一种用于类风湿性关节炎的抗VEGF和TNF-α双特异性纳米抗体融合蛋白
阅读说明：本技术 一种用于类风湿性关节炎的抗VEGF和TNF-α双特异性纳米抗体融合蛋白 (anti-VEGF and TNF-alpha bispecific nano antibody fusion protein for rheumatoid arthritis ) 是由 陈逸媛 林仪芮 陈昱翰 黄超 陈妍 张旭韬 于 2021-07-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于类风湿性关节炎的抗VEGF和TNF-α双特异性纳米抗体融合蛋白,属于基因工程技术领域,包括抗VEGF抗体或者V EGF受体-Fc融合体和抗TNF-α的多肽,以及用于连接所述抗VEGF抗体或者VEGF受体-Fc融合体和抗TNF-α的多肽的连接肽；所述连接肽由柔性肽和刚性肽组成,所述柔性肽包括1个或多个柔性单元,所述刚性肽包括一个或多个刚性单元。本发明所提供的抗VEGF和TNF-α双特异性纳米抗体融合蛋白,可用于类风湿性关节炎的预防或治疗,具有安全可靠、特异性强的优势。(The invention discloses an anti-VEGF and TNF-alpha bispecific nano antibody fusion protein for rheumatoid arthritis, which belongs to the technical field of genetic engineering and comprises an anti-VEGF antibody or a V EGF receptor-Fc fusion body and an anti-TNF-alpha polypeptide, and a connecting peptide for connecting the anti-VEGF antibody or the VEGF receptor-Fc fusion body and the anti-TNF-alpha polypeptide; the linker peptide consists of a flexible peptide comprising 1 or more flexible units and a rigid peptide comprising one or more rigid units. The anti-VEGF and anti-TNF-alpha bispecific nano antibody fusion protein provided by the invention can be used for preventing or treating rheumatoid arthritis, and has the advantages of safety, reliability and strong specificity.)
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种用于类风湿性关节炎的抗VEGF和TNF-α双特异性纳米抗体融合蛋白。
背景技术
类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种慢性炎性和破坏性关节病，在工业化世界，其影响0.5-1％的人群，并且常常导致明显的残疾从而降低患者生活质量。
患有RA的患者滑膜中的血管形成被认为是发病机制和疾病永存中一个重要的早期步骤(Taylor、2002)。如在肿瘤性疾病中，血管形成促进扩张滑膜(Walsh et al.，1998)。血管生长很可能有助于炎性滑膜血管翳的增生，并有助于炎性白细胞进入滑膜组织内。患有RA的患者的滑膜包含增加量的成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)(Koch，2003)。血清VEGF浓度与疾病活性相关，并且当滑膜炎可通过治疗而成功抑制时血清VEGF浓度下降(Taylor，2002)。
血管内皮生长因子(VEGF)是参与内皮细胞活化、增殖和存活，特别是在视网膜增殖性疾病和肿瘤发生期间的血管原蛋白的主要家族。VEGF属于VEGF-PDGF(血小板源性生长因子)超基因家庭，并且是结合在血管和淋巴内皮细胞中表达的受体的小型糖蛋白二聚体。目前，VEGF家族中有七种已知的配体：VEGF-A(VEGF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E(病毒源性)和胎盘生长因子(PIGF)-1和-2。这些VEGF配体通过与三种已知VEGF受体(VEGF-R)中的一种或多种结合而介导它们的作用，其中每种受体均具有受体酪氨酸激酶活性。VEGF-R1(Flt-1)主要在内皮细胞和单核细胞中表达，与VEGF和VEGF-B结合，并且看似介导内皮细胞和单核细胞的迁移。VEGF-R2(即人KDR或鼠Flk-1)主要在内皮细胞中表达，对VEGF(以及VEGF-C和VEGF-D的特定片段)有选择性，并介导VEGF-诱导的内皮细胞增殖、存活和迁移，以及血管通透性。VEGF-R3(Flt-4)主要在淋巴内皮细胞中表达，并且与VEGF-C和VEGF-D结合以促进淋巴管生成。VEGF-R1、-R2和-R3各自在一些肿瘤细胞中表达。VEGF与VEGF受体的结合触发了受体二聚化，导致随后的受体激活和信号转导。VEGF与VEGF-R2的结合启动了在促进血管生成中占主导地位的信号转导途径。该途径涉及受体激活以及随后胞内信号转导的诱导。这种情况下，受体激活需要三个基本事件：(i)VEGF结合至VEGF-R2，(ii)受体二聚化和(iii)受体酪氨酸激酶的受体自磷酸化(以及由此的激活)。胞内信使，如磷脂酶C和磷脂酰肌醇-3-激酶直接结合至VEGF-R2的自磷酸化形式并通过受体酪氨酸激酶而磷酸化，其随后触发信号转导事件的胞内级联，从而导致产生了最终促进细胞增殖、迁移和存活(抗细胞凋亡)和提高血管通透性的核信号。
肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNFα)是一种多功能细胞因子，参与细胞的凋亡和存活、炎症反应、免疫反应等重要的生理过程，在类风湿性关节炎、克罗恩病(Crohn’s disease)和银屑病(psoriatic)等疾病的发生发展中扮演重要角色。因此，TNFα被视为是治疗上述相关疾病的十分重要的药物研发靶点。英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalim umab)、戈利木单抗(golimumab)等便是治疗性抗TNFα抗体，在治疗RA等疾病上表现出显著疗效和安全性，均已成为全球最畅销的重磅药物之一，而且其他治疗性抗TNFα抗体的研究与开发也依然炙手可热。
近二十年，蛋白融合技术已广泛应用于构建双功能抗体、双功能酶和双功能蛋白等。然而，在构建融合蛋白过程中遇到了各种问题，例如在单独表达时能正确折叠的蛋白在融合蛋白中不能正确折叠；融合的两个蛋白因空间距离靠近从而导致活性位点被屏蔽；融合蛋白分子因不能正确折叠或其构象变化原因而容易被蛋白酶降解；原本具有一定柔性的蛋白催化域在融合之后失去了原有的功能等。这些问题的出现，往往导致融合蛋白活性降低甚至完全丧失。一般认为，构建融合蛋白后，原蛋白分子的活性会有一定程度的下降；一个有意义的融合蛋白是其各部分的活性保持在原蛋白分子的50％以上。为了解决以上问题，对融合蛋白的设计和构建进行了许多研究和探索，以期提高融合蛋白的活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于类风湿性关节炎的抗VEGF和TNF-α双特异性纳米抗体融合蛋白，以解决上述现有技术存在的问题，该融合蛋白通过连接肽连接，有利于保持蛋白或多肽的生物活性，具有广泛适应性和可移植性。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种抗VEGF和TNF-α双特异性纳米抗体融合蛋白，包括抗VEGF抗体或者VEGF受体-Fc融合体和抗TNF-α的多肽，以及用于连接所述抗VEGF抗体或者VEGF受体-Fc融合体和抗TNF-α的多肽的连接肽；所述连接肽由柔性肽和刚性肽组成，所述柔性肽包括1个或多个柔性单元，所述刚性肽包括一个或多个刚性单元。
进一步地，所述柔性单元氨基酸组成的结构通式为(GS)x(GGS)y(GGGS)z(GGGGS)m，其中x，y，z和m是大于或等于0的整数，且x+y+z+m≥1。
进一步地，所述刚性单元选自如下序列：
(1)SPSKKAPAPSLPLPSRLGGPSGTPPLPQ；
(2)SAGSKKPGPS。
进一步地,所述刚性肽位于柔性肽的C末端。
进一步地，所述柔性单元选自如下序列：
(1)GSYHKNYALPPQSKKALLRFQDSLK；
(2)ARLFGPSSLLPQQAAGSRLGSGGRRP。
本发明还提供编码上述的抗VEGF和TNF-α双特异性纳米抗体融合蛋白的多核苷酸。
本发明还提供包含上述多核苷酸的表达载体。
本发明还提供转染上述表达载体的宿主细胞。
本发明还提供一种制备上述的抗VEGF和TNF-α双特异性纳米抗体融合蛋白的方法，包括培养上述的宿主细胞。
本发明还提供一种上述的抗VEGF和TNF-α双特异性纳米抗体融合蛋白、上述的多核苷酸、上述的表达载体或上述的宿主细胞在制备治疗和/或预防类风湿性关节炎的药物中的用途。
本发明还提供一种药物组合物，包括上述的抗VEGF和TNF-α双特异性纳米抗体融合蛋白、以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
进一步地，还包括至少一种药学上可接受的佐剂。
药物组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠或乳化剂、固体粘合剂、分散或混悬助剂、稳定剂、着色剂、矫味剂、包衣、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂、及其组合。
药物组合物中的主要媒介物或载体可以本质上是水性或非水性的。例如，合适的媒介物或载体可以是注射用水、生理盐水或人工脑脊液，可以补充有注射中常见的其他材料。例如，媒介物或载体可以是中性缓冲盐溶液或混有血清白蛋白的盐溶液。其他示例性的药物组合物包含Tris缓冲液、或醋酸盐缓冲液，其还可以包含山梨醇或其合适的替代物。在本发明的一个实施方式中，组合物可以通过混合具有所需纯度的所选组分与任意的配制剂以冻干或水溶液形式制备而用于储存。此外，治疗组合物可以使用合适的赋形剂例如蔗糖配制为冻干剂。
优选地，药物组合物适用于静脉、肌内、皮下、非肠道、脊柱、或表皮给药(例如，通过注射或推注)。取决于给药途径的不同，活性分子可以包裹在材料中以保护其免受酸和可能使其失活的其他自然条件的作用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明所述连接肽具有广泛适用性和可移植性，刚性单元和柔性单元的组合序列，则能赋予连接肽具有介于完全刚性和完全柔性之间的构象，多肽具体的刚性(或柔性)程度因两种序列之间的比例、排列而异。通过设计不同比例和排列的刚性单元和柔性单元的组合序列，能对连接肽的刚性进行细微调控，以满足融合蛋白构建中对连接肽刚性的不同要求。
本发明所提供的抗VEGF和TNF-α双特异性纳米抗体融合蛋白，可用于类风湿性关节炎的预防或治疗，具有安全可靠、特异性强的优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为融合蛋白刺激小鼠单个核细胞增殖的能力；
图2为双特异性纳米抗体融合蛋白VEGF与肿瘤细胞Raji结合的能力；
图3为双特异性纳米抗体融合蛋白TNF-α与肿瘤细胞Raji结合的能力；
图4为检测双特异性纳米抗体融合蛋白VEGF和TNF-α与肿瘤细胞Raji结合的能力。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
制备双特异性抗体的方法
可采用本领域任何已知的方法制备本发明的双特异性抗体。早期构建双特异性抗体的方法有化学交联法或杂合杂交瘤或四价体瘤法(例如，Staerz UD等,Nature,314:628-31,1985；Milstein C等,Nature,305:537-540,1983；Karpovsky B等,J.Exp.Med.,160:1686-1701,1984)。化学偶联法是将2个不同的单克隆抗体用化学偶联的方式连接在一起，制备出双特异性单克隆抗体。例如两种不同单克隆抗体的化学结合，或例如两个抗体片段如两个Fab片段的化学结合。杂合—杂交瘤法是通过细胞杂交法或者三元杂交瘤的方式产生双特异性单克隆抗体，这些细胞杂交瘤或者三元杂交瘤是通过建成的杂交瘤融合，或者建立的杂交瘤和从小鼠得到的淋巴细胞融合而得到的。虽然这些技术用于制造BiAb，但产生的各种问题使得此类复合物难以使用，诸如产生含有抗原结合位点的不同组合的混合群体、蛋白质表现方面的困难、需要纯化目标BiAb、低产率、生产费用高等。
最近的方法是利用经过基因工程改造的构建体，其能够产生单一BiAb的均质产物而无需彻底纯化以去除不需要的副产物。此类构建体包括串联scFv、二抗体、串联二抗体、双可变结构域抗体和使用诸如Ch1/Ck结构域或DNLTM的基元的异源二聚(Chames&Baty,Curr.Opin.Drug.Discov.Devel.,12:276-83,2009；Chames&Baty,mAbs,1:539-47)。相关纯化技术是公知的。
还可以使用单淋巴细胞抗体方法通过克隆和表达由选择用于产生特异性抗体的单个淋巴细胞产生的免疫球蛋白可变区cDNA来产生抗体，例如由Babcook J等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93:7843-7848,1996；WO 92/02551；WO 2004/051268和WO 2004/106377所述的方法。
用于产生例如用于免疫宿主或用于淘选诸如用于噬菌体展示(或酵母细胞或细菌细胞表面表达)的抗体的抗原多肽可以通过本领域熟知的方法从包含表达系统的遗传工程改造的宿主细胞制备，或者它们可以是从天然生物来源回收。例如，可将编码双特异性抗体的一条或两条多肽链的核酸通过多种已知的方法(如转化、转染、电穿孔、用核酸包被的微粒轰击等)引入培养的宿主细胞。在一些实施方案中，编码双特异性抗体的核酸在被引入宿主细胞前可先插入至适于在宿主细胞中表达的载体中。典型的所述载体可包含使插入的核酸能够在RNA和蛋白质水平上表达的序列元件。
所述载体是本领域公知的，并且许多是商购可获得的。含有所述核酸的宿主细胞可在能够使细胞表达该核酸的条件下培养，且得到的BiAb可从细胞群或培养基中收集。可选地，BiAb可在体内生产，例如，在植物叶片中和鸟蛋中，或哺乳动物的奶中。
可以使用的多种培养的宿主细胞包括，例如，原核细胞、真核细胞、细菌细胞(如大肠杆菌或嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacilis stearothermophilus))、真菌细胞(如酿酒酵母或毕赤酵母)、昆虫细胞(如包括草地夜蛾细胞在内的鳞翅目昆虫细胞)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞、Hela细胞、人肝细胞癌细胞或293细胞等等)。
双特异性抗体可通过双特异性抗原的免疫原性制剂免疫合适的受试者(例如，兔，山羊，小鼠，或其它哺乳动物，包括转基因的和经剔除的上述哺乳动物)制备。合适的免疫原性制剂可以是，例如化学合成的或重组表达的双特异性抗原。所述的制剂可进一步包含佐剂，例如弗氏完全或不完全佐剂或类似的免疫刺激化合物。而且，当用于制备抗体时，特别是通过体内免疫的方式，本发明的双特异性抗原可以单独使用，或优选地作为与载体蛋白的偶联物。这种加强抗体应答的方法是本领域所公知的。根据所需的抗体不同，可使用不同的动物宿主进行体内免疫。可使用自身表达有用的内源抗原的宿主，或使用已导致有用内源抗原缺陷的宿主。
双特异性抗体或编码本申请抗体的核酸或多核苷酸或药物组合物或组合疗法在与包括免疫和炎症因素的多种疾病的相关病理学中起关键作用。上述的疾病包括但不限于类风湿病关节炎。
实施例1融合蛋白的构建
本发明构建了含连接肽的抗VEGF和TNF-α双特异性纳米抗体融合蛋白。将编码抗VEGF抗体和抗TNF-α抗体的DNA序列通过连接肽的DNA序列相连组成融合基因序列。优选地，它们都是经人工优化过的CHO细胞偏爱密码子。优选地使用化学合成方法获得。
为了便于将上述获得的融合基因目的片段插入表达载体的特定位点，在所合成片段5’和3’端各插入一个限制性酶切位点，分别为SpeI和EcoRI。经测序验证后的融合蛋白基因以相应的限制性内切酶酶切，然后插入到以PCDNA3.1为模板并改造后的表达质粒PXY1A1的相应酶切位点间，得到融合蛋白高表达质粒。
PXY1A1质粒包含但不限于以下重要表达元器件：
1)人巨细胞病毒早期启动子和哺乳动物细胞高外源表达所需增强子；
2)双重筛选标记物，在细菌中具有卡那霉素抗性，在哺乳动物细胞中具有G418抗性；
3)鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因表达框，当宿主细胞为DHFR基因缺陷型时，氨甲蝶呤(MTX)能共扩增融合基因和DHFR基因。
将融合蛋白表达质粒转染入哺乳动物宿主细胞系，为了获得稳定高水平的表达，优选的宿主细胞系是DHFR酶缺陷型CHO细胞。转染两天后，将培养基换成含0.6mg/mL G418的筛选培养基，细胞以一定浓度(5000-10000个活细胞/孔)接种在96孔培养板里，培养10-14天直至大的离散细胞克隆出现。用ELISA分析方法，筛选对选择用药具有抗性的转染子。通过极限稀释96孔培养板，亚克隆产生高水平融合蛋白的孔。
对于多方验证效果良好的融合蛋白，为了实现更高水平表达，宜用受MTX药物抑制的DHFR基因进行共扩增。在含有递增浓度MTX的生长培养基中，用DHFR基因共扩增转染的融合蛋白基因。获得的高表达单克隆细胞株先在摇瓶或5升发酵罐中进行补料培养，再以Protein A亲和层析柱和其它离子交换层析柱纯化融合蛋白。
实施例2融合蛋白制备和鉴定
实施例1中获得的稳定表达细胞株，经过10-14天的摇瓶补料培养，经Protein A亲和层析、多维模式层析、阴离子交换层析和分子筛层析四个步骤进行纯化，然后再以溶液孵育自激活法活化融合蛋白。SDS-PAGE蛋白电泳检测显示，未活化的FP-A2在还原条件下，单链分子分别在70-85kDa和40kDa附近有两条明显条带，预示降解片段的存在，大约占20-30％；在非还原条件下，纯化蛋白迁移至约130kDa，并伴有部分>200kDa的条带，表明部分融合蛋白发生聚合。未活化的FP-A3在还原条件下，单链分子接近100kDa，无杂带，在非还原条件下，部分纯化蛋白迁移至>200kDa，表明FP-A3都是多聚体。未活化的FP-A1在还原条件下，单链分子100-110kDa，无明显杂带，在非还原条件下，纯化蛋白迁移至150kDa。活化的FP-A1在还原条件下呈现两条清晰条带，分别为74.3KDa的HC-L-CTPFc和约24.0KDa的LC，无其它杂带，在非还原条件下，纯化蛋白迁移至150kDa，表明融合蛋白FP-A1未发生明显降解且未出现明显的聚合现象，具有更高的热力学稳定性和更强的抗蛋白酶水解能力。该实施例表明，连接肽中含有CTP刚性单元，能够增加融合蛋白的稳定性，不易降解，并减少聚合体的形成。
实施例3
实施例1中获得的稳定表达细胞株，经过12-14天的摇瓶补料培养，以Protein A亲和层析纯化，两种融合蛋白纯度都在95％以上，分子大小也符合预期，然后用于活性分析。融合蛋白的体外生物活性分析方法如下：小鼠脾脏来源的单个核细胞通过刀豆蛋白A(ConA)活化后，将100μL的细胞接种到96孔板中，之后加入一系列浓度梯度的FP-D1和FP-D2，37℃，5％CO2培养72小时后，加入20μL MTT试剂，继续培养4小时，吸出培养基后每孔加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，检测在492nm的吸光度，以此测定细胞的增殖情况。每个处理设三个重复，每个重复测定两次，以重组IL-7作为阳性对照，以培养基作为阴性对照。图1显示了融合蛋白刺激小鼠单个核细胞增殖的能力。根据绘制的剂量反应曲线，可获得融合蛋白的半数有效浓度值(EC50)分别为0.039和0.048nM。
实施例4
双特异性抗体与效应细胞和靶细胞结合活性的测定(FACS)
培养CD19表达阳性的肿瘤细胞Raji细胞(上海中科院细胞库)，离心收集细胞。将收集的细胞用1％PBSB重悬，调整细胞密度为2×106个/mL，置于96孔板中，每孔100μl(2×105个细胞)，4℃封闭0.5h。封闭后的细胞离心弃上清，加入稀释好的一系列浓度的双特异性抗体，4℃孵育1h；离心去上清，用1％BSA的PBS溶液(PBSB)洗3遍，加入稀释好的AF647标记的山羊抗人IgG抗体，4℃避光孵育1h；离心去上清，1％PBSB洗两遍，每孔再用100μl 1％多聚甲醛(PF)重悬，流式细胞仪检测信号强度。再以平均荧光强度作为Y轴，抗体浓度作为X轴，通过软件GraphPad进行分析，计算双特异性抗体与肿瘤细胞Raji结合的EC50值。
结果显示，不同结构的双特异性抗体和过表达肿瘤细胞均具有良好的结合活性。图2、图3和图4展示了不同结构的双特异性抗体和肿瘤细胞Raji的结合曲线。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
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