一种遗传性肥厚型心肌病的通用基因检测文库的构建方法及其试剂盒
阅读说明:本技术 一种遗传性肥厚型心肌病的通用基因检测文库的构建方法及其试剂盒 (Construction method of universal gene detection library for hereditary hypertrophic cardiomyopathy and kit thereof ) 是由 杨莹莹 赵立明 于 2021-08-02 设计创作,主要内容包括:本发明属于基因突变检测技术领域,公开了一种遗传性肥厚型心肌病的通用基因检测文库的构建方法及其试剂盒。本申请的技术方式是采用多重PCR扩增子建库技术,对肥厚型心肌病检出率最高的5个致病基因MYH7、MYBPC3、TNNT2、TNNI3、TPM1突变进行捕获建库,捕获区域包括5个基因的全部外显子区域及其上下游各20bp碱基序列,能够兼容于多种测序平台,同时具有建库步骤简洁、成本节约、应用范围广和显著降低了检测数据量等诸多优势。(The invention belongs to the technical field of gene mutation detection, and discloses a construction method of a universal gene detection library for genetic hypertrophic cardiomyopathy and a kit thereof. The technical mode of the application is that a multiple PCR amplicon library building technology is adopted, 5 disease-causing genes MYH7, MYBPC3, TNNT2, TNNI3 and TPM1 with the highest detection rate of hypertrophic cardiomyopathy are captured and built, a capture region comprises all exon regions of 5 genes and base sequences of 20bp on the upstream and the downstream of the exon regions, the library building method can be compatible with various sequencing platforms, and meanwhile, the library building method has the advantages of being concise in library building steps, saving in cost, wide in application range, remarkably reducing detection data quantity and the like.)
技术领域
本发明属于基因突变检测技术领域,具体涉及一种遗传性肥厚型心肌病的通用基因检测文库的构建方法及其试剂盒。
背景技术
肥厚型心肌病HCM是一种以心肌肥厚为特征的心肌疾病,主要表现为左心室壁增厚,通常指二维超声心动图测量的室间隔或左心室壁厚度≥15mm,或者有明确家族史者厚度≥13mm,通常不伴有左心室腔的扩大,需排除负荷增加如高血压、主动脉瓣狭窄和先天性主动脉瓣下隔膜等引起的左心室壁增厚。HCM全世界患病率约为1/500,中国患病率80/10万,粗略估算中国成人HCM患者超过100万。HCM是青少年和运动员猝死的主要原因之一。
绝大部分HCM呈常染色体显性遗传,约60%的成年HCM患者可检测到明确的致病基因突变,目前已发现27个致病基因与HCM有关,其中大部分突变集中在肌小节蛋白编码基因上,包括粗肌丝,中间丝,细肌丝,等。其中,粗肌丝肌球蛋白重链7(MYH7)基因在临床诊断为HCM患者中检出频率为15~30%,中间丝心脏型肌球蛋白结合蛋白C(MYBPC3)约15~30%,细肌丝心肌肌钙蛋白T2(TNNT2)在HCM患者中检出率为1~5%,细肌丝心肌肌钙蛋白I3(TNNI3)在HCM患者中检出率为1~5%,细肌丝原肌球蛋白1(TPM1)在HCM患者中检出率为1~5%。
目前普遍应用的肥厚型心肌病检测方法主要为全外显子测序和液相捕获测序法。这两种方法均为探针捕获建库与二代测序结合的方法,该方法存在以下缺点:实验操作繁琐、检测周期长、成本高、GC富集区的存在等问题,难以满足临床检测要求。
目前也有已公开专利利用PCR方法来检测肥厚型心肌病基因突变,但是该专利所用的多重PCR为LMPCR,但是该专利所用的LMPCR在进行PCR反应之前,依然需要常规二代测序的超声打断,杂交捕获进行文库制备,依然存在有杂交捕获建库的缺点,因此在使用上具有较大局限性。
因此,本领域需要可用于高灵敏度、高通量、低成本检测肥厚型心肌病相关基因突变的方法和试剂盒。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题,本发明目的在于提供一种遗传性肥厚型心肌病的通用基因检测文库的构建方法及其试剂盒。
本发明所采用的技术方案为:一种遗传性肥厚型心肌病的通用基因检测文库的构建方法,包括如下步骤:
S1、第一轮多重PCR反应:包括T1反应管体系、T2反应管体系和T3反应管体系;T1反应管体系包括第一引物池和第一反应液;T2反应管体系包括第二引物池和第二反应液;T3反应管体系包括第三引物池和第三反应液;
所述第一引物池包括58对引物,58对引物的上下游引物的核苷酸序列依次如SEQID NO.1-SEQ ID NO.116所示;
所述第二引物池包括57对引物,57对引物的上下游引物的核苷酸序列依次如SEQID NO.117-SEQ ID NO.230所示;
所述第三引物池包括3对引物,3对引物的上下游引物的核苷酸序列依次如SEQ IDNO.231-SEQ ID NO.236所示;
S2、多重PCR反应合并:选取T1反应管体系运行PCR扩增反应,获得反应产物A;T2反应管体系运行PCR扩增反应,获得反应产物B;选取T3反应管体系运行PCR扩增反应,获得反应产物C;将上述反应产物A、反应产物B与反应产物C混合合并,获得合并产物;
S3、磁珠纯化合并产物;
S4、第二轮序列PCR反应、第二轮磁珠纯化及文库浓度测量与质检,完成文库构建。
作为优选地,所述T1反应管体系体积为30-40μL;
所述T2反应管体系体积为30-40μL;
所述T3反应管体系体积为25-30μL。
作为优选地,所述第二轮接头序列PCR反应体系体积为30-40μL。
作为优选地,所述多重PCR反应合并中,反应产物A、反应产物B与反应产物C混合合并体积分别为11.5μL、13.5μL和5μL。
作为优选地,所述第一反应液包括Enhancer buffer NB缓冲液、Enhancer bufferM缓冲液、IGT-EM808酶混合液、gDNA和ddH2O。
作为优选地,第二反应液包括Enhancer buffer NB缓冲液、Enhancer buffer M缓冲液、IGT-EM808酶混合液、gDNA和ddH2O。
作为优选地,第三反应液包括IGT-GC Buffer缓冲液、IGT-GC Enhancer缓冲液、IGT-GC dNTP、Enhancer buffer NB缓冲液、IGT-GC Polymerase聚合酶、gDNA和ddH2O。
作为优选地,所述磁珠纯化合并产物中,磁珠纯化处理流程为:向合并产物加入磁珠,混匀、室温孵育、移除上清、加入YF buffer B混匀、二次室温孵育、移除上清、加入乙醇溶液,静置、加入Nuclease-free water,重悬磁珠,室温静置、吸取上清液,转移到新的PCR管内,管内上清液为合并后的多重PCR产物。
作为优选地,所述第二轮磁珠纯化处理流程为:向PCR反应体系内加入磁珠,混匀、室温孵育、移除上清、加入YF buffer B,混匀、二次室温孵育、静置、加入Nuclease-freewater或1×TE buffer(pH 8.0),混匀、重悬磁珠、吸取上清液,转移到新的PCR管中,管中上清为制备好的多重PCR文库。
一种遗传性肥厚型心肌病的通用基因检测文库的构建试剂盒,所述试剂盒包含上述权利要求1-9任一所述的遗传性肥厚型心肌病的通用基因检测文库的构建方法中的T1反应管体系、T2反应管体系和T3反应管体系。
本发明的有益效果为:
本发明提供了一种遗传性肥厚型心肌病的通用基因检测文库的构建方法及其试剂盒。本申请的技术方式是采用多重PCR扩增子建库技术,对肥厚型心肌病检出率最高的5个致病基因MYH7、MYBPC3、TNNT2、TNNI3、TPM1突变进行捕获建库,捕获区域包括5个基因的全部外显子区域及其上下游各20bp碱基序列,能够兼容于多种测序平台,同时具有建库步骤简洁、成本节约和应用范围广等诸多优势。
上述该检测文库的构建方法,将整个流程简化,降低人力成本,降低检测数据量,降低成本。
附图说明
图1为实验例的Qsep 400全自动核酸蛋白分析系统质检文库结果示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。本领域技术人员将会理解,下列所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例,仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。所用试剂均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例:
本发明专利采用艾吉泰康MμLtipSeq多重扩增子捕获技术,采用两步PCR扩增方法来完成目标区域扩增和建库。该技术能够在保证扩增均一性的前提下,对SNP、Indel等几千甚至上万个突变位点进行快速靶向线性扩增后,使用主流测序平台进行测序与深度分析。
本发明包含多个扩增子,由3个反应管组成,分别为T1,T2,T3(3个)。试剂盒采用两轮PCR反应进行文库构建,具有文库构建周期短,比对率高,均一性好,重复性好,操作简便等优点,此外,该发明还可以采用多种样本进行文库构建,如唾液gDNA,血液gDNA等。
本试剂盒文库构建流程共分为几个大步骤,分别为第1轮多重PCR反应,产物合并,磁珠纯化合并产物,第二轮接头序列PCR反应,磁珠纯化,浓度测量与质检。
一、第一轮多重PCR反应
(1)多重PCR反应体系
第一轮多重PCR反应分为3个反应管,使用的多重引物分别为Primer pool T1,Primer pool T2,Primer pool T3。
T1和T2反应管体系(30μL):
备注:gDNA的起始量为50ng/管;DNA的浓度为Qubit(Life Technologies)的定量结果。
T3管反应体系(25μL):
Reagent(组分)
Volume(体积,μL)
IGT-GC Buffer缓冲液
5
IGT-GC Enhancer缓冲液
5
IGT-GC dNTP(10nM)
0.5
Primer pool T3引物池
5
Enhancer buffer NB(1N)缓冲液
3.5
IGT-GC Polymerase聚合酶
0.1
gDNA
x
ddH<sub>2</sub>O
5.9-x
备注:gDNA的起始量为50ng/管;DNA的浓度为Qubit(Life Technologies)的定量结果。
(2)多重PCR反应条件
T1/T2运行PCR仪程序:
95℃for 3min 30s、98℃for 20s,循环18次;60℃for 4min,72℃for 5min。
T3运行PCR仪程序:
95℃for 3min 30s、98℃for 20s,循环20次;60℃for 2min、72℃for 5min。
二、第1轮PCR反应产物合并
第1轮PCR反应结束后,3个反应管的PCR产物按照下表进行合并,总体积为30μL。
反应管编号
T1
T2
T3
混合体积
11.5μL
13.5μL
5μL
三、磁珠纯化合并产物
(1)向30μL PCR合并产物加入27μL室温平衡后的AMPure XP磁珠,用移液器轻缓吸打混匀20次;
(2)室温孵育5min后,将PCR管置于DynaMag-96Side磁力架上3min;
(3)彻底移除上清,将PCR管从磁力架取下,向管内加入50μL YF buffer B用移液器轻缓吸打混匀20次;
(4)室温孵育5min后,将PCR管置于DynaMag-96Side磁力架上3min;
(5)移除上清,PCR管继续放置在磁力架上,向管内加入180μL 80%乙醇溶液,静置30s;
(6)移除上清,PCR管继续放置在磁力架上,向管内加入180μL 80%乙醇溶液,静置30s后彻底移除上清(建议使用10μL移液器移除底部残留乙醇溶液);
(7)室温静置3min,使残留乙醇彻底挥发;
(8)将PCR管从磁力架取下,加入24μL Nuclease-free water,移液器轻轻吸打重悬磁珠,避免产生气泡,室温静置2min;
(9)将PCR管重新置于磁力架上,静置3min;
(10)用移液器吸取13.5μL上清液,转移到新的200μL PCR管内,管内上清液为合并后的多重PCR产物。
四、第2轮接头序列PCR反应
(1)反应体系
Reagent(组分)
Volume(体积,μL)
PCR product mixture
13.5
Enhancer buffer M
2.5
ddH<sub>2</sub>O
2
IGT-I5 Index(10uM)
1
IGT-I7 Index(10uM)
1
IGT-EM808polymerase mixture
10
备注:PCR product mixture为上一步纯化后的多重PCR产物。
(2)反应条件
运行PCR仪程序:
95℃for 3min 30s、98℃for 20s,循环9次;60℃for 1min、72℃for 5min。
五、第2轮磁珠纯化
(1)向30μL PCR反应体系内加入27μL室温平衡后的AMPure XP磁珠,用移液器轻缓吸打混匀20次;
(2)室温孵育5min后,将PCR管置于DynaMag-96Side磁力架上3min;
(3)彻底移除上清,将PCR管从磁力架取下,向管内加入50μL YF buffer B,用移液器轻缓吸打混匀20次;
(4)室温孵育5min后,将PCR管置于DynaMag-96Side磁力架上3min;
(5)移除上清,PCR管继续放置在磁力架上,向管内加入180μL 80%乙醇溶液,静置30s;
(6)移除上清,PCR管继续放置在磁力架上,向管内加入180μL 80%乙醇溶液,静置30s后彻底移除上清;
(7)室温静置3min,使残留乙醇彻底挥发;
(8)将离心管从磁力架取下,加入24μL Nuclease-free water或1×TE buffer(pH8.0),用移液器轻缓吸打混匀20次,重悬磁珠,避免产生气泡,室温静置2min;
(9)将PCR管重新置于磁力架上,静置3min;
(10)用移液器吸取20μL上清液,转移到新的PCR管中,管中上清为制备好的多重PCR文库。
六、文库定量
取2μl文库使用Qubit 3.0Fluorometer(Qubit dsDNA HS Assay Kit)进行文库浓度测定,记录文库浓度。
七、文库质量检测
如图1所示,取1μl文库样本使用Qsep400全自动核酸蛋白分析系统进行文库片段长度和纯度测量。其中,横坐标为时间,纵坐标为相对荧光单位,即为采集到的信号强度。
T1引物池引物序列列表:
T2引物池引物序列列表:
T3引物池引物序列列表:
实验例
1检测样本:所检测的样本来源于某医院采集完成后的某志愿者的离体血液样本。
2检测方法
DNA提取:按照常规方法提取待测样本的DNA作为模板
PCR扩增:第一轮扩增反应体系同上文中所述第一轮PCR反应扩增体系;
第一轮PCR反应扩增条件同上文所述第一轮PCR反应扩增条件;
第一轮PCR扩增后产物纯化步骤同上文所述第一轮PCR扩增后产物纯化;
第一轮PCR反应之后3管PCR产物合并如上文所述第一轮PCR产物合并;
第二轮PCR扩增体系同上文所述第二轮PCR反应扩增体系;
第二轮PCR反应扩增条件同上文所述第二轮PCR反应扩增条件;
第二轮PCR扩增后产物纯化步骤同上文所述第一轮PCR扩增后产物纯化;
对第二轮纯化后的文库进行定量,如上文所述文库定量步骤。
对第二轮纯化后的文库进行质量检测,如上文所述文库质量检测。
文库质量检测结果如图1所示,取1μL文库样本使用Qsep400全自动核酸蛋白分析系统进行文库片段长度和纯度测量,正常文库的靶片段分布区间在280bp–420bp之间。
3检测结果:
使用本试剂盒构建出的合格文库,在illumina公司的Nova 6000(NEXTSeq 550)测序平台上的实测数据如下,将文库上机测序,并进行生物信息学分析。首先对测序数据进行质量评估,对经过评估后的测序数据量进行统计,并进行参考序列比对和depth数据统计,最终结果如下表所示:
备注:Raw base(Mb):测序原始数据量大小;
QCrate(%):质控率;
Total reads mapping rate(%):总读长匹配效率;
Total reads capture rate(%):总读长捕获效率;
Coverage rate(%):覆盖度;
Target mean depth:目标区域平均测序深度;
T 30X coverage rate(%):测序深度30X以上覆盖度;
T 20X coverage rate(%):测序深度30X以上覆盖度;
采用上述方法对全外显子测序阳性的2例样本进行测序,验证该方法准确性。样本检测结果如下表所示:
样本编号
检测结果
突变位点
1
阳性
rs11570112
2
阳性
rs368770848,rs186964570
本发明不局限于上述可选的实施方式,任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品,均属于本发明的保护范围。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制,本领域的普通技术人员应当理解,在不背离本发明的范围下,可对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或对其中部分或者全部技术特征进行等同替换,与此同时这些修改或者替换,并不会使相应的技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 北京华瑞康源生物科技发展有限公司
<120> 一种遗传性肥厚型心肌病的通用基因检测文库的构建方法及其试剂盒
<160> 236
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctccccatt tccaaacagg a 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taccctgcct gtgtctccat 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tattaccgga cccagtgaac ca 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aggagggccc tttcttactg g 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaagcagagt aaactggcca ga 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgtcaccttc tccctatgca ca 22
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cagtgctgga agattctcta ggaag 25
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<211> 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agtgtttcct gttgctctca gg 22
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cacagctact tctacccaga atcc 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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cgctcttccc atctcccag 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cttccctccc tctctttacc ttatt 25
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gtctccttta agggtgcgga g 21
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<211> 17
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
tggacaggag gcagataagc a 21
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
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<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
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<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tggttgtcac tgtggctatg g 21
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
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<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 140
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 145
ggggtccaag ccctaaagc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 146
tctgcccaga agaggcca 18
<210> 147
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 147
gccatctcct ccccaggtt 19
<210> 148
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 148
cacagggatt atcatggggc g 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 149
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 150
tgcagtcttg cccccgg 17
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 151
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<210> 152
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 152
tcctgctcct aatccctttc ca 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 153
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 154
gtcatgaatg ggcaagtctg tg 22
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 155
ccttgtgcct tctagggctc t 21
<210> 156
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 156
agcaggacac tccccaagc 19
<210> 157
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 157
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 158
tggaggggtc tctggttagt g 21
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 159
tacttgttgc tggcgctga 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 160
tgaggggatg catagaaagt gc 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 161
cagtgaagaa gagtctggag tc 22
<210> 162
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 162
ccaataccat ctctccaagg actg 24
<210> 163
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 163
ggttctcaga ctcctggctt g 21
<210> 164
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 164
tgctaccttc tatgactgtg cc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 165
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 166
agcaagtgtg tgaggacttg ac 22
<210> 167
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 168
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 169
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccttttgagc tctgagcact ca 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aggggctgct attttgtcta tgg 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 236
gaagggcctg gcccaga 17
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