISA检测结果。
图8示出了SDS-PAGE检测的jxt-mAb1(亚类为IgG1)。
其中，第一列M1：蛋白标记；第二列R：还原条件下；第三列NR：非还原条件下。
图9示出了重组表达的jxt-mAb1的ELISA检测结果。
图10示出了磷脂酰肌醇蛋白聚糖3全人源CAR结构示意图。
图11示出了CAR分子在T细胞的表达情况。
图12示出了免疫荧光检测的jxt-mAb1与人肝癌细胞系HepG2的结合。
图13示出了jxt-mAb1免疫印迹检测结果。
图14示出了jxt-mAb1免疫组化检测肝癌及癌旁正常组织。
图15示出了基于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源CAR-T与肿瘤细胞共培养后的细胞因子分泌的示意图。
图16示出了基于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源CAR-T对肿瘤细胞的杀伤的示意图。
图17示出了基于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源CAR-T对肝癌细胞系hepG2的杀伤的示意图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明的技术方案，列举如下实施例。实施例中所出现的原料、反应和后处理手段，除非特别声明，均为市面上常见原料，以及本领域技术人员所熟知的技术手段。
实施例1
经修饰的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗原——磷脂酰肌醇蛋白聚糖3氨基端亚基的制备
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3氨基端亚基的制备，包括如下步骤：
S1.参考uniprot网站人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的氨基酸序列(https://www.uniprot.org/uniprot/P51654)，其氨基端序列为Met1-Arg358；为了便于蛋白的纯化，在羧基末端添加6个His氨基酸，形成氨基酸序列14。所述氨基酸序列14如SEQ ID No.14所示；
S2.将上述氨基酸序列14按原核表达优化DNA密码子，在起始密码子前加入Shine-Dalgarno序列(即氨基酸序列15，SEQ ID No.15：AGGAGGACAGCT)以提高基因转录后的翻译。图3示出了磷脂酰肌醇蛋白聚糖3氨基端亚基原核表达载体构建示意图，原核表达质粒为pET-30a(+)(Sigma-Aldrich，#69909)；用限制性内切酶NdeI(NEB，#R0111S)和HindIII((NEB，#R3104)双酶切原核表达质粒和公司合成的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3氨基端亚基克隆载体，切胶回收后，T4连接酶16℃连接过夜；转化BL21感受态细胞(Takara，#9126)，双酶切或聚合酶链式反应(PCR)对阳性克隆进行鉴定；
S3.挑选双酶切鉴定为阳性的BL21克隆，接种到含有50μg/ml的卡那霉素的LB培养基；细菌摇床，在37℃、200rpm下进行培养；检测OD600，当OD600达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG(上海生工，#B541007)，在37℃下继续培养4h(或者15℃培养16h)；培养完成后，离心收集细菌，加入裂解缓冲液(50mM的三(羟甲基)氨基甲烷(Tris),150mM的NaCl,5％的甘油，pH为8.0)，超声裂解1min；
SDS-PAGE检测蛋白的表达：将细菌裂解液与上样缓冲液混合后，100℃下煮沸10min，10000rpm离心5min，吸取上清进行电泳；电泳完成后，考马斯亮蓝染色。
图4示出了SDS-PAGE检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖3氨基端亚基的表达，结果显示转了磷脂酰肌醇蛋白聚糖3氨基端亚基质粒的BL21在IPTG诱导下产生了一个45kD左右的蛋白，与目标蛋白的分子量大小一致；
S4.蛋白印迹(Westernblot)确认蛋白的表达：
将SDS-PAGE的蛋白电转到PVDF膜，然后加入抗His蛋白抗体(GenScript,#A00186)进行检测。
图5示出了SDS-PAGE检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖3氨基端亚基的表达，结果显示在45kD处可以检测出明显条带，与目标蛋白分子量大小一致，另外在90kD附近还可以检测到少量二聚体；
S5.磷脂酰肌醇蛋白聚糖3氨基端亚基的纯化：
细菌超声裂解后，离心，沉淀用4M的尿素洗涤两次；然后用8M的尿素溶解包涵体；蛋白透析复性，复性缓冲液为：50mM的Tris,150mM的NaCl,0.5M的L-精氨酸,10％的甘油,pH为8.0；
蛋白复性后，用镍柱纯化，SDS-PAGE测纯化蛋白的纯度；用PierceTM高容量内毒素去除离心柱(货号88276)去除内毒素；0.22μm的滤膜过滤除菌后，在-80℃下分装冻存备用。
实施例2
抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3氨基端亚基的全人源单克隆抗体的筛选
上一步中制备的经修饰的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗原(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3氨基端亚基)，采用噬菌体展示技术进行筛选，共进行三轮筛选。
人单链抗体(scFv)噬菌体展示库来自Creative-Biolabs公司(HuScL-2：人单链抗体库，文库大小为1.42×109)
第一轮筛选：抗原包被浓度为20μg/ml；
第二轮筛选：抗原包被浓度为5μg/ml；
第三轮筛选：抗原包被浓度为1μg/ml。
三轮筛选的具体过程均为：将磷脂酰肌醇蛋白聚糖3氨基端亚基抗原用pH为7.4的PBS稀释，加入96孔酶标板，100μl/孔，4℃下过夜；用含有5％的脱脂奶粉，0.1％的Tween-20的PBS溶液37℃下封闭酶标板1h；加入0.1％的PBST稀释的噬菌体库(终浓度为1×1012pfu/ml)室温孵育1h；用0.1％的PBST洗板10次；再用pH为2.0、0.2M的Gly-HCl50μl，室温洗脱10min,然后用15μl的pH为8.0的1M的Tris-HCl中和。将中和后噬菌体感染对数生长期的TG1细胞，扩增和回收后，用于下一轮筛选。筛选后用ELISA分析阳性噬菌体富集情况。
噬菌体与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3氨基端亚基的结合试验：
以5μg/ml包被抗原、以及BSA阴性对照；0.25％的酪蛋白封闭液室温封闭1h；将每一轮富集的噬菌体扩增并回收，以0.1％的PBST稀释一倍后，加入封闭好的免疫板中(100μl/孔)，室温孵育1h；0.1％的PBST洗涤6次；加入HRP-抗M13单克隆抗体(1:5000)，在37℃下孵育30min,0.2％的PBST洗板6次后TMB显色，2M的H2SO4终止,测试OD450nm，并分析每轮扩增后噬菌体的亲和力。
图6示出了三轮筛选后ELISA检测噬菌体与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3氨基端亚基的结合试验，表明在三轮富集后，噬菌体群对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3氨基端亚基的亲和力显著升高，而不与阴性对照BSA结合。
第三轮富集的噬菌体单克隆与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3氨基端亚基的结合试验：
第三轮筛选后，取5μl的洗脱液与100μl的生长中期的TG1细胞混合,加入到顶层琼脂中倒板，从中随机挑取50个单克隆，扩增并回收噬菌体。以5μg/ml包被抗原、以及BSA阴性对照；用0.25％的酪蛋白封闭液室温封闭1h；将保存的50个噬菌体单克隆，以0.1％的PBST稀释一倍后，加入封闭好的免疫板中(100μl/孔)，室温下孵育1h；用0.1％的PBST洗涤6次；加入HRP-抗M13单克隆抗体(1:5000)，在37℃下孵育30min,用0.2％的PBST洗板6次后TMB显色，加入2M的H2SO4终止反应，测试OD450nm，分析单克隆噬菌体对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3氨基端亚基的结合能力。
图7示出了噬菌体阳性克隆ELISA检测结果，发现16个抗原结合阳性克隆，阳性率为32％。
扩增上一步中16个阳性噬菌体克隆，抽提噬菌体DNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定后公司测序；分析基因序列，发现16个克隆中有9个(分别为1、3、13、19、31、32、39、47和49)序列一致，为同一克隆，将其命名为jxt-mAb1，其为磷脂酰肌醇蛋白聚糖3全人源单克隆抗体。其scFv形式的DNA序列为SEQ ID No.16，氨基酸序列为SEQ ID No.17。在jxt-mAb1的氨基酸序列中，1-118为抗体重链序列SEQ ID No.7；，134-241为抗体轻链序列SEQ ID No.8；119-133为连接肽序列；26-35为SEQ ID No.1；50-66为SEQ ID No.2；97-107为SEQ ID No.3；157-167为SEQ ID No.4；183-189为SEQ ID No.5；222-230为SEQ ID No.6。
实施例3
抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3氨基端亚基的全人源单克隆抗体——jxt-mAb1的表达与鉴定
S1.jxt-mAb1的表达：将基于jxt-mAb1的重链氨基酸序列(SEQ ID No.7)和轻链氨基酸序列(SEQ ID No.8)进行检测，用来表达并纯化全长人IgG1抗体。图8示出了SDS-PAGE检测的jxt-mAb1(亚类为IgG1)结果，表明成功表达纯化IgG1类的jxt-mAb1，其纯度≥95％。
S2.jxt-mAb1与抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的结合测试方法：将商品化的人全长磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Acrobiosystems，货号GP3-H52H4)以5μg/ml的浓度包被、对照为5μg/mlBSA；含5％的脱脂奶粉的0.1％的PBST，室温封闭1h；将jxt-mAb1用含5％的脱脂奶粉的0.1％的PBST倍比稀释，加入封闭好的免疫板中，室温孵育1h；用PBST洗涤后，加入HRP标记羊抗人IgG，室温孵育0.5h；用PBST洗涤5次后，再加入TMB室温避光显色15min，然后加入2M的硫酸中止显色；最后使用酶联免疫检测仪在450nm波长下检测吸光值。
图9示出了jxt-mAb1的ELISA检测结果，表明jxt-mAb1能特异性识别GPC3，但是不识别无关蛋白BSA。Graphpadprism软件进行曲线拟合后，计算其kd值为0.667nM。
实施例4
基于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源CAR-T的构建
S1.基于实施例3中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3全人源单克隆抗体jxt-mAb1的序列，构建第二代4-1BB型CAR分子，其包含人CD8铰链区氨基酸序列(SEQ ID No.9)、人CD28跨膜区氨基酸序列(SEQ ID No.10)、人4-1BB胞内区氨基酸序列(SEQ ID No.11)和人CD3ζ胞内区免疫受体络氨酸活化基序氨基酸序列(SEQ ID No.12)；其完整结构如图10所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.13所示；
S2.慢病毒载体的构建：将4-1BB型CAR分子的氨基酸序列，针对人源做密码子优化，最后制备的慢病毒滴度为2.01×108IFU/ml；
S3.密度梯度离心法分离健康成人PBMC，磁珠(stemcell)负选法分离总的T细胞：
用含有300U/ml的重组人IL-2、10％的胎牛血清的RPMI1640培养基进行培养；抗CD3/CD28(stemcell，ImmunoCultTMHumanCD3/CD28TCellActivator，货号10971)活化T细胞48h；然后加入慢病毒(MOI＝20),然后加入终浓度为8μg/ml的聚凝胺，1800rpm，在32℃下离心2h，并放入37℃细胞培养箱培养过夜；再次加入慢病毒(MOI＝15),1800rpm，32℃下离心2h，做第二次转染，完成后放入37℃的细胞培养箱培养继续培养；隔天换液(含300U/ml重组人IL-2、10％的胎牛血清的RPMI1640培养基)；最后在感染病毒后第5天，收集T细胞，流式细胞术检测CAR的表达(检测抗体为FITC标记羊抗鼠IgGF(ab')2)。
图11示出了4-1BB型CAR分子在T细胞的表达情况，表明转染慢病毒后第5天，4-1BB型CAR分子在T细胞成功表达，转染效率为23.79％。
测试例1
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3全人源单克隆抗体——jxt-mAb1特异性结合人肝癌细胞
与人肝癌细胞系HepG2的结合：HepG2细胞购于广州赛库生物(目录号：CC0101)。用含有10％的胎牛血清的DMEM完全培养基，置于5％的CO2，在37℃的培养箱中培养过夜；第二天，倒掉培养基，加入终浓度为2μg/ml的jxt-mAb1(用含有1％的BSA的PBS稀释)，室温反应15min；PBS(含1％的BSA)洗涤3次，然后加入FITC-羊抗人IgG，室温反应15min；PBS(含1％的BSA)洗涤3次后，倒置荧光显微镜观察结果。
图12示出了免疫荧光检测jxt-mAb1与人肝癌细胞系HepG2的结合，表明jxt-mAb1能结合人肝癌细胞系hepG2。
免疫印迹检测jxt-mAb1对天然磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的识别
收集T75培养瓶中的hepG2细胞(细胞密度70-80％)，4000rpm离心5min后去上清，PBS洗涤三次后，将细胞沉淀冻存于-80℃；24h后，取出细胞沉淀，震荡1min后细胞团块散开，加入30μl含有PMSF的RIPA细胞裂解缓冲液(thermofisher，货号：89900)，在4℃下摇床0.5h；震荡5min，然后13000rpm离心10min，取上清液到另一个ep管；Bradford法测提取的全细胞蛋白浓度(BioRadproteinkit)；进行SDS-PAGE，每孔上样量为50ug蛋白；电泳完成后，转膜，用含5％的脱脂奶粉的0.2％的PBST封闭1h；加入5μg/mljxt-mAb1(0.2％的PBST稀释)，摇床上室温反应1h；洗涤6次后，加入HRP标记羊抗人IgG；洗涤6次后，加入化学发光显色液(ThermoFisherScientific,#32209)，室温1min，6200ECL化学发光成像系统观察结果。
图13示出了jxt-mAb1免疫印迹检测结果，表明jxt-mAb1可以结合人肝癌细胞系HepG2的蛋白，结合条带有两条：一条位于70kD，一条位于40kD，符合GPC3的全长和氨基端亚基的大小；而且这种结合是特异性的，因为与293T细胞的提取蛋白不结合。
免疫组化检测jxt-mAb1与患者来源肝癌组织的结合
步骤如下：将肝癌组织石蜡切片放置在60℃下恒温箱中烘烤120min；脱蜡，并依次用下列溶剂水化(括号中表示水化时间)：二甲苯(10min)→二甲苯(10min)→无水乙醇(5min×2次)→95％乙醇(5min×2)→90％(5min)→85％乙醇(5min)→80％乙醇(5min)→75％乙醇(5min)；蒸馏水冲洗2次后，加入3％的H2O2孵育室温30min；蒸馏水洗2次；抗原修复：高压修复或微波修复；PBS洗3次各5min，封闭30min；加入5μg/ml的jxt-mAb1(含1％的BSA的PBS稀释)，37℃下孵育2h；PBS冲洗3次各5min；加入HRP标记羊抗鼠二抗，在37℃孵育45min；再用PBS洗涤后，DAB显色，苏木素复染，脱水。得到的透明后中性树脂封片，在显微镜下观察结果。
图14示出了jxt-mAb1免疫组化检测肝癌及癌旁正常组织，表明jxt-mAb1可以结合患者来源的肝癌细胞，而不结合癌旁正常组织，具有很强的特异性。
测试例2
基于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源CAR-T的抗肿瘤效果
S1.将基于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源CAR-T(效应细胞)与人肝癌细胞系HepG2细胞(靶细胞)按不同的比例(1:1、3:1、9:1)，加入96孔培养板共培养；
S2.培养20h后，收集上清液，ELISA检测上清液中IL-2和IFN-γ的浓度。
图15示出了基于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源CAR-T与肿瘤细胞共培养后的细胞因子分泌的示意图，表明将基于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的CAR-T细胞与肿瘤共培养后，产生大量的IL-2和IFN-γ；而与293T细胞共培养后，既不产生IFN-γ也不产生IL-2。
S3.检测效应细胞对靶细胞的杀伤率：
采用LDH法(Promega,CytoTox96非放射性细胞毒性检测，货号G1780)进行检测。
图16示出了基于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源CAR-T对肿瘤细胞的杀伤的示意图，表明基于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源CAR-T能特异性杀伤GPC3阳性的人肝癌细胞系HepG2细胞，而不杀伤GPC3阴性的293T细胞；而且这种杀伤具有剂量依赖性，即效靶比越高，杀伤率越大。
向细胞中加入碘化丙啶(Thermofisher，碘化丙啶ReadyFlowTM试剂，货号：R37169)，在倒置荧光显微镜观察结果。
图17示出了基于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的全人源CAR-T对肝癌细胞系hepG2的杀伤的示意图，表明基于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的CAR-T能特异性杀伤GPC3阳性的人肝癌细胞系HepG2细胞；而未转染CAR的Mock-T细胞则不能杀伤靶细胞。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
序列表
<110> 蒋小滔
<120> 一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3 的全人源单克隆抗体、其嵌合抗原受体及应用
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 1
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 2
Asn Ile Tyr Pro Gly Gly Ala Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 3
Ala Arg Gly Ser Tyr Leu Tyr Gly Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 4
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Val Trp Leu Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 5
Lys Ala Ser Asn Leu His Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 6
Gln Gln Gly Asn Ser Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Gly Ala Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Leu Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 8
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Val Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg
100 105
<210> 9
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 9
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 10
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 10
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 11
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 11
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
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<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 12
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
<210> 13
<211> 424
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 13
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val
20 25 30
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Gly Ile Ser Val Trp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys
115 120 125
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
145 150 155 160
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
165 170 175
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
180 185 190
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Gly Ala Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
195 200 205
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
210 215 220
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ala Arg Gly Ser Tyr Leu Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
260 265 270
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
275 280 285
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
290 295 300
Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
305 310 315 320
Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg
325 330 335
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
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Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
355 360 365
Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
370 375 380
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
385 390 395 400
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
405 410 415
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
420
<210> 14
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 14
Met Ala Gly Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Asp Phe Pro Gly Gln Ala Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp
20 25 30
Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly
35 40 45
Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val
50 55 60
Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys
65 70 75 80
Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala
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Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln
100 105 110
Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala
115 120 125
Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe
130 135 140
Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp
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Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro
165 170 175
Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu
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Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe
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Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln
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Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile
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Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu
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Gln Gln Arg Gln Tyr Arg His His His His His His
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<210> 15
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
aggaggacag ct 12
<210> 16
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
caagttcaac tggttcagtc aggtgccgaa gttaaaaaac ccggtgccag cgttaaagta 60
tcttgcaagg cctctggtta ttcttttacg tcatactgga tgcattgggt acgacaggcc 120
ccaggtcaag gcctggagtg gatggggaat atctacccag gcggcgcaaa cacgaattat 180
gctcagaagt tccaaggcag agtcaccatg acaagagaca cgtccacttc caccgtgtat 240
atggaactta gctcattgcg ctctgaggac acggcggtgt attattgcgc gcgaggcagt 300
tacctttatg gtatggacta ttggggtcag ggaacccttg taaccgtttc cagcggagga 360
gggggtagtg gcgggggagg ttcaggcggt gggggaagcg agattgtgtt gacgcaatca 420
ccatcatctg taagtgcgag cgtcggggac agagtaacta ttacatgccg agcgagccag 480
ggcatctcag tatggcttag ttggtaccaa caaaagcctg ggaaagcgcc caagctgctt 540
atctacaaag ccagtaatct tcacagtggc gtgccagcgc ggttttccgg ttcaggcagt 600
ggtacagact ttaccttgac aataagtggg ctccaatcag aggattttgc ttcatattat 660
tgccaacaag gtaattccta tccgtggact tttggaggtg gaaccaaact ggaggtaaag 720
cgg 723
<210> 17
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 17
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85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Leu Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
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Asn Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys
225 230 235 240
Arg
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