一种阻断受体结合的核糖体失活蛋白减毒改造的方法
阅读说明：本技术 一种阻断受体结合的核糖体失活蛋白减毒改造的方法 (Method for attenuating and modifying ribosome inactivating protein for blocking receptor binding ) 是由 刘梦铃 于 2020-04-14 设计创作，主要内容包括：本专利申请属于生物工程技术领域,具体公开了一种阻断受体结合的核糖体失活蛋白减毒改造的方法,A、预测结合位点,以分子对接软件预测核糖体失活蛋白与受体结合的部位和结合位点；B、根据A步骤中的预测结果,对结合位点的氨基酸残基进行突变改造；C、根据步骤B得出突变体基因进行密码子优化；D、将C步骤中优化的目标突变体全基因合成,并进行表达载体构建；E、检测,对D步骤中构建的目标突变体基因蛋白进行检测,通过毒性试验和荧光测试,检测其是否进入细胞,检测其是否表达。本方案创建的突变结合位点氨基酸残基的结构改造模式能显著阻断α-MMC进入细胞及其引发的细胞毒性,从而达到显著减毒效果。(The application belongs to the technical field of bioengineering, and particularly discloses a method for modifying attenuation of ribosome inactivating protein for blocking receptor binding, which comprises the steps of A, predicting binding sites and binding sites of the ribosome inactivating protein and the receptors by using molecular docking software, B, carrying out mutation modification on amino acid residues of the binding sites according to the prediction result in the step A, C, carrying out codon optimization on mutant genes obtained according to the step B, D, synthesizing all genes of target mutants optimized in the step C, constructing expression vectors, E, detecting the target mutant gene proteins constructed in the step D, detecting whether the target mutant gene proteins enter cells or not through toxicity tests and fluorescence tests, and detecting whether the target mutant gene proteins are expressed or not.)
技术领域：
本发明申请属于生物工程技术领域，更具体的说是涉及一种阻断受体结合的核糖体失活蛋白减毒改造的方法。
背景技术：
α-苦瓜素(α-Momorcharin，α-MMC)是从苦瓜籽中提取的一种I型核糖体失活蛋白，对肺癌、结肠癌、肝癌、上皮细胞癌、黑色素瘤、绒毛膜细胞癌、乳腺癌以及鼻咽癌等均具有很强的生长抑制作用，研究发现，其对乳腺癌的生长抑制效果优于临床一线抗乳腺癌药(如表阿霉素)，非常有潜力成为临床抗肿瘤治疗药物。但α-MMC在体内应用时却出现了较明显的组织细胞毒性，引起肝细胞、脑细胞和单核/巨噬细胞等细胞损伤，较严重的药物毒性已成为α-MMC类药物临床应用的障碍。目前，降低RIPs毒性的方法主要有2种：RIPs“免疫毒素”靶向治疗和聚乙二醇(PEG)修饰。“免疫毒素”方式虽然能通过减少给药剂量降低对正常细胞毒性，但其毒性依然较高，并且增加了来自抗体(Fv片段)的毒性以及“血管渗透综合征”等副作用。PEG修饰方式虽然可以明显降低α-MMC的毒性，但这种“糖链覆盖”模式在降低其毒性的同时，抗肿瘤活性也大大降低。因此，以上两种减毒改造依然不能较好地解决其毒性问题。
前期研究发现，LRP1受体介导是α-MMC进入细胞并引起细胞毒性的关键环节，不论是肿瘤细胞或是正常组织细胞，只要有LRP1受体的高分布，都可能是α-MMC的作用靶标。如果阻断α-MMC与LRP1的结合，如敲除α-MMC的受体结合部位或者突变其结合部位关键氨基酸残基，即可阻断其入胞，从而从根本上消除α-MMC的细胞毒性。当然，我们可以后期将这种“缺突体”(α-MMC活性肽)与肿瘤特异性载体连接从而将其导入到肿瘤细胞中。
α-MMC结构改造的前提是保证其药物活性不受影响。因此，突变α-MMC受体结合位点，需要预知结合部位与其糖苷酶活性中心的相对位置。α-MMC由8个α螺旋和10个β折叠组成，其活性中心由69～71位、83～85位、108～114位和155～163位几段氨基酸残基组成，根据其三级结构分析，该活性部位大致位于1～202位氨基酸残基和203位至C末端氨基酸残基的两大结构域之间的裂隙中，其中，189-192段是其活性中心的外缘。Glu160为最重要活性位点，Ile71、Gly109、Tyr111、Arg163、Trp192参与到催化活性中，Tyr70作为一个阀门，控制活性位点的开放和关闭。
而根据前期的生物信息学预测分析，α-MMC与LRP1结合的可能区域大概位于1-20位氨基酸残基的β1折叠和α1螺旋结构域。由于该结构域处于同一平面，LRP1受体蛋白的CR56 和CR17结合单元不需要发生诱导契合(构象变化)即可与其通过氢键形成稳定的结合。其结合氨基酸残基主要有8个，分布于1-20位氨基酸残基之间，其中，包含了关键结合位点赖氨酸(LYS19)。由于结合部位位于α-MMC的蛋白表面，背离活性中心的裂隙区，敲除该受体结合域或突变结合位点并不会影响其酶的活性。
发明内容
：针对上述不足，本发明的目的在于提供一种阻断受体结合的核糖体失活蛋白减毒改造的方法。
为了达到上述目的，本发明的基础方案为：
一种阻断受体结合的核糖体失活蛋白减毒改造的方法，包括以下步骤:
A、预测结合位点，以分子对接软件预测核糖体失活蛋白与受体结合的部位和结合位点；
B、根据A步骤中的预测结果，对结合位点的氨基酸残基进行突变改造；
C、根据步骤B得出突变体基因进行密码子优化；
D、将C步骤中优化的目标突变体全基因合成，并进行表达载体构建；
E、检测，对D步骤中构建的目标突变体基因蛋白进行检测，通过毒性试验和荧光测试，检测其是否进入细胞，检测其是否表达。
进一步，步骤A中选取的核糖体失活蛋白的基因可以选用α-苦瓜素、MAP30、β-苦瓜素、γ-苦瓜素、δ-苦瓜素，天花粉蛋白，美洲商陆蛋白，丝瓜毒蛋白以及肥皂草素等Ⅰ型核糖体失活蛋白以及Ⅱ型核糖体失活蛋白如蓖麻毒蛋白A链等基因中的任一一种。
进一步，步骤B中选取的待改造氨基酸为关键结合位点亚基对应氨基酸的任意组合。
进一步，阻断与受体结合的α-MMC减毒的结构改造也包含对受体结合部位的剪接和敲除方式。
进一步，步骤C中利用软件对突变体基因进行密码子优化；选取的优化软件MaxCodonTM Optimization Program(V13)对突变体基因成熟区进行表达密码子优化；本方案中其他同类表达密码子优化软件同样适用于本方案。
进一步，步骤D中全基因合成优化后的目标突变体全基因蛋白的原核表达载体为pET30a，其他原核表达载体以及真核表达载体和哺乳动物表达载体同样适用于本方案。
进一步，分子对接预测软件可选用Zdock，其他分子对接软件同样适用于本方案。
进一步，一种阻断受体结合的核糖体失活蛋白减毒改造的方法，包括以下步骤：
A、预测结合位点，以Zdock分子对接软件预测α-MMC蛋白与受体LRP-1的CR56和CR17 结合亚基进行蛋白-蛋白对接，预测受体结合部位和结合位点；
B、根据A步骤中的预测结果，选取关键结合位点亚基对应氨基酸的两种组合，分别命名为α-MMC*5和α-MMC*8；
C、利用MaxCodonTM Optimization Program(V13)优化α-MMC*5和α-MMC*8基因密码子；
D、全基因合成优化后的α-MMC*5和α-MMC*8基因序列，并与原核表达载体pET30a连接，构建相应α-MMC*5和α-MMC*8外源基因表达载体；
E、检测，以大肠杆菌系统表达α-MMC*5和α-MMC*8重组蛋白；纯化α-MMC*5和α-MMC*8重组蛋白，获得两种突变体α-MMC重组蛋白，通过毒性试验和荧光测试，检测其是否进入细胞，检测其是否表达。
技术效果：
本方案，构建了一种阻断受体结合以阻止对应基因蛋白进入细胞的方法，本方案通过对受体结合处关键位点亚基对应的氨基酸进行突变的方式，使得对应的基因蛋白在进入细胞时无法与对应的受体集合，进而阻止其进入细胞进行表达。本方案通过激光共聚焦显微镜术，观察到荧光素标记的突变体重组蛋白α-MMC*5和α-MMC*8在正常肝细胞内没有荧光，证明了突变α-MMC受体结合部位氨基酸能阻断其进入正常细胞。同时，进一步用CCK-8细胞毒性实验证明了重组突变体α-MMC*5和α-MMC*8对肝细胞没有明显的细胞毒性。实验验证了本发明创建的突变结合位点氨基酸残基的结构改造模式能显著阻断α-MMC进入细胞及其引发的细胞毒性，从而达到显著减毒效果。后期将通过肿瘤特异性载体靶向导入肿瘤细胞而抗肿瘤。
附图说明:
图1为本发明的α-MMC与LRP-1受体的CR56和CR17结合亚基进行蛋白-蛋白对接示意图一
图2为本发明的CR56和CR17形成稳定结合的构象进行结合模式分析示意图；
图3为本发明的α-MMC与LRP-1受体的CR56和CR17结合亚基进行蛋白-蛋白对接的示意流程及结果示意图；
图4是采用密码子优化软件MaxCodonTM Optimization Program(V13)对提供的α-MMC 蛋白氨基酸序列进行密码子优化后碱基序列示意图；
图5为采用密码子优化软件MaxCodonTM Optimization Program(V13)对提供的α-MMC*5 蛋白氨基酸序列进行密码子优化后碱基序列示意图；
图6为采用密码子优化软件MaxCodonTM Optimization Program(V13)对提供的α-MMC*8 蛋白氨基酸序列的密码子进行优化后碱基序列示意图；
图7为pET30a质粒结构示意图；
图8为含α-MMC、α-MMC*5和α-MMC*8外源基因的构建载体pET30a经NdeI和HindIII双酶切的电泳图示意图谱；
图9为α-MMC、α-MMC*5和α-MMC*8重组蛋白表达的SDS-PAGE分析结果示意图，其中A：α-MMC，B:α-MMC*5，C:α-MMC*8；Lane M:Protein Marker，Lane 0:对照(不加IPTG)， Lane1:15℃诱导16h，Lane 2:37℃诱导16h；
图10为α-MMC、α-MMC*5和α-MMC*8重组蛋白的Western Blot分析结果示意图；其中A：α-MMC，B:α-MMC*5，C:α-MMC*8；Lane M:Western BlotProtein Marker，Lane 1:15℃诱导16h，Lane 2:37℃诱导16h；
图11为SDS-PAGE电泳分析检测细菌超声裂解及亲和层析结果示意图；
图12为以特异性α-MMC单克隆抗体为一抗，碱性磷酸酶标记小鼠多抗为检测抗体，化学发光(ECL)免疫印迹法检测纯化蛋白样本结果示意图；
图13为分别加入终浓度为50μg/ml的FITC-α-MMC、FITC-α-MMC*5和FITC-α-MMC*8，4h后在激光共聚焦显微镜下观察细胞内荧光亮度情况结果示意图；
图14为剂量依赖性细胞毒药物作用示意。
序列表简要说明：序列表(一)分别显示了密码子优化后的α-MMC、α-MMC*5、α-MMC*8 核苷酸序列；
具体实施方式
：
下面将结合本发明实施例中的附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明，本发明实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)仅用于解释某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
另外，在本发明中涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围内。
实施例：
1.α-MMC与LRP-1受体的CR56和CR17结合亚基进行蛋白-蛋白对接，预测受体结合部位和结合位点
应用Zdock3.0.2软件包，选取α-MMC蛋白(PDB:1AHC)与LRP CR56和LRP CR17(如图1)进行蛋白-蛋白对接，蛋白对接面设置四种模式，分别为Residue 1-14(Site1)，Residue71-136(Site2)和Residue 195-222(Site3)以及不特别设置结合界面的随机结合(Non-site)，对接完成后，分别选取得分在前10位(top10)的结合模式作构象分析。
分子对接的实验流程大致为：(1)准备配体和受体两个蛋白质的空间结构(pdb文件)，并人工删除PDB文件中所有水分子、氢原子和其他杂原子；(2)使用命令mark_sur处理受体的pdb文件，并生成ZDOCK使用的pdb文件(mark_sur receptor.pdb receptor_m.pdb)，使用命令mark_sur处理配体的pdb文件，并生成ZDOCK使用的pdb文件(mark_surligand.pdb ligand_m.pdb)；(3)使用ZDOCK程序的可执行文件zdock执行分子对接过程(zdock-R receptor_m.pdb-L ligand_m.pdb-o zdock.out)；(4)以ZDOCK程序搜索受体蛋白与LRP CR56、 LRP CR17之间通过平移和旋转而得到的空间中所有可能的相互结合模式；(5)再使用基于能量的评分函数对ZDOCK初步筛选得到的每个结合模型进行评估，使用IFACE(interface atomic contact energy)统计势能，结构互补和静电等构成的打分函数；(6)使用create.pl 从zdock程序的输出文件中提起受体和配体复合物的结构。
对接的结果显示，当选取Site1为结合界面时，与CR56和CR17结合单元的结合部位top10 全部集聚在α-MMC的Residue 1-14附近，如图1所示。α-MMC与CR56结合的10种模式“重和度”较高，构象模式较集中，显示了稳定结合的态势；α-MMC与CR17的结合没有与CR56结合那样密集，在top10模式中，pose2、6、7、8能形成稳定结合，但pose1、3、4、5、9、 10只有N端的前10位氨基酸或者C端的后10位氨基酸与α-MMC有接触，接触面较小，其他氨基酸残基裸露在空间中，这种构象模式显得不够稳定。
分别挑选与CR56和CR17形成稳定结合的构象进行结合模式分析，如图2，α-MMC的氨基酸残基1-20位的8个氨基酸残基分别与CR56结合亚基的15个氨基酸残基共形成21 个氢键，α-MMC的氨基酸残基1-20位(Tyr55除外)的10个氨基酸残基分别与CR17结合亚基的12个氨基酸残基共形成15氢键。α-MMC与CR56和CR17形成氢键的氨基酸残基位点及氢键个数详细列表如表1和表2。
表1.α-MMC与CR56形成氢键的氨基酸残基及其氢键个数
表2.α-MMC与CR17形成氢键的氨基酸残基及其氢键个数
α-MMC与LRP-1受体的CR56和CR17结合亚基进行蛋白-蛋白对接的示意及结果如图3。
2.根据预测结果，制定突变结合位点氨基酸残基的结构改造模式
根据α-MMC与特异性受体LRP-1分子对接的结果，我们制定了突变5个氨基酸和8个氨基酸的两种结合位点改造模式。理由是：(1)该5个氨基酸，即Asp1、Arg5、Asp10、Lys19、Asp20是α-MMC与LRP-1的结合亚基CR56和CR17共同的结合位点，实为关键结合位点氨基酸；(2)由于CR56是α-MMC的主要结合亚基，因此，突变全部与CR56结合的8个氨基酸，可能会获得更好的阻断受体结合效果，这8个氨基酸残基分别为Asp1、Arg5、Gly8、Asp10、 Ser13、Met16、Lys19、Asp20。依据常规的突变方式，将目标氨基酸突变为结构最为简单的中性氨基酸，丙氨酸(Ala)。突变后的氨基酸序列如下：
目标序列(Target protein sequence)：(N-His标签，突变位点)
(1)α-MMC*5Protein Length＝253MW＝28043.1pI＝9.78突变了5个氨基酸(加粗处)
(2)α-MMC*8Protein Length＝253MW＝27981.1pI＝9.78突变了8个氨基酸(加粗处)
3.目标α-MMC突变体基因的密码子表达优化
3.1α-MMC成熟区(氨基酸残基24-269)的碱基序列为：
α-MMC成熟区碱基长度为792，GC含量为42.8。α-MMC成熟区碱基的CAI值为0.68。
3.2采用密码子优化软件MaxCodonTM Optimization Program(V13)对提供的α-MMC蛋白氨基酸序列进行密码子优化，优化之后的序列:
小括号为终止密码子，中括号内为酶切位点HindIII
密码子优化后，α-MMC成熟区碱基长度为768，％GC含量为58.33。CAI值提高到0.74。优化前后碱基序列对照如下：1是优化前的碱基序列，2是优化后的碱基序列(图4)。
3.3采用密码子优化软件MaxCodonTM Optimization Program(V13)对提供的α-MMC*5蛋白氨基酸序列进行密码子优化，优化之后的序列：
密码子优化后，α-MMC成熟区碱基长度为759，％GC含量为50.07。CAI值提高到0.87。优化前后目标基因序列比对结果(如图5，图5中序列2代表的是优化后的不含His标签的序列，序列3代表优化前的)。
3.4采用密码子优化软件MaxCodonTM Optimization Program(V13)对提供的α-MMC*8蛋白氨基酸序列的密码子进行优化，优化之后的序列为：
密码子优化后，α-MMC成熟区碱基长度为759，％GC含量为50.46。CAI值提高到0.87。优化前后目标基因序列比对结果如图6，(图6中序列3代表优化前的，序列4代表的是优化后的不含His标签的序列)。
4.优化后的目标α-MMC突变体全基因合成及表达载体构建
分别按优化后序列进行α-MMC、α-MMC*5和α-MMC*8全序列合成，再用NdeI和HindIII 双酶切获得的合成序列，与原核表达载体pET30a连接，构建相应α-MMC、α-MMC*5和α-MMC*8外源基因表达载体；之后，经转化DH5a大肠杆菌感受态细胞、蓝白斑筛选和质粒扩增，获得阳性载体克隆；最终通过酶切法和测序确认其准确性。
4.1 pET30a质粒结构如图7。
4.2酶切电泳质控图如图8。ABC分别为含α-MMC、α-MMC*5和α-MMC*8外源基因的构建载体pET30a经NdeI和HindIII双酶切的电泳图谱，Line1:Plasmid DNA，Line2:digestedwith NdeI/HindIII，Line3:DNA Marker。电泳结果显示，基因双酶切后的电泳条带与目的基因片段长度相符。
4.3测序结果如下：
(1)α-MMC序列：
CATATGCATCATCATCACCACCACGACGTCAGCTTTCGTTTATCTGGCGCTGATCCG CGTTCTTATGGCATGTTCATCAAAGACCTGCGTAACGCACTGCCGTTTCGCGAAAAAGT CTACAACATCCCGTTATTATTACCGAGCGTTTCTGGCGCAGGTCGTTATCTGCTGATGCA CCTGTTCAACTACGATGGCAAAACCATTACCGTCGCGGTTGACGTCACCAACGTCTATA TCATGGGCTACCTGGCGGATACCACCAGCTATTTCTTCAACGAACCGGCAGCGGAATTA GCATCTCAGTATGTCTTTCGCGACGCACGTCGTAAAATTACCCTGCCGTATAGCGGCAA CTACGAACGTTTACAGATTGCAGCGGGTAAACCGCGCGAAAAAATTCCGATTGGCCTG CCGGCATTAGATTCTGCGATTAGCACCCTGCTGCATTACGATAGTACCGCAGCAGCAGG CGCGTTATTAGTTTTAATTCAGACCACCGCAGAAGCAGCACGTTTTAAATACATCGAGC AGCAGATCCAGGAACGCGCATATCGCGACGAAGTTCCGAGTTTAGCGACCATTAGCCT GGAAAACAGCTGGTCTGGTCTGAGCAAACAGATTCAGCTGGCACAAGGTAACAACGG CATTTTTCGCACCCCGATTGTCCTGGTTGATAACAAAGGCAACCGCGTTCAGATCACCA ACGTTACCAGCAAAGTCGTCACCAGCAACATCCAACTGCTGCTGAATACCCGTAACATC TAATGAAAGCTT
(2)α-MMC*5序列：
CATATGCATCATCATCACCACCACGCGGTTAGCTTTGCATTATCTGGCGCAGCTCCG CGTTCTTATGGTATGTTTATTGCGGCACTGCGTAACGCACTGCCGTTTCGCGAAAAAGT CTACAACATCCCGTTATTATTACCGAGCGTTTCTGGCGCAGGTCGTTATCTGCTGATGCA CCTGTTCAACTACGATGGCAAAACCATTACCGTCGCGGTTGACGTCACCAACGTCTATA TCATGGGCTACCTGGCGGATACCACCAGCTATTTCTTCAACGAACCGGCAGCGGAATTA GCATCTCAGTATGTCTTTCGCGACGCACGTCGTAAAATTACCCTGCCGTATAGCGGCAA CTACGAACGTTTACAGATTGCAGCGGGTAAACCGCGCGAAAAAATTCCGATTGGCCTG CCGGCATTAGATTCTGCGATTAGCACCCTGCTGCATTACGATAGTACCGCAGCAGCAGG CGCGTTATTAGTTTTAATTCAGACCACCGCAGAAGCAGCACGTTTTAAATACATCGAGC AGCAGATCCAGGAACGCGCATATCGCGACGAAGTTCCGAGTTTAGCGACCATTAGCCT GGAAAACAGCTGGTCTGGTCTGAGCAAACAGATTCAGCTGGCACAAGGTAACAACGG CATTTTTCGCACCCCGATTGTCCTGGTTGATAACAAAGGCAACCGCGTTCAGATCACCA ACGTTACCAGCAAAGTCGTCACCAGCAACATCCAACTGCTGCTGAATACCCGTAACATC TAATGAAAGCTT
(3)α-MMC*8序列：
CATATGCATCATCATCACCACCACGCGGTTAGCTTTGCATTATCTGCAGCAGCTCCGCGC GCGTATGGCGCATTTATTGCAGCACTGCGTAACGCACTGCCGTTTCGCGAAAAAGTCTA CAACATCCCGTTATTATTACCGAGCGTTTCTGGCGCAGGTCGTTATCTGCTGATGCACCT GTTCAACTACGATGGCAAAACCATTACCGTCGCGGTTGACGTCACCAACGTCTATATCA TGGGCTACCTGGCGGATACCACCAGCTATTTCTTCAACGAACCGGCAGCGGAATTAGCA TCTCAGTATGTCTTTCGCGACGCACGTCGTAAAATTACCCTGCCGTATAGCGGCAACTAC GAACGTTTACAGATTGCAGCGGGTAAACCGCGCGAAAAAATTCCGATTGGCCTGCCGG CATTAGATTCTGCGATTAGCACCCTGCTGCATTACGATAGTACCGCAGCAGCAGGCGCG TTATTAGTTTTAATTCAGACCACCGCAGAAGCAGCACGTTTTAAATACATCGAGCAGCA GATCCAGGAACGCGCATATCGCGACGAAGTTCCGAGTTTAGCGACCATTAGCCTGGAAAACAGCTGGTCTGGTCTGAGCAAACAGATTCAGCTGGCACAAGGTAACAACGGCATTT TTCGCACCCCGATTGTCCTGGTTGATAACAAAGGCAACCGCGTTCAGATCACCAACGTT ACCAGCAAAGTCGTCACCAGCAACATCCAACTGCTGCTGAATACCCGTAACATCTAATG AAAGCTT
5.α-MMC、α-MMC*5和α-MMC*8蛋白在大肠杆菌系统中的表达与检定
5.1表达载体转化及诱导表达
分别将构建好的含有α-MMC、α-MMC*5和α-MMC*8基因的质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，然后均匀涂布到LB平板上(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)，之后倒置于37℃培养箱过夜。从转化的平板中挑选单克隆，接种到4mL的LB培养基中(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)，待培养至OD600为0.5-0.8，向试管培养液中加入终浓度0.2mM IPTG，之后分别置于15℃、37℃诱导表达。
5.2 SDS-PAGE分析鉴定诱导表达结果
取诱导后的培养液12000rpm离心5min，去除上清液，加入PBS液重悬沉淀，最后加入SDS-PAGE上样缓冲液于100℃下加热样品10min，然后离心取上清电泳。160V稳压电泳至溴酚蓝带迁移至离凝胶底部1cm，取出凝胶利用蛋白凝胶快速处理系统染脱色，结果分别见图9。结果显示，α-MMC(A)、α-MMC*5(B)和α-MMC*8(C)重组蛋白于BL21(DE3) 皆有明显表达，如图9箭头所示，与对照组相比(不加IPTG)，在15℃和37℃诱导16h皆能看到明显浓密的新生条带形成，其分子量大致接近25kDa。图9中α-MMC、α-MMC*5和α-MMC*8重组蛋白表达的SDS-PAGE分析A：α-MMC，B:α-MMC*5，C:α-MMC*8；Lane M: Protein Marker，Lane 0:对照(不加IPTG)，Lane 1:15℃诱导16h，Lane 2:37℃诱导16h。
5.3 Weatern Blot检测α-MMC、α-MMC*5和α-MMC*8重组蛋白
用Western Blot对α-MMC、α-MMC*5和α-MMC*8进行检测分析，一抗为His标签抗体，化学发光法(ECL法)检测。结果见图10。α-MMC(A)、α-MMC*5(B)和α-MMC*8(C)，在15℃和37℃诱导16h皆能看到明显的着色致密的条带，其分子量与SDS-PAGE位置相同， 37℃诱导尚能观察到一着色较浅的第二条带。图10中α-MMC、α-MMC*5和α-MMC*8重组蛋白的Western Blot分析A：α-MMC，B:α-MMC*5，C:α-MMC*8；Lane M:Western BlotProtein Marker，Lane 1:15℃诱导16h，Lane 2:37℃诱导16h。
6.α-MMC、α-MMC*5和α-MMC*8重组蛋白的纯化及检定
6.1细菌超声裂解及亲和层析
全菌采用50mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl，20mM Imidazole含1％Triton X-100，1mM DTT，1mM PMSF超声裂解，同时以50mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl，20mM Imidazole缓冲液平衡Ni-IDA亲和层析柱，之后用不同浓度咪唑(Imidazole)的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分别进行SDS-PAGE电泳分析检测。分析结果见图11，Lane1-3为100mMImidazole洗脱缓冲液，Lane4-6为300mM Imidazole洗脱缓冲液。电泳结果显示，经Ni-IDA亲和层析纯化后，能获得纯度高于97％的蛋白。
6.2特异性鉴定(免疫印迹)
以特异性α-MMC单克隆抗体为一抗，碱性磷酸酶标记小鼠多抗为检测抗体，化学发光 (ECL)免疫印迹法检测纯化蛋白样本。结果如图12，Lane1～Lane3为重组α-MMC、α-MMC*5和α-MMC*8蛋白。
7.α-MMC突变体的结合阻断作用及减毒效应
7.1结合阻断作用
常规方法将荧光素FITC标记重组α-MMC、α-MMC*5和α-MMC*8蛋白，SpinOUTTM GT-600柱层析纯化，制备FITC-α-MMC、FITC-α-MMC*5和FITC-α-MMC*8蛋白。
常规方法培养L02肝细胞，于对数生长期时分别接种2×105细胞于激光共聚焦专用的培养皿中，加入2ml 1640培养基，过夜培养。待细胞生长至50％～60％，分别加入终浓度为 50μg/ml的FITC-α-MMC、FITC-α-MMC*5和FITC-α-MMC*8，4h后在激光共聚焦显微镜下观察细胞内荧光亮度情况。
实验结果可见，FITC-α-MMC(图13中A部)给药组在不同细胞切面显示点状或斑点状聚集的明亮黄绿色荧光分布，提示FITC-α-MMC已大量进入细胞内，并聚集在某细胞器中；FITC-α-MMC*5(图13中B部)和FITC-α-MMC*8(图13中C部)给药组细胞的荧光则显著减少，图13中B部中只在死亡细胞中有FITC-α-MMC*5进入(细胞死亡后通透性增强)，个别细胞也有较少量点状荧光影，而图13中C部中，除了死亡细胞荧光着色外，几乎没有 FITC-α-MMC*8药物的进入。实验结果显示，当突变α-MMC受体结合部位能显著阻断其进入正常肝细胞。
7.2重组α-MMC、α-MMC*5和α-MMC*8对肝细胞的细胞毒性(CCK-8法)
接种体外培养的1×106个正常肝L02细胞至6孔板细胞培养板，加入2mL完全培养基，37℃、 5％CO2条件下培养。在细胞汇合度在60％～80％时更换新鲜培养基2mL，分别接入100ul终浓度为0μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和250μg/ml的重组α-MMC、α-MMC*5和α-MMC*8于各细胞培养孔，继续培养45h，之后，每孔中加入20ul cck-8 溶液，混匀、37度孵育3h，每孔中加入20ul终止液，立即混匀、酶标仪测OD450值。
以生存率(OD测/OD空×100％)为纵坐标，以给药剂量为横坐标，制作“剂量依赖性细胞毒”药物作用图，如图14。图示结果显示，重组α-MMC对肝细胞L02的生存率随着剂量增加逐渐降低，在给药剂量为10μg/ml后下降明显，给药剂量在大于50μg/ml时，同给药前相比有显著性差异；而重组突变体α-MMC*5和α-MMC*8给药组的细胞生存率随着剂量的增加只有轻微的降低，同给药前皆无显著性差异，亦即没有观察到明显的细胞毒性。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。