微球及其制备方法、检测方法
阅读说明:本技术 微球及其制备方法、检测方法 (Microsphere and preparation method and detection method thereof ) 是由 李艳晓 俞晓峰 李锐 吕聪 郑宁宁 卓王涛 韩双来 于 2021-06-15 设计创作,主要内容包括:本发明提供了微球及其制备方法、检测方法,所述微球包括球形本体;所述本体表面修饰有官能团,部分官能团上偶联螯合物,所述螯合物螯合金属离子。本发明具有检测准确度高、快速等优点。(The invention provides a microsphere and a preparation method and a detection method thereof, wherein the microsphere comprises a spherical body; the surface of the body is modified with functional groups, and a chelate is coupled to part of the functional groups and chelates metal ions. The invention has the advantages of high detection accuracy, rapidness and the like.)
技术领域
本发明涉及微球,特别涉及微球及其制备方法、检测方法。
背景技术
磁性高分子微球是指通过采用一定的方法将有机高分子与无机磁性材料结合起来制成的具有磁性和一定特殊结构的微米级磁球。因其具有独特的磁响应性、比表面积大、生物相容性好以及表面易功能化等特点,在生物医学和分离工程等多个领域都具有广泛的应用,如核磁共振成像(MRI)、细胞标记及分离、核酸和蛋白质分离纯化等。其中磁性微球应用在流式细胞技术中可以实现生物标记物的高通量和快速检测,在生物检测领域有非常重要的应用前景。
传统流式细胞技术中,磁性微球作为主要的检测载体,通过荧光染色可对微球进行编码,之后使蛋白/核酸探针与微球偶联可形成荧光探针,进而与待测物进行生物学反应从而达到检测抗体/核酸的目的。该技术主要使用各种荧光基团作为待测物标签,检测手段为激光器和光电倍增管,在检测过程中,不同通道之间容易出现荧光串色的问题,需要额外调节荧光补偿,这导致流式荧光技术的检测通道受到限制,且在进行多参数检测时,调节荧光补偿则变得异常复杂。
发明内容
为解决上述现有技术方案中的不足,本发明提供了一种微球。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
微球,所述微球包括球形本体;所述本体表面修饰有官能团,部分官能团上偶联螯合物,所述螯合物螯合金属离子。
本发明的目的还在于提供了上述微球的制备方法,该发明目的是通过以下技术方案得以实现的:
根据本申请的微球的制备方法,所述微球的制备方法为:
表面修饰有官能团的球形本体加入到化学活化试剂中,活化所述官能团;
加入金属螯合剂,并反应;
加入金属盐,所述螯合剂螯合金属盐中的金属离子。
本发明的目的还在于应用上述微球的检测方法,该发明目的是通过以下技术方案得以实现的:
基于质谱技术和微球的检测方法,所述基于质谱技术和微球的检测方法为:
提供多种本申请的微球,每一种微球螯合的金属离子的组成不同,且表面的探针不同,所述金属离子的质量数与所述探针一一对应;
多种微球的探针分别与待测样本中的多种核酸或抗体发生特异性反应;
利用质谱技术检测多种微球上的金属离子的组成,从而获得了样本与微球上修饰的核酸探针或抗体发生特异性反应的信息。
与现有技术相比,本发明具有的有益效果为:
1.本发明中给(磁性)微球修饰镧系金属离子的方法简单有效,可操作性强;
ANTA和Iso-EDTA具有非常强的配位能力,能够与金属离子紧密螯合,结合效率高;
2.检测准确度高、分辨率高;
选择作为标记的金属大部分为稀有金属,如镧系金属,在细胞中含量基本为零,因此检测背景极低;
ICP-MS等质谱技术检测通道数量较多,一次可以同时检测上百个不同的参数,且相邻通道之间干扰较小,解决了流式细胞检测时荧光串色的问题,不需要再额外调节荧光补偿;
使用了质谱技术,如ICP-TOF-MS技术,检测不同质量数金属离子含量,显著地提高了金属离子的检测准确度,也即提高了核酸检测的准确度;
在调试中,精准地同步调节竖直炬管和线圈的空间位置,达到每个工况下的最佳位置,获得最准确的检测数据;
实现炬管在三个维度上微调,三个方向的位置精度和重复精度可以达到0.01mm,实现炬管火焰与锥口达到最佳位置;
本发明的飞行时间质谱分析器可对更宽的离子初始位置分散实现二阶时间聚焦,质量分辨率显著提升;
3.检测灵敏度高;
采用双脉冲推斥技术可以减小对高压脉冲的技术要求;本发明专利采用正脉冲推(推斥电极)和负脉冲拉(牵引电极)的双推斥方式,高压的需求会降低一半,故上升沿较陡和脉冲波形均可得到改善;
在双脉冲推斥中间增加等电势的第一栅网和第二栅网,可减小加速区对离子调制区的电场渗透效应;
第一栅网和第二栅网直接接地,没有额外增加电压,调节难度小;
可实现对较宽的调制区,提高离子通量与灵敏度;
4.可靠性好;
炬管为竖直设置,且和线圈保持相对静止,炬管和线圈同步移动,防止炬管移动时与线圈靠的过近而烧坏炬管,解决了采样锥被烧变形的问题;
利用转换模块和转换件,使得马达的转动可靠地转换为转换件的竖直移动,多个导向件的使用,使得承载件及转换件仅有竖直方向移动,有效地防止了承载件倾斜,确保了炬管定位的准确度和可靠性;
附图说明
参照附图,本发明的公开内容将变得更易理解。本领域技术人员容易理解的是:这些附图仅仅用于举例说明本发明的技术方案,而并非意在对本发明的保护范围构成限制。图中:
图1是根据本发明实施例的微球的制备方法流程图;
图2是根据本发明实施例的微球的结构示意图;
图3是根据本发明实施例的微球的另一结构示意图;
图4是根据本发明实施例的质谱仪的结构示意图;
图5是根据本发明实施例的承载单元的结构示意图;
图6是根据本发明实施例的飞行时间质量分析器的结构示意图;
图7是根据本发明实施例的飞行时间质量分析器的结构示意图。
具体实施方式
图1-7和以下说明描述了本发明的可选实施方式以教导本领域技术人员如何实施和再现本发明。为了解释本发明技术方案,已简化或省略了一些常规方面。本领域技术人员应该理解源自这些实施方式的变型或替换将在本发明的范围内。本领域技术人员应该理解下述特征能够以各种方式组合以形成本发明的多个变型。由此,本发明并不局限于下述可选实施方式,而仅由权利要求和它们的等同物限定。
实施例1:
图1给出了本发明实施例的微球的制备方法的流程图,如图1所示,所述微球的制备方法为:
表面修饰有官能团的球形本体加入到化学活化试剂中,活化所述官能团;
加入金属螯合剂,并反应;
加入金属盐,所述螯合剂螯合金属盐中的金属离子。
通过上述制备方法制成的微球包括球形本体,如采用聚苯乙烯材质;所述本体表面修饰有官能团,部分官能团上偶联螯合物,所述螯合物螯合金属离子。
为了提高偶联效果,进一步地,所述官能团是氨基或羧基,所述螯合物是ANTA或Iso-EDTA,所述金属离子是镧系金属离子。
在上述制备方法中,所述表面修饰有官能团的球形本体的制备方式为:
FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O,加入纯水并分散,惰性气体条件下加热搅拌;加入NH3·H2O、油酸进行反应;将产物磁性分离并用纯水洗涤直至洗涤液中pH值呈中性,得到Fe3O4纳米颗粒;
Fe3O4固体和SDS溶解于纯水中并分散,向混合液中加入苯乙烯并分散,惰性气体条件下将悬浮液加热搅拌,加入K2S2O8升温反应;加入丙烯酸继续反应,真空干燥后得到粉末Fe3O4@PS-COOH样品;或者,取Fe3O4分散在苯乙烯中,加入二乙烯基苯、过氧化苯甲酰和甲基丙烯酸,形成磁流体并滴加到含有十六醇和十二烷基硫酸钠的水溶液中;惰性气体条件下加入丙烯酰胺和过硫酸钾的水溶液,产物为Fe3O4@PS-NH2。
本发明实施例的基于质谱技术和微球的检测方法,所述基于质谱技术和微球的检测方法为:
提供多种本实施例制备的微球,每一种微球螯合的金属离子的组成不同(如质量数不同或金属离子不同),且表面的探针不同,所述金属离子的质量数与所述探针一一对应;
多种微球的探针分别与待测样本中的多种核酸或抗体发生特异性反应;
利用质谱技术检测多种微球上的金属离子的组成,从而获得了样本与微球上修饰的核酸探针或抗体发生特异性反应的信息。
为了提高检测准确度,进一步地,在质谱检测中,离子化的具体方式为:
马达转动,转换模块将马达的转动转换为滑动件的直线移动;
将所述滑动件的直线移动转换为转换件的竖直移动,从而带动与所述转换件连接的承载件沿着多个导向件竖直移动,设置在所述承载件上的承载单元随着所述承载件竖直移动;炬管竖直地设置在所述承载单元上,线圈固定在所述承载单元上,并与所述炬管保持相对静止;
在水平方向上二维调节所述承载单元的位置,所述承载单元设置在二维调节单元上,所述二维调节单元设置在所述承载件上;
细胞逐个进入所述炬管内,通过所述线圈激发成等离子体,从而形成离子;
所述离子穿过采样锥后进入质谱分析单元。
为了提高检测准确度,进一步地,在单细胞的质谱检测中,使用飞行时间质量分析器,所述飞行时间质量分析器包括推斥极、无场飞行区和检测器,所述无场飞行区包括第一入射栅网;所述飞行时间质量分析器还包括:
牵引电极,所述牵引电极和所述第一入射栅网间形成第一离子加速区;
第一栅网和第二栅网,所述第一栅网和第二栅网间电势差为零;所述推斥极和第一栅网间,以及第二栅网和牵引电极间形成第二离子加速区;离子依次穿过第一栅网、第二栅网、牵引电极、第一入射栅网和无场飞行区,被所述检测器接收。
所述飞行时间质量分析器还包括:
反射区,所述反射区包括第一反射场和第二反射场,所述第一反射场包括第二入射栅网和反射电极,第二反射场包括所述反射电极和反射板;从所述无场飞行区出射的离子被所述反射区反射,之后被所述检测器接收。
为了实现二阶聚焦,所述第二离子加速区和第一反射场、第二反射场满足:
E1、E3、E4、E5分别是所述第二离子加速区、第一离子加速区、第一反射场和第二反射场的电场强度,z0、dG、d2、d3、d4、d5分别是入射离子和第一栅网间的距离、第一栅网和第二栅网间的距离、第二栅网和牵引电极间的距离、牵引电极和第一入射栅网间的距离、第二入射栅网和反射电极间的距离、反射电极和反射板间的距离;L是离子在第一入射栅网和检测器间无场飞行区中飞行的长度。
为了实现二阶聚焦,所述第一栅网与第二栅网的距离和无场飞行区满足:
E1、E3分别是所述第二离子加速区、第一离子加速区的电场强度,z0、dG、d2、d3分别是入射离子和第一栅网间的距离、第一栅网和第二栅网间的距离、第二栅网和牵引电极间的距离、牵引电极和第一入射栅网间的距离;L是离子在第一入射栅网和检测器间无场飞行区中飞行的长度。
实施例2:
根据本发明实施例1的微球及其制备方法、检测方法的应用例。
在本应用例中,所述微球的制备方法为:
FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O,加入超纯水并超声分散,氮气条件下加热搅拌;加入NH3·H2O、油酸进行反应;将产物磁性分离并用超纯水洗涤直至洗涤液中pH值呈中性,得到稳定磁流体Fe3O4纳米颗粒;
取Fe3O4固体和SDS溶解于超纯水中并超声分散,向混合液中加入苯乙烯并分散,氮气条件下将悬浮液加热搅拌,加入K2S2O8升温反应;加入丙烯酸继续反应,产物用无水乙醇和超纯水洗涤,真空干燥后得到粉末Fe3O4@PS-COOH样品,也即在微球表面修饰了羧基(官能团);
取Fe3O4@PS-COOH粉末加入到溶解有化学活化试剂的的溶剂中超声分散,搅拌反应以活化Fe3O4@PS-COOH纳米球表面的羧基,之后加入金属螯合剂ANTA溶液继续反应;最后,加入LaCl3盐溶液反应;反应结束后离心洗涤去除过量的金属盐,得到沉淀物真空干燥后即得磁性微球粉末Fe3O4@PS-Chelate-La3+,结构如图2所示。
本发明实施例的基于质谱技术和微球的检测方法,所述基于质谱技术和微球的检测方法为:
提供多种本实施例制备的微球,每一种微球螯合的金属离子的组成不同(如质量数不同或金属离子不同),且表面的探针不同,所述金属离子的质量数与所述探针一一对应;
多种微球的探针分别与待测样本中的多种核酸或抗体发生特异性反应,也即所述探针与核酸或抗体一一对应,也即使用金属离子的组成来标记核酸或抗体;
利用质谱技术(使用了ICP-TOF-MS)检测多种微球上的金属离子的组成,从而获得了样本与微球上修饰的核酸探针或抗体发生特异性反应的信息
ICP-TOF-MS的具体结构为:
如图4所示,炬管101和线圈102分别设置在承载单元的不同部件上,炬管101和线圈102保持相对静止;
如图5所示,承载单元包括固定部301、第一安装部302、第二安装部303和连接部304;第二安装部303水平地固定在第一调节单元201上,固定部301固定在所述第二安装部303上侧,连接部304竖直设置,下端固定在第二安装部303上,上端固定水平设置的第一安装部302;炬管101竖直地设置在所述第一安装部302上,线圈102的一端固定在所述固定部301上,另一端环绕炬管101;
如图4所示,第二调节单元固定在底盘100上,包括电机401、螺杆402、螺母、导轨404、滑动件405和轴承,电机401驱动水平设置的螺杆402转动,螺母利用螺纹套在所述螺杆402上,滑动件405设置在与螺杆402平行设置的导轨404上,螺母连接滑动件405,使得单元螺杆402转动时,驱动滑动件405沿着导轨404水平直线移动;轴承设置在滑动件405的顶端;承载件503的四个角分别具有允许竖直设置的导向件504穿过的通孔,通孔的内径和导向件504的外径差别很小,使得承载件503仅能沿着导向件504竖直移动;转换件具有竖直部分501和倾斜部分502,竖直部分501的下端连接所述承载件503,上端连接倾斜部分502,所述倾斜部分502被所述轴承顶着,滑动件405在倾斜部分502下侧水平直线移动,使得倾斜部分502仅有竖直移动;
第一调节单元201采用电动二维移动平台,实现在水平方向的二维调节,设置在所述承载件503上;
图6给出了本发明实施例的飞行时间质量分析器的结构示意图,如图5所示,所述飞行时间质量分析器包括:
推斥极11、无场飞行区30和检测器51,所述无场飞行区30包括第一入射栅网31;
牵引电极12,所述牵引电极12和所述第一入射栅网31间形成第一离子加速区;
第一栅网21和第二栅网22,所述第一栅网21和第二栅网22间电势差为零;所述推斥极11和第一栅网21间,以及第二栅网22和牵引电极12间形成第二离子加速区;离子依次穿过第一栅网21、第二栅网22、牵引电极12、第一入射栅网31和无场飞行区30,被所述检测器51接收;第一栅网21和第二栅网22接地,保证了第一栅网21和第二栅网22等电势;
所述牵引电极12和第一入射栅网31间具有允许离子穿过的多片电极,并利用分压电阻对多片电极分压;牵引电极12和第一入射栅网31间具有允许离子穿过的多片电极,并利用分压电阻对多片电极分压,使得第一离子加速区的电场强度均匀;所述牵引电极12具有允许离子穿过的槽孔,或者具有允许离子穿过的栅网结构;电源给推斥极11施加正脉冲电压,给牵引电极12施加负脉冲电压。
为了实现二阶聚焦,所述第一栅网与第二栅网的距离和无场飞行区满足:
E1、E3分别是所述第二离子加速区、第一离子加速区的电场强度,z0、dG、d2、d3分别是入射离子和第一栅网21间的距离、第一栅网21和第二栅网22间的距离、第二栅网21和牵引电极12间的距离、牵引电极12和第一入射栅网31间的距离;L是离子在第一入射栅网31和检测器51间无场飞行区中飞行的长度。
上述单细胞离子化的方式为:
马达转动,驱动螺母携带滑动件405在导轨404上水平直线移动;
滑动件405在转换件的倾斜部分502下侧水平直线移动,从而转换为转换件的竖直移动(转换件仅有竖直移动),从而带动与所述转换件连接的承载件503沿着多个导向件504竖直移动(承载件503仅有竖直移动),设置在所述承载件503上的承载单元随着所述承载件503竖直移动;炬管101竖直地设置在所述承载单元的第一安装部302上,线圈102固定在所述承载单元的固定部301上,并与所述炬管101保持相对静止;
利用第一调节单元201,在水平方向上二维调节所述承载单元的位置,所述承载单元设置在第一调节单元201上,所述第一调节单元201设置在所述承载件503上;可见,在承载单元的三维调节中,所述炬管101和线圈102保持相对静止;
样品在进入所述炬管101内,通过所述线圈102激发成等离子体,从而形成离子;
所述离子穿过采样锥103后进入质谱分析单元。
实施例3:
根据本发明实施例1的微球及其制备方法、检测方法的应用例。
在本应用例中,微球的制备方法为:
FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O,加入超纯水并超声分散,氮气条件下加热搅拌;加入NH3·H2O、油酸进行反应;将产物磁性分离并用超纯水洗涤直至洗涤液中pH值呈中性,得到稳定磁流体Fe3O4纳米颗粒;
取Fe3O4分散在苯乙烯中,加入二乙烯基苯、过氧化苯甲酰和甲基丙烯酸,形成磁流体并均匀滴加到含有十六醇和十二烷基硫酸钠的水溶液中;氮气条件下加入丙烯酰胺和过硫酸钾的水溶液,恒温70度并搅拌反应,产物用水磁洗即得Fe3O4@PS-NH2,也即在微球表面修饰了氨基(官能团);
取Fe3O4@PS-NH2粉末加入到溶解有化学活化试剂的的溶剂中超声分散,搅拌反应以活化Fe3O4@PS-NH2纳米球表面的氨基,之后加入金属螯合剂Iso-EDTA溶液继续反应。最后,加入TbCl3、TmCl3和HoCl3(均为镧系金属盐)按一定比例混合的镧系金属盐盐溶液进行反应;反应结束后离心洗涤去除过量的金属盐,得到沉淀物真空干燥后即得磁性微球Fe3O4@PS-EDTA-Tb3+/Tm3+/Ho3+,结构如图3所示,从而实现了核酸或抗体的检测。
在本实施例的检测方法中,在飞行时间质量分析器中,如图7所示,第一栅网21和第二栅网22接地,保证了第一栅网21和第二栅网22等电势;牵引电极12和第一入射栅网31间具有允许离子穿过的多片电极,并利用分压电阻对多片电极分压,使得第一离子加速区的电场强度均匀;电源给推斥极11施加正脉冲电压,给牵引电极12施加负脉冲电压;
反射区包括第一反射场和第二反射场,所述第一反射场包括第二入射栅网32和反射电极41,第二反射场包括所述反射电极41和反射板42;从所述无场飞行区30出射的离子被所述反射区反射,之后被所述检测器51接收;所述反射电极41具有允许离子穿过的槽孔,或者具有允许离子穿过的栅网结构;
在第一离子加速区以及第一反射场和第二反射场内,设置允许离子穿过的多片电极,并利用分压电阻对多片电极分压,使得第一离子加速区、第一反射场和第二反射场内的电场强度均匀;
为了实现二阶聚焦,所述第二离子加速区和第一反射场、第二反射场满足:
E1、E3、E4、E5分别是所述第二离子加速区、第一离子加速区、第一反射场和第二反射场的电场强度,z0、dG、d2、d3、d4、d5分别是入射离子和第一栅网21间的距离、第一栅网21和第二栅网22间的距离、第二栅网22和牵引电极12间的距离、牵引电极12和第一入射栅网31间的距离、第二入射栅网32和反射电极41间的距离、反射电极41和反射板42间的距离;L是离子在第一入射栅网31和检测器51间无场飞行区中飞行的长度。
在ICP中,与实施例2不同的是:
1.不再设置第二安装部和连接部,固定部直接固定在第一调节单元上,第一安装部水平地固定在固定部上;
2.螺杆和导轨间保持平行,且相对水平面倾斜设置;
3.转换件包括水平部分和竖直部分,水平部分被滑动件支撑;当倾斜直线移动的滑动件在转换件的水平部分下侧移动时,转换件随之竖直移动,且仅有竖直移动。
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