抗人迁移刺激因子(msf)及其用途
阅读说明：本技术 抗人迁移刺激因子(msf)及其用途 (Anti-human Migration Stimulating Factor (MSF) and uses thereof ) 是由 A·曼托瓦尼 B·博塔兹 I·拉菲斯 A·英弗扎托 T·古力可 于 2018-09-19 设计创作，主要内容包括：本发明涉及能识别和结合包含在人迁移刺激因子(MSF)序列中的表位,且不识别和结合人纤连蛋白1(hFn1)的抗体,以及在诊断方法和治疗中的用途。(The present invention relates to antibodies that recognize and bind to epitopes contained in human Migration Stimulating Factor (MSF) sequences and do not recognize and bind to human fibronectin 1(hFn1), and uses in diagnostic methods and therapy.)
具体实施方式
中，人源化抗体包含来自鼠单克隆抗体的互补决定区(CDR)，其插在所选人抗体序列框架区中。然而也可使用人CDR区。优选人轻链和重链中的可变区技术上由一个或多个CDR交换改变。也可能使用全部6个CDR或少于6个CDR的不同组合。术语抗体还可以包括通过分析与结构-活性关系有关的数据获得的物质。这些化合物还可用作肽模拟物(Grassy G.等,Nature Biotechnol.,1998,卷16,第748-752页；Greer J.等,J.Med.Chem.,1994,卷37,第1035-1054页)。
本发明的抗体还包括那些结合特征已经通过直接突变、亲和成熟法、噬菌体展示改进的抗体。可通过本发明抗体任何CDR中的突变改变或改善亲和性或特异性。术语“可变区”或“可变结构域”指涉及抗体与抗原结合的抗体重链或轻链结构域。天然抗体的重链和轻链(分别为VH和VL)的可变域(或区)通常具有相似结构，每个结构域包含4个框架保守区(FR)和三个超变区(HVR见例如,Kindt等.《Kuby免疫学》(Kuby Immunology),第6版,W.H.Freeman and Co.,91页,2007)。.单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可以用来自与抗原结合的抗体的VH或VL结构域分离与特定抗原结合的抗体，来分别筛选互补VL或VH结构域文库(见例如Portolano等,J.Immunol.150:880-887,1993；Clarkson等,Nature352:624-628,1991)。
在另一个方面，抗体或其衍生物包含重链(VH)可变区序列和/或轻链(VL)可变区序列，其与如上所述SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的氨基酸序列中各自包含的CDR具有至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,或100％的序列相同性。在一些实施方式中，VH序列和/或VL序列与SEQ ID NO:6的aa 20-133或SEQ ID NO:8的aa.21-132分别具有至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或99％的相同性，与参比序列相比含有取代(例如保守取代)，插入或缺失，然而包含该序列的抗-MSF抗体维持与表位结合的能力。抗体样结构域包括与抗体结构相关的结合蛋白，例如T细胞受体。本发明的抗体还包括功能等价物，其包括氨基酸序列与本发明抗体可变或超变区氨基酸序列基本相同的多肽。
在本发明中，“至少80％相同性”指相同性可以是与提到序列至少80％、87％或90％或95％或100％序列相同性。这应用于所有提到的％相同性。优选的，％相同性涉及提到序列的全长。
本发明的序列包括与所述序列具有至少70，优选至少80％，更优选至少90％相同性或同源性的氨基酸序列。相对于参照多肽序列的“氨基酸序列相同性百分数(％)”定义为，比对序列并导入缺口后(如果需要)以实现最大序列相同性百分比之后，候选序列中与参照多肽序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，且不考虑将任何保守性取代作为序列相同性的部分。以测定氨基酸序列相同性百分数为目的比对可以本领域技术范围内的不同方式实现，例如，使用公共渠道可获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能够确定用于比对序列的合适参数，包括使比较的序列实现全长最大对齐所需的任何算法。本发明的抗体可以例如具有以下解离常数(KD)：<100nM,<10nM,<1nM,<0.1nM,<0.01nM,或<0.001nM或以下，例如从10-8M到10-13M,例如从10-9M到10-13M。重组和/或生物技术衍生物以及上述抗体的片段也包括在本发明内，条件是抗体的结合活性及其功能特异性被维持。上述抗体用作药物，优选用于治疗和/或预防癌症或炎症病状。可以用本发明的抗体治疗的疾病优选是肿瘤疾病，例如实体瘤(例如乳癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌如胰腺导管腺癌(PDAC)、胶质瘤、前列腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、肝癌、神经母细胞瘤、黑色素瘤)和非实体瘤(例如白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤、慢性骨髓增生性肿瘤)。
在本发明的语境中，除了癌症，炎症病状包括哮喘、过敏、脓毒症和感染性疾病；自身免疫病，例如类风湿性关节炎和自体炎症疾病，例如炎性肠病；慢性变性疾病，涉及组织重建和纤维化，例如特发性肺纤维化，肝硬化和慢性心脏衰竭。
在本发明的语境下，“癌症”或“肿瘤”包括原代和转移肿瘤，以及难治肿瘤，表达MSF的肿瘤，实体或非实体肿瘤。实体瘤的例子是：乳癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌例如胰腺导管腺癌、胶质瘤、淋巴瘤、前列腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、肝癌、神经母细胞瘤、黑色素瘤。非实体瘤的例子是：白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤、慢性骨髓增生性肿瘤。
本发明的还有一个方面是编码上述抗体或与上述核酸杂交的核酸，或由对应的简并序列组成。本发明范围包括编码上述抗体的表达载体，优选包含上述核酸。本发明范围内还有包含上述核酸或上述载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化株”和“转化细胞”，其包括转化的原代细胞及其衍生的子代，不计步骤次数。子代的核酸含量与亲本细胞未必完全相同，并可包含突变。在本发明中，包括突变子代，其具有与在原始转化细胞中经筛选或选择的相同功能或生物活性。本发明的核酸可用于转化合适的哺乳动物宿主细胞。可用作表达宿主的哺乳动物细胞是熟知的，包括例如CHO和BHK细胞。原核宿主包括例如大肠杆菌，假单胞菌，杆菌等。本发明的抗体可与额外的氨基酸残基，例如促进分离的标签融合。本文所用术语“载体”指能够扩增与之相连的另一核酸的一种核酸分子。该术语包括自复制核酸结构形式的载体，以及进入宿主细胞(载体引入其中的细胞)基因组的载体。某些载体能够引导与之操作性连接的核酸的表达。目前这些载体被称作“表达载体”。可使用任何合适表达载体，例如原核克隆载体如大肠杆菌的质粒，例如colE1,pCR1,pBR322,pMB9,pUC。适用于哺乳动物细胞表达的表达载体包括SV-40、腺病毒、反转录病毒衍生的DNA序列的衍生物。用于本发明的表达载体包含至少一种表达控制序列，其与必须表达的DNA序列或片段可操作性连接。本发明的还有一个目的是治疗和/或预防血管生成相关疾病的方法，疾病优选肿瘤病状如黑色素瘤、胶质母细胞瘤、结直肠癌、乳癌、肾癌、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌和/或转移，视网膜病变例如糖尿病性视网膜病，年龄相关的渗出性黄斑降解的神经血管生成，视网膜动脉阻塞引起的黄斑水肿，病理性近视导致的脉络膜神经血管生成，该方法包括对需要的患者施用治疗有效量的上述抗体或其合成或重组片段。本发明的另一个目的是包含至少上述抗体或其合成或重组片段，和药学上可接受的赋形剂的药学组合物，优选所述组合物用于肠胃外给药，优选静脉内使用。组合物包含有效量的抗体和/或其重组或合成抗原结合片段。药学组合物在该领域是常规的，可由本领域技术人员基于常规的一般知识制备。用于本文所述治疗的制剂可以例如包含上述抗体，其浓度为约0.1mg/ml到约100mg/ml,优选从0.1到10mg/ml,更优选从0.1到5mg/ml。在其他制剂中，抗体浓度可以更低，例如至少100pg/ml。本发明的抗体在一次或多次治疗中施给患者。根据疾病的类型和严重性，可施用约1-20mg/kg抗体剂量，例如一次或多次给药或连续输注。本发明的抗体可以与其他治疗剂联合施用，特别是与能中和涉及肿瘤生长或血管生成的受体的抗体联合施用。任何给药方法可以用于施用本发明的抗体，特别是例如给药可以是经口、静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内。本发明的抗体可作为偶联物给药，其与受体特异性结合并释放毒性物质。在具体实施方式中，本发明的药物组合物可以单剂形式给药(例如片剂、胶囊、丸剂等)。对于药物用途，组合物可以是溶液，例如可注射溶液，乳液，悬液等形式。载剂可以是任何从药学上看适合的载剂。优选所用的载剂能提高分子进入靶细胞的进入效果。在本发明的药物组合物中，抗体可以与其他治疗剂结合，例如与肿瘤生成或血管生成相关的其他生长因子受体的拮抗剂，例如VEGFR-2,EGFR,PDGFR,受体激酶抑制剂，BRAF抑制剂，MEK抑制剂，免疫调节抗体，抗癌药例如：贝伐单抗，雷莫昔单抗，阿飞普西，舒尼替尼，帕唑帕尼,索拉非尼,卡博替尼,阿西替尼,雷戈非尼,尼达尼布,乐伐替尼,维罗非尼,达拉菲尼,曲美替尼,化疗药，例如甲基化剂(替莫唑胺,达卡巴嗪),铂化合物(顺铂、卡铂、沙利铂),紫杉烷(紫杉烷(paclitaxel),白蛋白结合型紫杉烷，多西它赛)，氟化嘧啶(5-氟尿嘧啶、卡培他滨),拓扑异构酶I抑制剂(伊立替康,拓扑替康),聚(ADP-核糖酶)聚合酶抑制剂(PARP)(例如,奥拉帕尼)等。根据治疗要求选择药物组合物。这些本发明的药物组合物可以片剂、胶囊、口服制剂、粉末、颗粒、片剂、注射或输液的液体溶液，悬液，栓剂，吸入制剂施用。制剂参见以下书籍：Remington(《雷明顿：药物科学与实践》(“Remington:The Science andPractice of Pharmacy”),Lippincott Williams&Wilkins,2000)。本领域技术人员可选择给药形式，有效剂量，通过筛选合适的稀释剂、佐剂和/或赋形剂。术语“药物组合物”指此类形式的制剂：所述其中所含活性成分的生物学活性有效，并且不含对待接受该制剂的个体具有不可接受的毒性的其他成分。本发明的另一个方面是产生上述抗体或其合成或重组片段的方法，包括步骤：培养宿主细胞，从细胞培养物纯化抗体或其合成或重组片段。
在本发明的语境中，术语“包含”还包括术语“主要具有”或“主要由……组成”。在本发明中，本文所述的“蛋白质”还包括对应直向或同源基因编码的蛋白质，功能性变体，功能性衍生物，功能性片段或其类似物，同种型，其剪接变体。在本发明中，“功能性”意指，例如，“保持其活性”。本文所用的“片段”表示这样的多肽，其具有优选至少10个氨基酸，更优选地至少15个、至少17个氨基酸或至少20个氨基酸，甚至更优选地至少25个氨基酸或至少37或40个氨基酸，并且更优的至少50、或100、或150或200或250或300或350或400或450或500个氨基酸的长度。本文公开的“MSF片段”优选包含序列VSIPPRNLGY[SEQ ID NO:4的aa.648到aa.657)(SEQ ID NO:11))或其片段。
通过参考下图的非限制性实施例阐述本发明。
图1.MSF和纤连蛋白域结构的比较。MSF是通读机制从单拷贝纤连蛋白产生的hFn1的截短同种型。70kDa蛋白质与hFn1N-端直到外显子III-1a编码的氨基酸序列相同，且添加了独特的10氨基酸长的肽(VSIPPRNLGY(SEQ ID NO:11))[SEQ ID No:4(从aa.648到aa.657)，NCBI登录号N.CAH60958.1])。[20]后适应的图。Fn1和MSF中的功能域：Hip1/Fib1:肝素和纤连蛋白结合域；Gel-BD:对明胶/胶原的结合域；细胞-BD：RGD-介导的与整合素的结合；Hep2：高亲和力肝素结合域；Fib2：C-末端纤连蛋白结合域；IGD基序：异亮氨酸-甘氨酸-天冬酰胺三肽基序介导促细胞运动活性。
图2：用于转染CHO细胞和表达重组人MSF的表达载体的示范性说明。人MSF的完整cDNA序列被亚克隆入存在于载体内的BamIII限制性位点。
图3：在来自表达rhMSF的CHO-3E6克隆的调理培养基上间接ELISA。用不同稀释度的来自CHO-3E6细胞(表达rhMSF)克隆的调理培养基涂覆塑料孔和用兔pAb揭示的结合的MSF。
图4：对免疫过的小鼠的血清进行滴定。几轮免疫接种后收集来自经免疫小鼠的血清，并用ELISA分析。不同稀释度的血清加到涂覆有PBS、人纤连蛋白1(hFn1)和His-MSF的多孔板中。与抗小鼠二抗一起孵育并加入显色底物后，记录450nm处的吸光度。报道的吸光度值指在多个孔中获得的平均值。
图5：间接ELISA首次筛选杂交瘤调理培养基。通过ELISA评估来自96孔板中培养的杂交瘤的调理培养基识别人MSF的能力。简单说，50微升各培养基被加到涂覆有MSFVSIPPRNLGY(SEQ ID NO:11)(SEQ ID No:4的aa 648到aa.657)独特十肽，或来自表达rhMSF的CHO-3E6细胞的调理培养基的多孔板中，如所示。与合适的二抗一起孵育并加入显色底物后，记录450nm处的吸光度。报道的吸光度值涉及单个孔。
图6：间接ELISA二次筛选杂交瘤调理培养基。所选的杂交瘤(来自首次筛选，见图5)亚克隆并在96孔细胞培养板中培养。然后用间接ELISA测试调理培养基，以检测识别人MSF的抗体。简单说，50微升杂交瘤培养基上清液被加到涂覆有MSF VSIPPRNLGY(SEQ IDNO:11)(SEQ ID No:4的aa 648到aa.657)独特十肽，或来自表达rhMSF的CHO-3E6细胞如所述的调理培养基的多孔板中，如所示。与合适的二抗一起孵育并加入显色底物后，记录450nm处的吸光度，如图5所述。阴性对照(缓冲液)在孔1A和1B(抗小鼠IgG)以及1E和1F(抗兔IgG)；阳性对照(肽或来自CHO-3E6的上清液)，在1C和1D(兔pAb)孔中。
图7：以0.5细胞/孔亚克隆后，筛选14个克隆(选自二次筛选)。用来自表达rhMSF的CHO-3ES的浓缩调理培养基(50μl/孔)或人hFn1(1μg/孔)涂覆96孔板。每个克隆在一式两份的孔中测试，数据表示成450nm处测定的平均OD±SD。
图8：ELISA滴定1G5.3单克隆抗体。微量滴定板孔用人rhMSF或hFn1(0.5μg/ml)涂覆，并用不同稀释度的Ig5.3(从10μg/ml到0.005ng/ml)在一式两份的孔中孵育。数据表示成450nm测定的OD(平均±SD)。
图9：重组人MSF的IAC纯化。色谱图记录为280nm处的紫外吸光度。在10％胶上，在变性和还原条件下跑IAC组分(输入、流穿、洗涤、洗脱)。代表性银染色凝胶如插图所示(13μl/泳道)。
图10：1G5.3抗体的人癌组织免疫染色。甲醛固定且石蜡包埋的人乳癌和肺癌组织切片用1G5.3染色。箭头表示阳性细胞。
图11：人癌组织的免疫荧光染色。用CD68和1G5.3对来自乳癌和肺癌的组织样品染色。用箭头标出对两个标志物阳性的细胞。
图12：1G5.3mAb的夹心ELISA。A)免疫亲和纯化的重组人MSF运行的标准曲线。B)来自CHO-3E6细胞的MSF水平(8.0μg/ml±3.1,平均±SEM,n＝3).
图13：夹心ELISA中的hFn1尖峰效应。如图12所述，用1G5.3mAb包被96孔板。然后在存在或不存在hFn1(100μg/ml)的情况下加入缓冲液(PBS)或来自CHO-3E6的上清液，如所述揭示了结合的MSF。
图14：人血浆中的MSF水平。用基于1G5.3mAb的夹心ELISA测定了健康个体和癌症患者血液中的MSF水平。(*p＝0.048,曼-惠特尼检验)。
图15：抗人MSF 1G5.3F(ab)’2片段的制备和表征。A)在Vivaspin 6 10kDa MWCO浓缩机上浓缩1G5.3抗体，相对于100mM柠檬酸钠pH 3.50，在HiTrapDesalting 5ml柱上交换缓冲液，然后用胃蛋白酶反应。显示了来自代表性SEC运行的280nm紫外吸光度(左轴和实线，监测蛋白质洗脱)和导电率(右轴和虚线，监测除盐)的放大图。B)缓冲液交换后的物质与胃蛋白酶一起孵育，然后加到HiTrap MabSelect 1ml柱上，用PBS平衡，用100mM柠檬酸钠(pH3.50)洗脱。报道了典型的色谱(280nm处的紫外吸光度，左轴和实线；导电率，右轴和虚线)。包含Fc片段的未结合(流过)物质被丢弃，保留含有F(ab)’2片段的洗脱液并进一步处理。C)来自B的洗脱液在Vivaspin 6 10kDa MWCO浓缩器上浓缩，在用PBS平衡的Superdex200 10/300GL柱上层析，并用PBS洗脱。用280nm处的紫外吸光度监测蛋白质分离(F(ab)’2,左轴和实线)。100μg等分试样的完整未处理1G5.3抗体以相同条件跑样(完整IgG,右轴和虚线)。显示了两种物质层析的重叠。D)完整1G5.3抗体的等分试样和对应的F(ab)’2片段(来自C中的SEC)在NuPAGE Novex Bis-Tris10％胶中以变性条件下，二硫苏糖醇存在与否的情况下(分别为+DTT和-DTT)分离。显示了考马斯蓝染色的凝胶。未还原的完整1G5.3和F(ab)’2分别迁移到150和110kDa处；还原条件下1G5.3分成60(重链)和25(轻链)kDa的两个条带，而F(ab)’2在25kDa显示一条条带。A到D中的数据代表了三个独立实验。
图16：与1G5.3 mAb和1G5.3-F(ab)’2片段一起产生的背景信号的比较。在包被有1G5.3或1G5.3-F(ab)’2抗体的孔中加入缓冲液，并如文中所述显色。(**p＝0.022斯氏t检验)。
图17：用1G5.3-F(ab)’2片段包被获得的标准曲线。A)在包被了1G5.3-F(ab)’2的孔中孵育0.2–200ng/ml hrMSF。显示了来自许多独立实验的8根标准曲线的重叠。B)报道的是来自A)部分的8根独立曲线的平均所获得的标准曲线。动态线性范围的上下限(适合MSF定量)分别是0.4和25ng/ml。
图18：健康个体和PDAC病人中的MSF水平。用1G5.3-F(ab)'2作为捕获抗体通过夹心ELISA测定MSF。A)健康个体中MSF水平的分布(n＝28)。B)将PDAC患者(n＝33)的MSF水平与健康个体中的比较。(****P<0.0001，曼-惠特尼检验)。
图19：mAb7.1和1G5.3与rhMSF相互作用的斑点印迹分析。重组人MSF(rhMSF)用Bio-Dot仪器(Bio-Rad)吸附到硝基纤维素膜(200ng/孔)上。封闭未包被位点后，用来自mAb7.1杂交瘤培养物的调理培养基(未稀释上清液)或纯化的1G5.3单克隆抗体(250ng/ml)探测斑点。空白孔(不含rhMSF)用作阴性对照(Ctrl)。显示一个印迹代表两次独立实验的斑点。
图20：mAb7.1和1G5.3与biot-VSIPPRNLGY和rhMSF的相互作用的间接ELISA分析。A)biot-VSIPPRNLGY肽(SEQ ID NO:11)(跨越人MSF的C末端的aa648-657序列)捕获在包被NeutrAvidin的Maxisorb板上。加入来自mAb7.1杂交瘤培养物(未稀释)的调理培养基或纯化的1G5.3(10ng/ml)，用合适的HRP-偶联二抗如材料和方法部分所述揭示结合抗体。B)用rhMSF包被Maxisorb板，与mAb7.1杂交瘤培养物或纯化的1G5.3一起孵育。如A所述揭示结合抗体。A和B中的结果都表达成450nm处的吸光度(A450nm，平均±SD)。仅含有NeutrAvidin(A中的NeutrAvidin)或PBS-/-(B中的PBS)的孔作为阴性对照。显示了两次独立实验之一的图，每次实验一式两份进行。
图21：mAb7.1和1G5.3与biot-VSIPPRNLGY(SEQ ID NO:11)以及rhMSF相互作用的剂量依赖性。A)biot-VSIPPRNLGY肽(SEQ ID No:11)捕获在包被有NeutrAcidin的Maxisorb板上，如图20所示。以指定浓度加入来自mAb7.1或1G5.3杂交瘤细胞培养物的调理培养基。用合适的HRP偶联二抗，如材料和方法中所述揭示结合抗体。用rhMSF包被Maxisorb板，与指定稀释度的来自mAb7.1或1G5.3杂交瘤细胞培养物的调理培养基一起孵育。如A所示揭示结合抗体。A和B中结果都表示成扣除来自空白孔的背景信号(即仅含NeutrAvidin或PBS-/-)后的450nm处的吸光度(A450nm，平均±SD)。显示了两次独立实验之一的图，每次实验一式两份进行。
实施例1
材料和方法
市售试剂和细胞系
人纤连蛋白1(hFn1)获自Calbiochem(默克公司(Merck)，意大利米兰；目录号:341635)。低内毒素的胎牛血清(FCS)购自西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)(意大利米兰；目录号:F7524)；用于细胞培养的RPMI-1640，达氏改良伊氏培养基(DMEM)和胰蛋白酶来自隆萨公司(LONZA)(Euroclone,意大利米兰；目录号分别是BE12-167F；BE12-733F和BE17-161E)。具有钙和镁的磷酸缓冲盐(PBS)(PBS+/+)来自Biosera(Biotecna,意大利米兰；目录号:XC-S2067),不含钙和镁的PBS(PBS-/-目录号:D8537)和遗传霉素(G418；目录号:G8168)来自西格玛奥德里奇公司(意大利米兰)。
对人MSF特异性的合成肽(SEQ ID No:4的aa 648-657)由PRIMM S.r.l.(Milan,Italy意大利米兰)合成。在10氨基酸长的肽(VSIPPRNLGYC[SEQ ID No:9])COOH-末端加上半胱氨酸残基。肽与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联(VSIPPRNLGYC-KLH)(SEQ ID NO:9)。
人MSF的长105个氨基酸的片段(His-MSF；MSF的C末端部分的残基553到657；分子量14.335kDa,SEQ ID No:10)，包括C末端的特异性MSF十肽VSIPPRNLGY(SEQ ID NO:11)和N-末端的组氨酸标签，从PRIMM获得。表达载体pSG5(4,100bp)来自Stratagene(美国加利福尼亚州拉由拉(La Jolla))；用于对可选择标记G418赋予抗性的pSV2neo获自ATCC(美国弗吉尼亚州马那萨斯(Manassas))。用2000(英杰公司(Invitrogen))转染CHO细胞。CHO(中国仓鼠卵巢)细胞和SP2/0骨髓瘤细胞获自ATCC(分别是目录号ATCC CCL-61和CRL 1581)，在达氏改良伊氏培养基(DMEM)(补充有L-谷氨酰胺(隆萨公司,目录号:BE17-605E/U1)和10％(v/v)FCS)中培养。
人重组MSF的表达
重组人MSF(rhMSF)在CHO细胞中表达。人MSF的全长cDNA(2,192bp,登录号AJ535086.1,SEQ ID No:3)亚克隆入pSG5的BamH1位点(图2,pSG-MSF)。通过测序确定克隆的MSF的朝向。根据厂商的方案共转染CHO细胞与pSV2neo载体，赋予G418抗性。用800μg/mlG418筛选转染克隆，通过间接ELISA(见下文)使用兔多克隆抗血清(在兔中用MSF十肽接种产生)分析MSF产生。通过有限稀释进一步亚克隆阳性克隆之一，获得CHO-3E6细胞，其产生高水平的人重组MSF。
针对人重组MSF的抗体的产生和纯化
用合成的人MSF特异性的长10个氨基酸的肽免疫兔产生兔多克隆抗血清(pAb)，其中在COOH末端加入一个半胱氨酸(SEQ ID No:9),其与作为运载体的KLH偶联(VSIPPRNLGYC-KLH)(SEQ ID NO:9)。腹膜内用300μg稀释于完全弗氏佐剂中的MSF特异性肽攻击兔。在第21、28和35天用稀释于不完全弗氏佐剂中的肽重复免疫。收集来自免疫兔的血液(40-50ml/兔)，用ELISA针对免疫原(VSIPPRNLGYC-KLH)(SEQ ID NO:9)测试，然后用免疫亲和法在携带相同免疫原的CNBr-琼脂糖柱上纯化特异性抗体。
免疫Balb/c小鼠(BALB/cAnNCrl,查尔斯河(Charles River),意大利，卡尔科(Calco))获得针对rhMSF的单克隆抗体。简单说，来自表达rhMSF的CHO-3E6细胞的200μl上清液在还原和变性条件下在Laemmli的不连续缓冲系统中，在10％聚丙烯酰胺凝胶上分离。凝胶用胶态考马斯(Bio-SafeTMCoomassie,目录号:161-0786,伯乐公司(Bio-Rad))染色，切下70kDa MSF条带，在PBS中粉碎。用悬液免疫8周龄Balb/c小鼠。程序重复三次，每次间隔3周。用纯化的His-MSF(20μg/小鼠)进行第四次攻击。用针对His-MSF和Fn1(用作阴性对照，见下)的间接ELISA分析抗体滴度。用聚乙烯Glycon1550(SERVA，意大利罗马)根据厂商的标准程序将来自响应小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤融合。细胞接种于96孔板中，并用HAT培养基(RPMI-1640培养基，含有10％FCS,100mg/mL链霉素,100IU/mL青霉素,100mM次黄嘌呤,16mM胸腺嘧啶和400mM氨基喋呤)筛选。2周后，用针对肽的间接ELISA筛选培养上清液的抗体反应性和特异性，用CHO-3E6的上清液作为人重组MSF来源。以5细胞/孔亚克隆来自4种不同阳性IgG生产孔的细胞(每个克隆两块96孔板)。用针对MSF十肽的间接ELISA和CHO-3E6细胞上清液所含的rhMSF进行第二次筛选。再次以0.5细胞/孔亚克隆两种不同IgG生产孔的细胞。通过针对包含在CHO-3E6细胞上清液中的rhMSF和Fn1的间接ELISA测试该亚克隆Ig的杂交瘤。发现总共14个杂交瘤能识别CHO-3E6培养上清液中含有的rhMSF，但不识别Fn1。选择杂交瘤1G5.3用于进一步开发。从蛋白质G-琼脂糖4Fast Flow柱(GE医疗公司(GEHealthcare),宾夕法尼亚州匹兹堡(Pittsburgh),目录号:17061801)根据厂商指示纯化现在命名为1G5.3的从1G5.3杂交瘤分泌的单克隆抗体。简单说，用PBS+/+平衡蛋白质G-琼脂糖柱(1ml柱体积)，加载用相同缓冲液稀释的培养上清液。流穿再次加在柱上，过程重复3次。然后用0.1M甘氨酸-HCl(pH2.8)洗脱MSF特异性抗体，然后立即用1.5M Tris-HCl(pH8.8)缓冲。用小鼠单克隆抗体同种型测试试剂盒(伯乐公司，目录号：MMT1)测定1G5.3的同种型。使用兔mAb RM103(阿柏堪穆公司(Abcam),目录号:190484；抗小鼠κ轻链)和大鼠mAb JC5-1(阿柏堪穆公司,目录号:99622,抗小鼠λ轻链)通过Western印迹测定轻链类型。
1G5.3序列的测定
使用试剂(安碧公司(Ambion)，目录号:15596-026)遵循技术手册从杂交瘤细胞分离总RNA。然后使用同种型特异性反义引物或通用引物，根据PrimeScriptTM第一链cDNA合成试剂盒(宝生物公司(Takara),目录号:6110A)的技术手册将总RNA逆转录成cDNA。根据GenScript的cDNA末端快速扩增(RACE)的标准操作程序(SOP)扩增VH、VL、CH和CL的抗体片段。分别将扩增的抗体片段克隆入标准克隆载体。进行集落PCR筛选具有正确尺寸的插入物的克隆。对于每个片段，对不少于五个具有正确尺寸的插入物的克隆进行测序。比对不同的克隆序列，提供共有序列。
F(ab)’2片段的制备
从1G5.3[1G5.3-F(ab)’2]通过酶处理产生F(ab)’2片段。8ml(8mg)等分试样的1G5.3单克隆抗体(1mg/ml于PBS溶液中)(西格玛奥德里奇公司,目录号:D1408)在Vivaspin6PES 10kDa MWCO浓缩器(赛多利斯斯泰帝公司(Sartorius Stedim),德国，哥廷根(Goettingen),目录号:VS0602)上浓缩到1ml，在HiTrap脱盐5ml柱(GE医疗公司,目录号:17-1408-01)上对100mM柠檬酸钠(pH 3.50)(默克密理博公司(Merck Millipore),德国，达姆施塔特(Darmstadt),目录号.106448)进行缓冲液交换，连续进行两次(500μl/次)。合并含蛋白质的组分(总体积4ml)，通过280nm处的紫外吸光度测定抗体浓度，使用1.4的值作为小鼠IgG1在280nm处的消光系数(表示成0.1％(w/v)溶液在280nm处的吸光度)。
为了产生1G5.3-F(ab)’2片段，每mg抗体加入5μg胃蛋白酶(西格玛奥德里奇公司,目录号:P6887)，得到的混合物在37℃孵育16小时。通过加入650μl 1M Tris-Cl,pH 8.80(默克密理博公司,目录号:108382)调节溶液pH至7.0，以封闭反应。然后将溶液加到HiTrapMabSelect蛋白质A1ml柱(GE医疗公司)上，用PBS平衡并用100mM柠檬酸钠(pH3.5)以1ml/分钟洗脱。合并含有F(ab)’2的组分(总体积4ml)，用Vivaspin 6PES 10kDa MWCO浓缩器浓缩到600μl。在Superdex 20010/300GL柱(GE医疗公司)上层析浓缩的物质，该柱用PBS平衡，并以PBS以0.5ml/分钟速度洗脱。如上所述测定洗脱的组分中F(ab)’2片段，将SEC纯化的物质储存在-20℃备用。所有层析在Purifier FPLC系统(GE医疗公司)上进行；分别通过280nm处的紫外吸光度和导电率(mS/cm)监测蛋白质洗脱和盐分离。完整1G5.3抗体的3μg等分试样和对应的1G5.3-F(ab)’2片段(来自SEC)在NuPAGE Novex Bis-Tris 10％胶(赛默飞世尔科学公司(Thermo Fisher Scientific),马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham))中以变性条件下，二硫苏糖醇存在与否的情况下分离。电泳后，用Bio-Safe考马斯染料(伯乐公司,加利福尼亚州赫拉克勒斯(Hercules))检测蛋白质。
人重组MSF的纯化
通过免疫亲和层析(IAC)，从CHO-3E6的调理培养基中纯化人重组MSF。400ml调理培养基以2.5ml/分钟加到Purifier FPLC系统(GE医疗公司)中的共价偶联有1G5.3(2.8mg 1G5.3/ml亲和培养基)的5ml HiTrap NHS-激活的HP柱(GE医疗公司,宾夕法尼亚州匹兹堡)上,用缓冲液A(50mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH 7.00)平衡。用缓冲液A，然后用缓冲液B(50mM Tris-HCl,500mM NaCl,pH7.00)以5ml/分钟充分洗涤1G5.3柱，用缓冲液C(3.5M MgCl2)洗脱结合的rhMSF，总体积为4ml。用Purifier FPLC系统上的分析级Superdex 200 10/300GL凝胶过滤系统(GE医疗公司)评估洗脱蛋白质的均一性，使用缓冲液B以0.5ml/分钟平衡和洗脱。另外，来自IAC的调理培养基(输入)、未结合物质(流穿)和洗脱的蛋白质(洗脱)的等分试样在NuPAGE Novex Bis-Tris 10％凝胶(赛默飞世尔科学公司,马萨诸塞州沃尔瑟姆)上在变性和还原条件下(即在二硫苏糖醇的存在下)解析。电泳后，用ProteoSilver Plus银染色试剂盒(西格玛奥德里奇公司,密苏里州圣路易斯(St.Louis))和Bio-Safe考马斯染料(伯乐公司,加利福尼亚州赫拉克勒斯)解析蛋白质，或将其转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用于随后使用抗人MSF或抗-hFn1兔多克隆抗体，然后用连接有抗兔IgG辣根过氧化物酶(HRP)的完全驴抗体(GE医疗公司)的免疫检测。用Immobilon western HRP底物(默克密理博公司,德国，达姆施塔特)对膜显色，在ChemidocMP系统(伯乐公司)上记录化学发光。整个纯化过程中，用Bradford蛋白质试验(伯乐公司)检测总蛋白质含量，用如下所述的“内部”ELISA MSF试验测定rhMSF特异性滴度。
对人肿瘤切片的免疫组化分析
切下石蜡包埋的人组织切片，并在37℃保存过夜。切片在Bioclear中脱蜡。在Decloaker室中，在DIVA缓冲液1X(生物医疗公司(Biocare Medical)目录号:DV2004)中进行抗原去掩蔽，在125℃进行3分钟，90℃进行5分钟。用Peroxidized-1(生物医疗公司，目录号:PX968)封闭内源过氧化物酶15分钟后，用Background Sniper溶液(生物医疗公司，目录号:BS966)封闭非特异性结合位点30分钟。然后用1G5.3(1/150-1/300)孵育人组织样品1小时，以鉴定MSF，或用小鼠单克隆抗人CD68(达科公司(Dako)目录号:MO876,克隆PG-M1,780μg/ml持续1小时)鉴定巨噬细胞。用CD68染色不需要抗原去掩蔽。在与兔抗小鼠MACH1聚合物-HRP(生物医疗公司，目录号:MIU539)孵育20分钟后揭示1G5.3或CD68的免疫染色。然后用3,3’-二氨基联苯胺四盐酸(生物医疗公司，目录号:DB801)显色反应。用苏木精溶液复染玻片3分钟。
间接ELISA
ELISA板(Nunc Maxisorb免疫平板目录号:446612)用His-MSF(1-0.5μg/孔),来自CHO-3E6(50μl)的上清液或hFn1(1μg/孔)(用15mM碳酸钠缓冲液(pH9.6)稀释)包被(4℃过夜)。包被后，用PBS+/+和0.05％(v/v)Tween 20(洗涤缓冲液)洗涤平板三次，室温与5％(w/v)脱脂牛奶(溶于洗涤缓冲液)孵育2小时封闭非特异性相互作用。用洗涤缓冲液洗涤孔三次，然后加入兔多克隆抗血清、来自抗MSF杂交瘤的上清液或稀释于洗涤缓冲液的纯化的1G5.3的等分试样，在室温孵育1小时。然后加入用辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG或抗小鼠IgG(目录号分别为GENA934和GENA931，GE医疗公司)(1/2000，于洗涤缓冲液中)，室温孵育1小时。用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB；1StepTMULTRA TMB-ELISA,赛默飞科学公司(ThermoScientific),美国伊利诺伊州罗克福德(Rockford)；目录号:34019)使反应显色，用2NH2SO4终止，然后用自动读板仪(Versamax微量滴定板读数器)读出450nm处的吸光度。一式三份分析每个样品，将结果报道成平均OD450±SD或SEM，如图中所示。在包被缓冲液的孔中加入抗MSF抗体获得基线。
夹心ELISA
为了测定生物液体中的MSF水平，开发了夹心ELISA。为此，ELISA平板和稀释于PBS-/-(pH7.0)的250ng/孔的1G5.3或500ng/孔的1G5.3-F(ab)’2片段4℃孵育过夜。包被后，用300μl洗涤缓冲液洗涤平板三次，然后用5％脱脂牛奶37℃封闭2小时。然后加入1/10稀释于含有2％胎牛血清白蛋白的洗涤缓冲液的100μl人血浆(获得使用同意书)，室温孵育1小时。在同一平板中，用纯化重组人MSF产生标准曲线。洗涤后，平板与识别人hFn1的市售生物素化多克隆绵羊IgG(0.25μg/ml，于洗涤缓冲液中；R&D目录号:BAF1918)一起室温孵育1小时。最后，加入1/10000稀释于洗涤缓冲液的100μl过氧化物酶-链霉亲和素(BioSpa目录号:SB01-161)，室温孵育1小时。然后洗涤平板，用100μl/孔生色底物TMB孵育，然后用2NH2SO4封闭。如上所述读出450nm的吸光度。根据重组MSF制作的标准曲线用线性回归计算血浆样品中的MSF浓度。
结果
本发明涉及人MSF作为炎性病变例如哮喘、过敏和癌症中所涉及的M2极化巨噬细胞的诊断和预后标志物的检测。为此，发明人开发了特异性识别rhMSF的单克隆抗体1G5.3。抗体1G5.3可通过ELISA鉴定rhMSF，可用于免疫亲和纯化rhMSF，在免疫组织化学中是有效的。最后也是最重要的，1G5.3mAb已高效用于开发测定生物液体中人MSF水平的特异性ELISA系统。该试验基于我们特别优越的特异性识别MSF的1G5.3抗体，抗体片段或其衍生物，以及基于使用全长人重组MSF作为标准。
人重组MSF的生产
从pSG-MSF转染的CHO细胞上清液纯化人重组MSF。通过间接ELISA分析了大约300个衍生自用pSG-MSF和pSVneo转染的CHO细胞的克隆，最初使用通过用偶联有KLH的MSF特异性肽免疫兔产生的pAb。仅6个克隆产生了理想水平的rhMSF，通过限制稀释进一步亚克隆。图3报道了间接ELISA的结果，显示克隆CHO-3E6收集的上清液的滴定曲线，其被选作重组蛋白来源用于进一步开发。
1G5.3 mAb的产生和表征。如材料和方法部分详述的，通过用rhMSF免疫小鼠，产生单克隆抗体1G5.3。通过间接ELISA，用His-MSF作为阳性对照，hFn1作为阴性对照分析免疫小鼠的血清。如图4所示，血清至少在本文所用的实验设置下识别人MSF(His-MSF)的100个氨基酸的片段，但不识别hFn1。
然后将来自响应小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤融合，铺在96孔板中。制备总共5块平板。2周后，用间接ELISA测试融合：来自5块96孔板的每个孔的100μl上清液分配到先前用作为重组MSF来源的CHO-3E6细胞上清液或用特异性MSF十肽包被的板孔中。图5报道了所分析的一块板的结果。从该最初筛选中，发明人选了四个孔(板1的G5和B8，板5的A5和D7)，以5细胞/孔(每个克隆2块板)亚克隆。
用这些平板的上清液通过间接ELISA对肽和来自作为重组MSF来源的CHO-3E6细胞上清液进行二次筛选。图6报道了衍生自克隆G5的两块平板的筛选。从这次筛选中，发明人选择了两个克隆，板1的F7和板2的B8，以0.5细胞/孔亚克隆。获得10块平板，在包被有肽或来自作为rhMSF来源的CHO-3E6细胞上清液的微量滴定板上测试上清液。从该分析中，发明人选择14个克隆，命名为1G5.1、1G5.2、1G5.3……直到1G5.14。在6孔板中培养克隆，再次在CHO-3E6转染细胞上清液和hFn1中测试识别MSF的能力。如图7所示，这些克隆都不能识别hFn1，但能以不同效力识别MSF。选择克隆1G5.3用于进一步开发。
通过在蛋白质-G琼脂糖上亲和层析，从杂交瘤细胞培养上清液中纯化mAb1G5.3。杂交瘤1G5.3表达亚型1G1重链和κ轻链的分泌抗体。最后用ELISA分析纯化的抗体。图8显示了纯化的单克隆抗体1G5.3对包被有rhMSF或hFn1(都是500ng/孔)的板的滴定曲线结果。结果确证了mAb 1G5.3不识别人hFn1。
1G5.3的DNA和蛋白质序列
亚克隆两条链后，获得1G5.3的重链和轻链DNA序列。1G5.3的鼠重链DNA序列如SEQID NO:5所示，蛋白质序列如SEQ ID NO:6所示。1G5.3的轻链DNA序列如SEQ ID NO:7所示，蛋白质序列如SEQ ID NO:8所示。
mAb 1G5.3用于纯化rhMSF
可通过免疫亲和层析(IAC)高效纯化培养上清液中CHO-3E6细胞分泌的rhMSF。来自CHO-E6细胞的调理培养基(输入)通过如“材料和方法”所述平衡和洗脱的1G5.3柱。纯化过程的典型结果如图9所示。
mAb1G5.3用于免疫组化分析
1G5.3在免疫组化分析中是有效的，识别人癌症组织中的MSF，如图10所示。蛋白质在癌细胞也在乳腺癌组织中的体细胞中，和肺癌组织的肺泡巨噬细胞中(如形态学判断)表达。用巨噬细胞标志物CD68的双免疫荧光染色证实了肺癌组织中肺泡巨噬细胞和乳腺癌标本的一部分巨噬细胞中的表达(图11)。
mAb 1G5.3用于开发测定生物液中MSF水平的免疫试验
为了开发测试生物液中MSF水平的免疫试验，发明人测试了1G5.3作为捕获抗体。为了产生标准曲线，用稀释于碳酸盐缓冲液中的250ng/孔mAb 1G5.3包被ELISA微量滴定板中的塑料孔。然后，封闭非特异性位点，将系列稀释的rhMSF(浓度范围为1.5-1000ng/ml)分散在一式两份的孔中。仅用缓冲液包被的孔作为阴性对照。如材料和方法部分详述进行ELISA，在过程终点，通过与针对hFn1的市售绵羊抗血清孵育揭示结合的MSF。图12A报道了根据该过程获得的典型标准曲线。最初，发明人用该试验测定CHO-3E6细胞培养上清液中的MSF水平。如图12B所示，来自CHO-3E6的上清液中MSF浓度约为8.0±3.1μg/ml(平均±SEM；三批不同的上清液)。
为了对此进行验证，尽管使用抗hFn1作为检测抗体，ELISA特异性识别人MSF，将多至100μg/ml纯化的hFn1加到试验中。如图13所示，hFn1在开发的夹心ELISA中不显示，而且加入hFn1不影响人MSF的识别。结果确认了1G5.3在识别和捕获人MSF，而不是hFn1中的特异性。发明人接着测试了该ELISA试验，以评估健康个体和癌症患者(获得其知情同意书)的血浆样品中的MSF含量。图14报道了所开发的夹心ELISA获得的结果。在健康个体和癌症病人的血浆中都可测量MSF。另外，如图14所示，患有癌症的患者相比健康个体具有更高水平的MSF(p＝0.048，曼-惠特尼检验)。
1G5.3-F(ab)’2片段的产生
基于使用我们的mAb 1G5.3的夹心ELISA能有效在培养上清液和血浆样品中测定MSF水平。为了提高ELISA的特异性，发明人也测试了用胃蛋白酶处理纯化抗体后获得的1G5.3-F(ab)’2。为此，在Vivaspin 6浓缩机(10kDa MWCO)上浓缩1G5.3抗体，相对于100mM柠檬酸钠pH 3.50，在HiTrap Desalting 5ml柱上交换缓冲液，然后用胃蛋白酶反应。图15A显示了SEC分离蛋白后，胃蛋白酶处理前的典型概貌。经缓冲液交换的物质与胃蛋白酶一起孵育(37℃持续14小时)，然后加到HiTrap MabSelect柱上，以分离Fc片段，从F(ab)’2片段回收未结合物质(流穿)，用100mM柠檬酸钠从柱上洗脱(图15B)。随后用Vivaspin 6浓缩从柱上洗脱的F(ab)’2片段，在Superdex 200 10/300GL柱上层析，用PBS平衡和洗脱(图16C)。100μg等分试样的完整未处理1G5.3抗体以相同条件跑样(完整IgG,右轴和虚线，图15C)。完整1G5.3抗体和对应的F(ab)’2片段(来自C中的SEC)的等分试样在NuPAGE Novex Bis-Tris10％胶中以变性条件下，二硫苏糖醇存在与否的情况下(分别为+DTT和-DTT)分离。图15D报道了用考马斯染色的代表性凝胶。未还原的1G5.3和1G5.3F(ab)’2分别迁移到150和110kDa处；还原条件下1G5.3分成60(重链)和25(轻链)kDa的两个条带，而1G5.3-F(ab)’2在25kDa显示一条条带。
1G5.3-F(ab)’2片段用于开发测定生物液中MSF水平的免疫试验
然后在夹心ELISA中根据上述相同程序测试1G5.3-F(ab)’2片段。发明人最初比较了包被于塑料孔中的两种不同抗体获得的背景。如图16所示，用1G5.3-F(ab)’2包被背景显著减少(p＝0.022；斯氏t检验)。这对于提高试验检测下限至关重要。为了确定用于标准曲线的rhMSF浓度的最佳范围，不同量的蛋白质(0.2-200ng/ml)在1G5.3-F(ab)’2包被的平板上孵育。rhMSF标准曲线的最佳范围结果是0.4-25mg/ml，这导致试验的灵敏度与基于1G5.3mAb(检测下限是1.5mg/ml)的设置有进步。图17A显示了所获得的标准曲线的可复制性，而图17B显示了产生的标准曲线。发明人然后测定了从健康供体和患有胰腺导管腺癌(PDAC)的患者(已获得告知同意书)收集的一系列血浆中的MSF水平。健康供体的中位MSF水平为11.11ng/ml(Q1-Q3:4.64-17.97；n＝28；图18A)，在PDAC病人中中位MSF水平是143.7ng/ml(Q1-Q3:111,6-176,8；n＝33；图18B),与健康个体的水平有统计学意义的差异(p<0.0001曼-惠特尼检验)。总的说，本文显示的数据提示，1G5.3是识别MSF，一种与M2极化巨噬细胞有关的分子的特异性单克隆抗体。抗体及其衍生物可高效定量具有与巨噬细胞的M2极化相关的病理状态的个体生物液中的MSF水平。
临床应用
所开发的单克隆抗体可用于鉴定M2极化巨噬细胞(涉及不同炎症病状)和M2样肿瘤结合巨噬细胞。另外，抗体还可用于开发评估蛋白质循环水平的试验。MSF表达的分析可在癌症患者和其它人中具有诊断和预后价值。
实施例2
材料和方法
蛋白质和肽
如实施例1中所述在CHO细胞克隆中表达并纯化出rhMSF。由PRIMM S.r.l.(意大利米兰)合成对人MSF特异性的合成肽，其含有与N-端通过氨基己酸(Ahx)臂连接的生物素部分(biot-VSIPPRNLGY[biot-Ahx-VSIPPRNLGY](SEQ ID NO:11),aa 648-657)。
商业试剂
低内毒素的胎牛血清(FCS)购自西格玛奥德里奇公司(意大利米兰；目录号:F7524)；达氏改良伊氏培养基(DMEM；)来自隆萨公司(Euroclone,意大利米兰；目录号:BE12-733F)。具有钙和镁的磷酸缓冲盐(PBS)(PBS+/+)来自Biosera(Biotecna,意大利米兰；目录号:XC-S2067),不含钙和镁的PBS(PBS-/-目录号:D8537)来自西格玛奥德里奇公司(意大利米兰)。所有其他化学品购自西格玛奥德里奇公司，都是可得到的最高纯度。
mAb7.1杂交瘤培养物
细胞在含有10％FCS的DMEM上生长。从约6-8x105细胞/ml培养物中收集含有分泌的抗体的调理培养基(上清液)，2,000rpm离心除去细胞碎片，然后进行斑点印迹和ELISA分析。用间接ELISA和斑点印迹分析mAb7.1识别CHO-3E6细胞纯化获得的rhMSF或biot-VSIPPRNLGY(SEQ ID NO:11)肽的能力。在同一组试验中，用来自1G5.3杂交瘤的上清液或纯化的1G5.3mAb比较。
对rhMSF的间接ELISA
用rhMSF包被(4℃过夜(O/N))ELISA平板(Nunc Maxisorb免疫平板，目录号:446612)(200ng/孔，溶于15mM碳酸钠缓冲液,pH 9.60)。然后用含有0.05％(v/v)Tween 20的PBS+/+(洗涤缓冲液)洗涤平板三次，室温与5％(w/v)脱脂牛奶(溶于洗涤缓冲液)孵育2小时封闭未包被的位点。用洗涤缓冲液洗涤孔三次，然后加入100μl等分试样的来自mAb7.1杂交瘤的上清液(如说明，未稀释或用洗涤缓冲液稀释)或1G5.3杂交瘤培养物(如说明稀释于洗涤缓冲液)，或纯化的1G5.3抗体(用洗涤缓冲液稀释；10ng/孔)。室温孵育1小时和额外洗涤后，加入100μl/孔偶联于辣根过氧化物酶(GE医疗公司,宾夕法尼亚州匹兹堡,目录号:GENA931)的抗小鼠IgG抗体(在洗涤缓冲液中1:2,000稀释)，进一步室温孵育1小时。通过加入3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB；1StepTMULTRA TMB-ELISA,赛默飞科学公司,美国伊利诺伊州罗克福德；目录号:34019),然后加入2N H2SO4揭示结合的抗体。在VersaMax分光光度计(分子装置公司(Molecular Devices),加利福尼亚州森尼韦尔(Sunnyvale))上读板，结果表示成450nm的吸光度(A450nm)。对于每个使用的抗体稀释度，扣除空白孔的背景吸收(即不含MSF)。一式两份分析每个样品，将结果报道成平均±SD或SEM，如图中所示。
biot-VSIPPRNLGY(SEQ ID NO:11)肽上的间接ELISA
用PBS-/-中的NeutrAvidin蛋白包被(4℃过夜)Nunc Maxisorb免疫平板(1μg/孔；赛默飞科学公司,美国伊利诺伊州罗克福德；目录号:31000)。加入Biot-VSIPPRNLGY(SEQID NO:11)肽(100μl/孔,10μg/ml溶于含有0.05％(v/v)Tween 20的PBS+/+中,洗涤缓冲液)，室温捕获在NeutrAvidin层上一小时，这允许肽实现N→C朝向，因此模拟了其在MSF蛋白存在下的拓扑学组织[19]。未涂覆的位点通过在室温下与溶于PBS+/+的2％(w/v)牛血清白蛋白(BSA,西格玛奥德里奇公司；目录号:A7030)孵育2小时进行封闭。用洗涤缓冲液洗涤孔三次，然后加入50μl等分试样的来自mAb7.1杂交瘤的上清液(如说明，用洗涤缓冲液未稀释或稀释)或1G5.3杂交瘤培养物(如说明稀释于洗涤缓冲液)，或纯化的1G5.3抗体(用洗涤缓冲液稀释；10ng/孔)。如上所述揭示结合的抗体，结果表示成450nm处的吸光度(A450nm)。一式两份分析各样品，结果报道成平均值±SD。
斑点印迹分析
除了ELISA，用斑点印迹评估1G5.3和mAb7.1抗体与rhMSF的相互作用，根据厂商说明书通过真空阀门操作使用Bio-Dot设备(伯乐公司,美国加利福尼亚州赫拉克勒斯；目录号:1620115)。100μl等分试样的rhMSF(200ng/孔)溶于15mM碳酸钠缓冲液(pH 9.60)，通过用100μl/孔20mM Tris-HCl,500mM NaCl,pH 7.50(TBS)预先湿润的0.45μm硝基纤维素膜。未包被的位点通过在室温下与2％(w/v)BSA的TBS溶液(TBS-BSA)孵育1小时进行封闭。用含有0.05％(v/v)Tween20(TBS-T)的200μl/孔TBS洗涤孔三次，然后加入100μl/孔来自mAb7.1杂交瘤培养物的上清液(用TBS-BSA1:2稀释)或纯化的1G5.3抗体(250ng/ml，溶于TBS-BSA)。室温孵育30分钟和额外洗涤后，加入100μl/孔偶联于辣根过氧化物酶的抗小鼠IgG抗体(在TBS-BSA中1:3,000稀释)，进一步室温孵育30分钟。洗涤后，用PierceTMECL Western印迹底物(赛默飞科学公司；目录号:32106)揭示结合的抗体，在ChemiDoc MP系统(伯乐公司)上记录化学发光。用ImageLab软件(伯乐公司)分析获得的图像。
结果
在最初的实验中，发明人评估了mAb7.1(在产生抗体的杂交瘤细胞克隆培养的调理培养基中)和纯化的1G5.3在斑点印迹设置下对重组人MSF(rhMSF)的识别。如图19所示，两种抗体识别吸附的蛋白质，对空白孔有低非特异性结合。这和先前对mAb7.1在斑点印迹实验中的应用的报道一致[21,24,19]。另外，这些发现表明1G5.3抗体适用于斑点印迹分析。发明人因此将比较调查扩展到间接ELISA，使用包被了biot-VSIPPRNLGY(SEQ ID NO:11)肽(用于评估表位结合)或rhMSF的Maxisorb平板。如图20所示，纯化的1G5.3与biot-VSIPPRNLGY(SEQ ID NO:11)和rhMSF都结合，然而mAb7.1不能识别独特的MSF十肽和完整的蛋白质(rhMSF)(图20A和B)。在此值得注意在这些实验中使用的纯化1G5.3浓度低至10ng/ml，以排除灵敏度问题。为了进一步克服这一点，发明人比较了相同设置中系列稀释的来自1G5.3和mAb7.1杂交瘤的调理培养基，其从培养物中收集，具有类似的细胞计数和存活率。如图21所示，1G3.5杂交瘤的上清液证实对biot-VSIPPRNLGY肽(SEQ ID NO:11)(组图A)和重组MSF蛋白(组图B)的识别都是有效的。与此截然相反，mAb7.1杂交瘤的上清液两种分子都不能识别，尽管它已经比1G5.3有少得多的稀释(即浓度更高)。
结论
先前报道了抗体mAb7.1在斑点印迹设置中识别rhMSF[19，24]，但对于该抗体在ELISA中的应用还没有数据。另外，基于现有的证据，该抗体的使用限于免疫组织化学过程[19,20,23]。发明人在此观察到mAb7.1在斑点印迹实验中结合rhMSF，但当biot-VSIPPRNLGY肽(即MSF的C-端独特尾部,SEQ ID NO:11)和rhMSF吸附在Maxisorb板的塑料孔中，在典型ELISA条件下不能对其识别。最重要的是，1G5.3抗体(调理培养基中或作为纯化分子)以剂量依赖形式识别biot-VSIPPRNLGY(SEQ ID NO:11)肽和rhMSF。另外，纯化的1G5.3在斑点印迹实验中特异性检测rhMSF，其将该抗体的应用范围扩大到了斑点印迹。这些结果表明，mAb7.1不适合ELISA应用，而1G5.3抗体在不同实验设置下具有独特的识别MSF的能力，最重要的是在设计用于病理条件的生物液中测定MSF水平的ELISA免疫试验中具有独特的识别MSF的能力。
序列
SEQ ID NO：1：纤连蛋白1的mRNA[智人],完整密码子(7753bp)；GenBank登录号AB191261.1
SEQ ID NO：2：纤连蛋白1的蛋白质序列[智人](2265aa),GenBank登录号BAD52437.1
SEQ ID NO：3：迁移刺激因子的mRNA[智人](2192bp)；GenBank登录号AJ535086.1
SEQ ID NO：4：迁移刺激因子的蛋白质序列[智人](657aa)；GenBank n℃AH60958.1
1G5.3的DNA和蛋白质序列：
SEQ ID NO：5：1G5.3重链的DNA序列(1374bp)
SEQ ID No:6:1G5.3重链的蛋白质序列(457aa):
SEQ ID No:7:1G5.3轻链的DNA序列(720bp):
SEQ ID No:8:1G5.3轻链的蛋白质序列(239aa):
SEQ ID No:9:MSF特异性的十肽(SEQ ID No 4的aa 648-657)，其中在COOH-末端加上半胱苷酸
VSIPPRNLGYC
SEQ ID No:10:His-MSF(SEQ ID No 4的aa 553-657加上His标签；123aa)
SEQ ID No:11:MSF特异性的十肽(SEQ ID No 4的aa 648-657)
VSIPPRNLGY
参考文献
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序列表
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7753
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
gcccgcgccg gctgtgctgc acagggggag gagagggaac cccaggcgcg agcgggaaga 60
ggggacctgc agccacaact tctctggtcc tctgcatccc ttctgtccct ccacccgtcc 120
ccttccccac cctctggccc ccaccttctt ggaggcgaca acccccggga ggcattagaa 180
gggatttttc ccgcaggttg cgaagggaag caaacttggt ggcaacttgc ctcccggtgc 240
gggcgtctct cccccaccgt ctcaacatgc ttaggggtcc ggggcccggg ctgctgctgc 300
tggccgtcca gtgcctgggg acagcggtgc cctccacggg agcctcgaag agcaagaggc 360
aggctcagca aatggttcag ccccagtccc cggtggctgt cagtcaaagc aagcccggtt 420
gttatgacaa tggaaaacac tatcagataa atcaacagtg ggagcggacc tacctaggca 480
atgcgttggt ttgtacttgt tatggaggaa gccgaggttt taactgcgag agtaaacctg 540
aagctgaaga gacttgcttt gacaagtaca ctgggaacac ttaccgagtg ggtgacactt 600
atgagcgtcc taaagactcc atgatctggg actgtacctg catcggggct gggcgaggga 660
gaataagctg taccatcgca aaccgctgcc atgaaggggg tcagtcctac aagattggtg 720
acacctggag gagaccacat gagactggtg gttacatgtt agagtgtgtg tgtcttggta 780
atggaaaagg agaatggacc tgcaagccca tagctgagaa gtgttttgat catgctgctg 840
ggacttccta tgtggtcgga gaaacgtggg agaagcccta ccaaggctgg atgatggtag 900
attgtacttg cctgggagaa ggcagcggac gcatcacttg cacttctaga aatagatgca 960
acgatcagga cacaaggaca tcctatagaa ttggagacac ctggagcaag aaggataatc 1020
gaggaaacct gctccagtgc atctgcacag gcaacggccg aggagagtgg aagtgtgaga 1080
ggcacacctc tgtgcagacc acatcgagcg gatctggccc cttcaccgat gttcgtgcag 1140
ctgtttacca accgcagcct cacccccagc ctcctcccta tggccactgt gtcacagaca 1200
gtggtgtggt ctactctgtg gggatgcagt ggctgaagac acaaggaaat aagcaaatgc 1260
tttgcacgtg cctgggcaac ggagtcagct gccaagagac agctgtaacc cagacttacg 1320
gtggcaactc aaatggagag ccatgtgtct taccattcac ctacaatggc aggacgttct 1380
actcctgcac cacagaaggg cgacaggacg gacatctttg gtgcagcaca acttcgaatt 1440
atgagcagga ccagaaatac tctttctgca cagaccacac tgttttggtt cagactcgag 1500
gaggaaattc caatggtgcc ttgtgccact tccccttcct atacaacaac cacaattaca 1560
ctgattgcac ttctgagggc agaagagaca acatgaagtg gtgtgggacc acacagaact 1620
atgatgccga ccagaagttt gggttctgcc ccatggctgc ccacgaggaa atctgcacaa 1680
ccaatgaagg ggtcatgtac cgcattggag atcagtggga taagcagcat gacatgggtc 1740
acatgatgag gtgcacgtgt gttgggaatg gtcgtgggga atggacatgc attgcctact 1800
cgcagcttcg agatcagtgc attgttgatg acatcactta caatgtgaac gacacattcc 1860
acaagcgtca tgaagagggg cacatgctga actgtacatg cttcggtcag ggtcggggca 1920
ggtggaagtg tgatcccgtc gaccaatgcc aggattcaga gactgggacg ttttatcaaa 1980
ttggagattc atgggagaag tatgtgcatg gtgtcagata ccagtgctac tgctatggcc 2040
gtggcattgg ggagtggcat tgccaacctt tacagaccta tccaagctca agtggtcctg 2100
tcgaagtatt tatcactgag actccgagtc agcccaactc ccaccccatc cagtggaatg 2160
caccacagcc atctcacatt tccaagtaca ttctcaggtg gagacctaaa aattctgtag 2220
gccgttggaa ggaagctacc ataccaggcc acttaaactc ctacaccatc aaaggcctga 2280
agcctggtgt ggtatacgag ggccagctca tcagcatcca gcagtacggc caccaagaag 2340
tgactcgctt tgacttcacc accaccagca ccagcacacc tgtgaccagc aacaccgtga 2400
caggagagac gactcccttt tctcctcttg tggccacttc tgaatctgtg accgaaatca 2460
cagccagtag ctttgtggtc tcctgggtct cagcttccga caccgtgtcg ggattccggg 2520
tggaatatga gctgagtgag gagggagatg agccacagta cctggatctt ccaagcacag 2580
ccacttctgt gaacatccct gacctgcttc ctggccgaaa atacattgta aatgtctatc 2640
agatatctga ggatggggag cagagtttga tcctgtctac ttcacaaaca acagcgcctg 2700
atgcccctcc tgacccgact gtggaccaag ttgatgacac ctcaattgtt gttcgctgga 2760
gcagacccca ggctcccatc acagggtaca gaatagtcta ttcgccatca gtagaaggta 2820
gcagcacaga actcaacctt cctgaaactg caaactccgt caccctcagt gacttgcaac 2880
ctggtgttca gtataacatc actatctatg ctgtggaaga aaatcaagaa agtacacctg 2940
ttgtcattca acaagaaacc actggcaccc cacgctcaga tacagtgccc tctcccaggg 3000
acctgcagtt tgtggaagtg acagacgtga aggtcaccat catgtggaca ccgcctgaga 3060
gtgcagtgac cggctaccgt gtggatgtga tccccgtcaa cctgcctggc gagcacgggc 3120
agaggctgcc catcagcagg aacacctttg cagaagtcac cgggctgtcc cctggggtca 3180
cctattactt caaagtcttt gcagtgagcc atgggaggga gagcaagcct ctgactgctc 3240
aacagacaac caaactggat gctcccacta acctccagtt tgtcaatgaa actgattcta 3300
ctgtcctggt gagatggact ccacctcggg cccagataac aggataccga ctgaccgtgg 3360
gccttacccg aagaggccag cccaggcagt acaatgtggg tccctctgtc tccaagtacc 3420
ccctgaggaa tctgcagcct gcatctgagt acaccgtatc cctcgtggcc ataaagggca 3480
accaagagag ccccaaagcc actggagtct ttaccacact gcagcctggg agctctattc 3540
caccttacaa caccgaggtg actgagacca ccattgtgat cacatggacg cctgctccaa 3600
gaattggttt taagctgggt gtacgaccaa gccagggagg agaggcacca cgagaagtga 3660
cttcagactc aggaagcatc gttgtgtccg gcttgactcc aggagtagaa tacgtctaca 3720
ccatccaagt cctgagagat ggacaggaaa gagatgcgcc aattgtaaac aaagtggtga 3780
caccattgtc tccaccaaca aacttgcatc tggaggcaaa ccctgacact ggagtgctca 3840
cagtctcctg ggagaggagc accaccccag acattactgg ttatagaatt accacaaccc 3900
ctacaaacgg ccagcaggga aattctttgg aagaagtggt ccatgctgat cagagctcct 3960
gcacttttga taacctgagt cccggcctgg agtacaatgt cagtgtttac actgtcaagg 4020
atgacaagga aagtgtccct atctctgata ccatcatccc agctgttcct cctcccactg 4080
acctgcgatt caccaacatt ggtccagaca ccatgcgtgt cacctgggct ccacccccat 4140
ccattgattt aaccaacttc ctggtgcgtt actcacctgt gaaaaatgag gaagatgttg 4200
cagagttgtc aatttctcct tcagacaatg cagtggtctt aacaaatctc ctgcctggta 4260
cagaatatgt agtgagtgtc tccagtgtct acgaacaaca tgagagcaca cctcttagag 4320
gaagacagaa aacaggtctt gattccccaa ctggcattga cttttctgat attactgcca 4380
actcttttac tgtgcactgg attgctcctc gagccaccat cactggctac aggatccgcc 4440
atcatcccga gcacttcagt gggagacctc gagaagatcg ggtgccccac tctcggaatt 4500
ccatcaccct caccaacctc actccaggca cagagtatgt ggtcagcatc gttgctctta 4560
atggcagaga ggaaagtccc ttattgattg gccaacaatc aacagtttct gatgttccga 4620
gggacctgga agttgttgct gcgaccccca ccagcctact gatcagctgg gatgctcctg 4680
ctgtcacagt gagatattac aggatcactt acggagaaac aggaggaaat agccctgtcc 4740
aggagttcac tgtgcctggg agcaagtcta cagctaccat cagcggcctt aaacctggag 4800
ttgattatac catcactgtg tatgctgtca ctggccgtgg agacagcccc gcaagcagca 4860
agccaatttc cattaattac cgaacagaaa ttgacaaacc atcccagatg caagtgaccg 4920
atgttcagga caacagcatt agtgtcaagt ggctgccttc aagttcccct gttactggtt 4980
acagagtaac caccactccc aaaaatggac caggaccaac aaaaactaaa actgcaggtc 5040
cagatcaaac agaaatgact attgaaggct tgcagcccac agtggagtat gtggttagtg 5100
tctatgctca gaatccaagc ggagagagtc agcctctggt tcagactgca gtaaccacta 5160
ttcctgcacc aactgacctg aagttcactc aggtcacacc cacaagcctg agcgcccagt 5220
ggacaccacc caatgttcag ctcactggat atcgagtgcg ggtgaccccc aaggagaaga 5280
ccggaccaat gaaagaaatc aaccttgctc ctgacagctc atccgtggtt gtatcaggac 5340
ttatggtggc caccaaatat gaagtgagtg tctatgctct taaggacact ttgacaagca 5400
gaccagctca gggagttgtc accactctgg agaatgtcag cccaccaaga agggctcgtg 5460
tgacagatgc tactgagacc accatcacca ttagctggag aaccaagact gagacgatca 5520
ctggcttcca agttgatgcc gttccagcca atggccagac tccaatccag agaaccatca 5580
agccagatgt cagaagctac accatcacag gtttacaacc aggcactgac tacaagatct 5640
acctgtacac cttgaatgac aatgctcgga gctcccctgt ggtcatcgac gcctccactg 5700
ccattgatgc accatccaac ctgcgtttcc tggccaccac acccaattcc ttgctggtat 5760
catggcagcc gccacgtgcc aggattaccg gctacatcat caagtatgag aagcctgggt 5820
ctcctcccag agaagtggtc cctcggcccc gccctggtgt cacagaggct actattactg 5880
gcctggaacc gggaaccgaa tatacaattt atgtcattgc cctgaagaat aatcagaaga 5940
gcgagcccct gattggaagg aaaaagacag acgagcttcc ccaactggta acccttccac 6000
accccaatct tcatggacca gagatcttgg atgttccttc cacagttcaa aagacccctt 6060
tcgtcaccca ccctgggtat gacactggaa atggtattca gcttcctggc acttctggtc 6120
agcaacccag tgttgggcaa caaatgatct ttgaggaaca tggttttagg cggaccacac 6180
cgcccacaac ggccaccccc ataaggcata ggccaagacc atacccgccg aatgtaggac 6240
aagaagctct ctctcagaca accatctcat gggccccatt ccaggacact tctgagtaca 6300
tcatttcatg tcatcctgtt ggcactgatg aagaaccctt acagttcagg gttcctggaa 6360
cttctaccag tgccactctg acaggcctca ccagaggtgc cacctacaac atcatagtgg 6420
aggcactgaa agaccagcag aggcataagg ttcgggaaga ggttgttacc gtgggcaact 6480
ctgtcaacga aggcttgaac caacctacgg atgactcgtg ctttgacccc tacacagttt 6540
cccattatgc cgttggagat gagtgggaac gaatgtctga atcaggcttt aaactgttgt 6600
gccagtgctt aggctttgga agtggtcatt tcagatgtga ttcatctaga tggtgccatg 6660
acaatggtgt gaactacaag attggagaga agtgggaccg tcagggagaa aatggccaga 6720
tgatgagctg cacatgtctt gggaacggaa aaggagaatt caagtgtgac cctcatgagg 6780
caacgtgtta cgatgatggg aagacatacc acgtaggaga acagtggcag aaggaatatc 6840
tcggtgccat ttgctcctgc acatgctttg gaggccagcg gggctggcgc tgtgacaact 6900
gccgcagacc tgggggtgaa cccagtcccg aaggcactac tggccagtcc tacaaccagt 6960
attctcagag ataccatcag agaacaaaca ctaatgttaa ttgcccaatt gagtgcttca 7020
tgcctttaga tgtacaggct gacagagaag attcccgaga gtaaatcatc tttccaatcc 7080
agaggaacaa gcatgtctct ctgccaagat ccatctaaac tggagtgatg ttagcagacc 7140
cagcttagag ttcttctttc tttcttaagc cctttgctct ggaggaagtt ctccagcttc 7200
agctcaactc acagcttctc caagcatcac cctgggagtt tcctgagggt tttctcataa 7260
atgagggctg cacattgcct gttctgcttc gaagtattca ataccgctca gtattttaaa 7320
tgaagtgatt ctaagatttg gtttgggatc aataggaaag catatgcagc caaccaagat 7380
gcaaatgttt tgaaatgata tgaccaaaat tttaagtagg aaagtcaccc aaacacttct 7440
gctttcactt aagtgtctgg cccgcaatac tgtaggaaca agcatgatct tgttactgtg 7500
atattttaaa tatccacagt actcactttt tccaaatgat cctagtaatt gcctagaaat 7560
atctttctct tacctgttat ttatcaattt ttcccagtat ttttatacgg aaaaaattgt 7620
attgaaaaca cttagtatgc agttgataag aggaatttgg tataattatg gtgggtgatt 7680
attttttata ctgtatgtgc caaagcttta ctactgtgga aagacaactg ttttaataaa 7740
agatttacat tcc 7753
<210> 2
<211> 2265
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
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Leu Gly Thr Ala Val Pro Ser Thr Gly Ala Ser Lys Ser Lys Arg Gln
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Lys Pro Gly Cys Tyr Asp Asn Gly Lys His Tyr Gln Ile Asn Gln Gln
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Gly Ser Arg Gly Phe Asn Cys Glu Ser Lys Pro Glu Ala Glu Glu Thr
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115 120 125
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130 135 140
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210 215 220
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Arg Pro Tyr Pro Pro Asn Val Gly Gln Glu Ala Leu Ser Gln Thr
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<210> 3
<211> 2192
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
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ttaggggtcc ggggcccggg ctgctgctgc tggccgtcca gtgcctgggg acagcggtgc 120
cctccacggg agcctcgaag agcaagaggc aggctcagca aatggttcag ccccagtccc 180
cggtggctgt cagtcaaagc aagcccggtt gttatgacaa tggaaaacac tatcagataa 240
atcaacagtg ggagcggacc tacctaggca atgcgttggt ttgtacttgt tatggaggaa 300
gccgaggttt taactgcgag agtaaacctg aagctgaaga gacttgcttt gacaagtaca 360
ctgggaacac ttaccgagtg ggtgacactt atgagcgtcc taaagactcc atgatctggg 420
actgtacctg catcggggct gggcgaggga gaataagctg taccatcgca aaccgctgcc 480
atgaaggggg tcagtcctac aagattggtg acacctggag gagaccacat gagactggtg 540
gttacatgtt agagtgtgtg tgtcttggta atggaaaagg agaatggacc tgcaagccca 600
tagctgagaa gtgttttgat catgctgctg ggacttccta tgtggtcgga gaaacgtggg 660
agaagcccta ccaaggctgg atgatggtag attgtacttg cctgggagaa ggcagcggac 720
gcatcacttg cacttctaga aatagatgca acgatcagga cacaaggaca tcctatagaa 780
ttggagacac ctggcgcaag aaggataatc gaggaaacct gctccagtgc atctgcacag 840
gcaacggccg aggagagtgg aagtgtgaga ggcacacctc tgtgcagacc acatcgagcg 900
gatctggccc cttcaccgat gttcgtgcag ctgtttacca accgcagcct cacccccagc 960
ctcctcccta tggccactgt gtcacagaca gtggtgtggt ctactctgtg gggatgcagt 1020
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aggattcaga gactgggacg ttttatcaaa ttggagattc atgggagaag tatgtgcatg 1800
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ttctcaggtg gagacctgtg agtatcccac ccagaaacct tggatactga gtctcctaat 2040
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<210> 4
<211> 657
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
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gtgaaaattg aggagtctgg aggaggcttg gtgcaacctg gaggatccat gaaactctcc 120
tgtgttgcct ctggattcac tttcagtaac gactggatga actgggtccg ccagtctcca 180
gagaaggggc ttgagtgggt tgctgaaatt agaatgaaat ctgataatta tgcaacatat 240
tatgcggagt ctgtgaaagg gaggttcacc atctcaagag atgattccaa aaatagtgtc 300
tacctgcaaa tgaacaattt aagagctgaa gacaatggca tttattactg taccagttgg 360
gactactggg gccaaggcac cactctcaca gtctcctcag ccaaaacgac acccccatct 420
gtctatccac tggcccctgg atctgctgcc caaactaact ccatggtgac cctgggatgc 480
ctggtcaagg gctatttccc tgagccagtg acagtgacct ggaactctgg atccctgtcc 540
agcggtgtgc acaccttccc agctgtcctg cagtctgacc tctacactct gagcagctca 600
gtgactgtcc cctccagcac ctggcccagc gagaccgtca cctgcaacgt tgcccacccg 660
gccagcagca ccaaggtgga caagaaaatt gtgcccaggg attgtggttg taagccttgc 720
atatgtacag tcccagaagt atcatctgtc ttcatcttcc ccccaaagcc caaggatgtg 780
ctcaccatta ctctgactcc taaggtcacg tgtgttgtgg tagacatcag caaggatgat 840
cccgaggtcc agttcagctg gtttgtagat gatgtggagg tgcacacagc tcagacgcaa 900
ccccgggagg agcagttcaa cagcactttc cgctcagtca gtgaacttcc catcatgcac 960
caggactggc tcaatggcaa ggagttcaaa tgcagggtca acagtgcagc tttccctgcc 1020
cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa ggcagaccga aggctccaca ggtgtacacc 1080
attccacctc ccaaggagca gatggccaag gataaagtca gtctgacctg catgataaca 1140
gacttcttcc ctgaagacat tactgtggag tggcagtgga atgggcagcc agcggagaac 1200
tacaagaaca ctcagcccat catggacaca gatggctctt acttcgtcta cagcaagctc 1260
aatgtgcaga agagcaactg ggaggcagga aatactttca cctgctctgt gttacatgag 1320
ggcctgcaca accaccatac tgagaagagc ctctcccact ctcctggtaa atga 1374
<210> 6
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1G5.3重链的蛋白质序列
<400> 6
Met Tyr Leu Gly Leu Asn Cys Val Phe Ile Val Phe Leu Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Ser Glu Val Lys Ile Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Asp Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Met Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
85 90 95
Lys Asn Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Asn
100 105 110
Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Ser Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
115 120 125
Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu
130 135 140
Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys
145 150 155 160
Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser
165 170 175
Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
180 185 190
Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp
195 200 205
Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr
210 215 220
Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys
225 230 235 240
Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
245 250 255
Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val
260 265 270
Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe
275 280 285
Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu
290 295 300
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His
305 310 315 320
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala
325 330 335
Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg
340 345 350
Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met
355 360 365
Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro
370 375 380
Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn
385 390 395 400
Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val
405 410 415
Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr
420 425 430
Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu
435 440 445
Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 7
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1G5.3轻链的DNA序列
<400> 7
atggattcac aggcccaggt tcttatattg ctgctgctat gggtatctgg tacctgtggg 60
gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt caacaggaga gaaggtcact 120
atgaactgca gatccagtca ctatctgctc aacagtagaa cccgaaagaa cttcttgtct 180
tggtaccaac agaaaccagg acagtctcct caactgctga tctactgggc atccactagg 240
tattctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 300
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaaacaatc ttataatctt 360
cacacgttcg gaggggggac caagttggaa ataaagcggg ctgatgctgc accaactgta 420
tccatcttcc caccatccag tgagcagtta acatctggag gtgcctcagt cgtgtgcttc 480
ttgaacaact tctaccccaa agacatcaat gtcaagtgga agattgatgg cagtgaacga 540
caaaatggcg tcctgaacag ttggactgat caggacagca aagacagcac ctacagcatg 600
agcagcaccc tcacgttgac caaggacgag tatgaacgac ataacagcta tacctgtgag 660
gccactcaca agacatcaac ttcacccatt gtcaagagct tcaacaggaa tgagtgttag 720
<210> 8
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1G5.3轻链的蛋白质序列
<400> 8
Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Ile Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser
1 5 10 15
Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Thr Gly Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Arg Ser Ser His Tyr
35 40 45
Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg
65 70 75 80
Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Asn Leu His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro
130 135 140
Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe
145 150 155 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp
165 170 175
Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp
180 185 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys
195 200 205
Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys
210 215 220
Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230 235
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 9
Val Ser Ile Pro Pro Arg Asn Leu Gly Tyr Cys
1 5 10
<210> 10
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> His-MSF
<400> 10
Met Gly Ser Asp Lys Ile His His His His His His His His His His
1 5 10 15
Gly Val Trp Lys Cys Asp Pro Val Asp Gln Cys Gln Asp Ser Glu Thr
20 25 30
Gly Thr Phe Tyr Gln Ile Gly Asp Ser Trp Glu Lys Tyr Val His Gly
35 40 45
Val Arg Tyr Gln Cys Tyr Cys Tyr Gly Arg Gly Ile Gly Glu Trp His
50 55 60
Cys Gln Pro Leu Gln Thr Tyr Pro Ser Ser Ser Gly Pro Val Glu Val
65 70 75 80
Phe Ile Thr Glu Thr Pro Ser Gln Pro Asn Ser His Pro Ile Gln Trp
85 90 95
Asn Ala Pro Gln Pro Ser His Ile Ser Lys Tyr Ile Leu Arg Trp Arg
100 105 110
Pro Val Ser Ile Pro Pro Arg Asn Leu Gly Tyr
115 120
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 11
Val Ser Ile Pro Pro Arg Asn Leu Gly Tyr
1 5 10
<210> 12
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 12
Trp Asp Tyr
1
<210> 13
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 13
Glu Ile Arg Met Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 14
Asn Asp Trp Met Asn
1 5
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
<400> 15
Gln Ser Tyr Asn Leu His Thr
1 5
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 16
Trp Ala Ser Thr Arg Tyr Ser
1 5
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 17
Arg Ser Ser His Tyr Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu
1 5 10 15
Ser
<210> 18
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区
<400> 18
Glu Val Lys Ile Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asp
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Met Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Asn Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Ser Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 19
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 19
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Thr Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Arg Ser Ser His Tyr Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Tyr Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 20
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码抗体的核酸分子
<400> 20
gaagtgaaaa ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc 60
tcctgtgttg cctctggatt cactttcagt aacgactgga tgaactgggt ccgccagtct 120
ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctgaa attagaatga aatctgataa ttatgcaaca 180
tattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaaatagt 240
gtctacctgc aaatgaacaa tttaagagct gaagacaatg gcatttatta ctgtaccagt 300
tgggactact ggggccaagg caccactctc acagtctcct ca 342
<210> 21
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码抗体的核酸分子
<400> 21
gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt caacaggaga gaaggtcact 60
atgaactgca gatccagtca ctatctgctc aacagtagaa cccgaaagaa cttcttgtct 120
tggtaccaac agaaaccagg acagtctcct caactgctga tctactgggc atccactagg 180
tattctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaaacaatc ttataatctt 300
cacacgttcg gaggggggac caagttggaa ataaag 336