阅读说明：本技术 Nash的诊断标志物及其应用 (Diagnostic marker for NASH and application thereof ) 是由 蒋元烨 曹勤 胡诚 张家祺 陆孝良 汪涛 金磊 陆娟 王瑾萍 于 2020-04-21 设计创作，主要内容包括：本发明涉及临床检验诊断技术领域,具体是NASH的诊断标志物及其应用,方法：通过CDAA饮食诱导C57/BL6小鼠20周后建立了NASH肝纤维化模型,结果表明在CDAA模型组小鼠中除了常见的胆汁酸和脂质代谢产物紊乱外,首次发现了磷酸鞘氨醇相关的代谢物异常,其中Sphingosine,Sphingosine 1-phosphate,Sphinganine 1-phosphate含量明显上升。本发明还包括检测诊断标志物的试剂在制备NASH诊断试剂盒中的应用。这对NASH患者治疗具有极高的临床应用价值。(The invention relates to the technical field of clinical examination and diagnosis, in particular to a diagnostic marker of NASH and application thereof, a method comprises the steps of establishing a NASH hepatic fibrosis model after inducing C57/B L6 mice for 20 weeks through CDAA diet, and results show that Sphingosine phosphate-related metabolite abnormality is found for the first time in CDAA model group mice except common bile acid and lipid metabolite disorders, wherein the Sphingosine, Sphingosine1-phosphate and Sphingosine1-phosphate content are obviously increased.)

NASH的诊断标志物及其应用

技术领域

本发明涉及临床检验诊断技术领域，具体地说，是NASH的诊断标志物及其应用。

背景技术

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是美国最常见的慢性肝病。NASH是肝脏的脂肪性炎症，是肝硬化、纤维化和肝衰竭的主要原因。该疾病是进行性的，从脂肪变性或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)开始，进展为发炎的脂肪肝(NASH)，并最终导致肝硬化和纤维化。在严重肝功能损害发生之前，该疾病通常是无症状的。

美国人群中NAFLD的患病率约为20-23％，可能高达33％，美国人群中NASH的患病率约为2-3％。一些NASH患者将进展为晚期疾病：大约15-50％的NASH患者发展为严重的纤维化，并且大约7-16％的患者发展为肝硬化。NASH肝硬化患者的肝脏特异性死亡率约为每十年10％。

目前，不存在针对NASH的特定疗法。

本发明针对现有技术的缺陷，通过采用质谱代谢组学技术查找到了多个NASH诊断标志物，并确定了各诊断标志物表达量与NASH严重程度的相关性。关于本发明NASH的诊断标志物及其应用目前还未见报道。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供NASH疾病诊断标志物。

本发明的第二个目的是针对现有技术的不足，提供如上所述诊断标志物的用途。

本发明的第三个目的是针对现有技术的不足，提供一种与NASH相关的促进剂和抑制剂。

本发明的第四个的目的是针对现有技术的不足，提供一种NASH诊断试剂盒及其用途。

本发明的第五个的目的是针对现有技术的不足，提供一种检测NASH诊断标志物的方法。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

NASH疾病诊断标志物，该标志物选自Sphinganine 1-phosphate或Sphinganine1-phosphate与Sphinganine的组合。

优选地，该标志物还包括Sphinganine 1-phosphate与以下任意一种或多种标志物的组合：Sphinganine、Sphingosine、Sphingosine 1-phosphate、Phosphoric acid、L-Carnitine、Oleamide、Creatine、L-Palmitoylcarnitine、L-Lactic Acid、Taurine、DEHYDROASCORBIC ACID、LysoPE(0:0/22:2(13Z,16Z))、cholic acid、Eicosapentanoicacid、Aspartame、1-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、Tauroursodeoxycholic acid、1-oleoyl-sn-glycero-3-phosp hoethanolamine、3,5-Tetradecadiencarnitine、L-methionine、Malic Acid、Stearoylcarnitine、3a,7a-Dihydroxycholanoic acid、Platelet-activating factor、1-pentadecanoyl-glycero-3-phosphate、LysoPE(0:0/20:3(11Z,14Z,17Z))、LysoPE(0:0/24:6(6Z,9Z,12Z,15Z,18Z,21Z))、LysoPC(15:0)、1-Heptadecanoylglycerophosphoethanolamine、ent-7alpha-Hydroxykaur-16-en-19-oic acid、Dihomo-gamma-linolenic Acid、2-Acyl-sn-glycero-3-phosph ocholine、Oleic acid、L-Carnitine、PC(18:1(9Z)e/2:0)、L-Arginine、LysoPE(0:0/16:0)、LysoPE(22:1(13Z)/0:0)、Sulfolithocholylglycine、LysoPE(0:0/18:1(9Z))、1-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、D-Gluconic acid、Arachidonic acid、LysoPE(0:0/20:1(11Z))、D-PANTOTHENIC ACID。

优选地，NASH严重程度与以下标志物含量均呈负相关：Phosphoric acid、L-Carnitine、L-Palmitoylcarnitine、L-Lactic Acid、Taurine、LysoPE(0:0/22:2(13Z,16Z))、Eicosapentanoicacid、1-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、1-oleoyl-sn-glycero-3-phosp hoethanolamine、L-methionine、Malic Acid、1-pentadecanoyl-glycero-3-p hosphate、LysoPE(0:0/20:3(11Z,14Z,17Z))、LysoPE(0:0/24:6(6Z,9Z,12Z,15Z,18Z,21Z))、1-Heptadecanoylglycerophosphoethanolamine、ent-7alpha-Hydroxykaur-16-en-19-oic acid、Dihomo-gamma-linolenic acid、2-Acyl-sn-glycero-3-phosph ocholine、Oleic acid、PC(18:1(9Z)e/2:0)、L-Arginine、LysoPE(22:1(13Z)/0:0)、LysoPE(0:0/18:1(9Z))、Arachidonic acid、LysoPE(0:0/20:1(11Z))；

NASH严重程度与以下标志物含量均呈正相关：Sphingosine、Oleamide、Creatine、Sphingosine 1-phosphate、DEHYDROASCORBIC ACID、cholic acid、Aspartame、Sphinganine、Tauroursodeoxycholic acid、3,5-Tetradecadiencarnitine、Stearoylcarnitine、3a,7a-Dihydroxycholanoic acid、Platelet-activating factor、LysoPC(15:0)、L-Carnitine、LysoPE(0:0/16:0)、Sulfolithocholylglycine、1-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、D-Gluconic acid、Sphinganine 1-phosphate、D-PANTOTHENIC ACID。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

如上所述的诊断标志物作为治疗靶点在制备治疗NASH的药物中的应用。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

一种抑制剂，所述的抑制剂是降低如下标志物表达量的物质：Sphingosine、Oleamide、Creatine、Sphingosine 1-phosphate、DEHYDROASCORBIC ACID、cholic acid、Aspartame、Sphinganine、Tauroursodeoxycholic acid、3,5-Tetradecadiencarnitine、Stearoylcarnitine、3a,7a-Dihydroxycholanoic acid、Platelet-activating factor、LysoPC(15:0)、L-Carnitine、LysoPE(0:0/16:0)、Sulfolithocholylglycine、1-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、D-Gluconic acid、Sphinganine 1-phosphate、D-PANTOTHENIC ACID。

一种促进剂，所述的促进剂剂是提高如下标志物表达量的物质：Phosphoricacid、L-Carnitine、L-Palmitoylcarnitine、L-Lactic Acid、Taurine、LysoPE(0:0/22:2(13Z,16Z))、Eicosapentanoic acid、1-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、1-oleoyl-sn-glycero-3-phosp hoethanolamine、L-methionine、Malic Acid、1-pentadecanoyl-glycero-3-p hosphate、LysoPE(0:0/20:3(11Z,14Z,17Z))、LysoPE(0:0/24:6(6Z,9Z,12Z,15Z,18Z,21Z))、1-Heptadecanoylglycerophosphoethanolamine、ent-7alpha-Hydroxykaur-16-en-19-oic acid、Dihomo-gamma-linolenic acid、2-Acyl-sn-glycero-3-phosph ocholine、Oleic acid、PC(18:1(9Z)e/2:0)、L-Arginine、LysoPE(22:1(13Z)/0:0)、LysoPE(0:0/18:1(9Z))、Arachidonic acid、LysoPE(0:0/20:1(11Z))。

优选地，抑制剂和促进剂均是选自小分子化合物或生物大分子，所述生物大分子是以标志物蛋白或其转录本为靶序列、且能够抑制标志物蛋白表达或基因转录的小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；或能表达或形成所述小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：

一种NASH诊断试剂盒，所述的试剂盒包括检测如上所述的诊断标志物的试剂。

如上所述的试剂盒在制备检测或诊断NASH药物中的应用。

为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：

一种检测NASH诊断标志物的方法，所述的方法是采用质谱代谢组学技术；其中操作条件为：色谱柱:ACQUITY UPLC HSST3，(100mm*2.1mm，1.8μm)；流速0.3ml/min；柱温为40℃；流动相：纯水(0.1％甲酸)，B:乙腈(0.1％甲酸)；梯度洗脱：0～2min 95％A,2～12min95％～5％A,12～15min,5％A,15～17min 5％～95％A。

通过该方法可一次性地检测出多种诊断标志物，为NASH患者治疗带来了福音。

本发明优点在于：

1、首次找到多个NASH诊断标志物并一一找出其与NASH严重程度的相关性，并指出了其在医学上的用途，具有更快、更准确的优点。同时也为NASH这类患者治疗提供了新的途径，应用前景广。

2、使用采用质谱代谢组学方法，优化了实验参数，可以一次性的检测出多种诊断标志物，效率高。

3、多个诊断标志物联合可协同作用，提高了诊断准确率，为该类患者的治疗带来了福音。

附图说明

附图1是两组小鼠血清生化结果。

附图2是两组小鼠血清氧化应激指标结果。

附图3是两组小鼠肝脏组织HE染色图。

附图4是两组小鼠肝脏组织天狼猩红染色图。

附图5是两组小鼠肝组织透射电镜检测图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1.实验材料

1.1动物：SPF级C57BL/6小鼠10只，雄性，体重约16-20g，购自上海中医药大学附属普陀中心医院实验动物中心。小鼠饲养在SPF洁净级别动物房，温度为22～24℃，相对湿度在40％～60％的实验室内饲养，自然光照，自由饮水。

1.2试剂

谷丙转氨酶测定试剂盒GPT/ALT(南京建成)、谷草转氨酶测定试剂盒GOT/AST(南京建成)、甘油三酯测定试剂盒TG(南京建成)、石蜡(上海国药集团)、天狼星红染色液(abcam)、Mayer苏木素染色液(碧云天)、苏木精水溶液(碧云天)、伊红染色液(碧云天)、髓过氧化物酶(MPO)测试盒(南京建成)、活性氧(ROS)测定试剂盒(南京建成)、丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成)、PBS(上海国药集团)、二甲苯(上海国药集团)、SDS-PAGE试剂盒(碧云天)、BCA蛋白定量试剂盒(碧云天)、一抗、二抗稀释液(碧云天)、戊二醛(上海国药集团)、无水乙醇(上海国药集团)、PVDF膜(Millipore公司)、10×TBST(上海生工公司)、β-actin(Cell Signaling Technology)。普通饲料由上海中医药大学附属普陀中心医院实验动物中心提供；CDAA饲料购自南通特洛菲饲料科技有限公司；蛋白一抗、二抗均购自Abcam公司。

1.3造模和分组：

8周龄、雄性健康C57BL/6小鼠10只，分笼喂养预适应1周后随机分成2组，即对照组、模型组，每组各5只。从第2周开始，给予对照组：普通饲料+等体积蒸馏水灌胃；模型组：CDAA饮食+等体积蒸馏水灌胃。第20周末，结束实验，诱导NASH肝纤维化模型。

1.4一般情况记录及肝指数观察

进食、活动力、毛发、体重。造模完成后小鼠放于代谢笼，禁食不禁水，12h后称量最终体质量，取肝，精确称量小鼠肝湿重。肝指数的计算采用下列公式：肝指数(％)＝肝脏质量(g)/体质量(g)×100％。

2.实验方法

2.1肝组织观察第20周末，结束实验，小鼠放于代谢笼，禁食不禁水12h，颈静脉采血后，采用心脏穿刺法处死所有小鼠，迅速取出肝脏，取部分肝组织以4％的多聚甲醛溶液固定，用于制备石蜡切片；取1mm³左右肝组织切块放入2.5％戊二醛固定液内固定，于4℃冰箱内保存用于透射电镜样品制备，剩余肝组织迅速保存于-80℃冰箱用于肝组织匀浆制备；病理学检查：常规石蜡包埋，切片，用于HE染色及免疫组织化学染色，光镜下观察肝脂肪变性及炎症、纤维化程度。血清常温静止2h后离心(3000r·min^-1，10min)，取上层血清，一部分进行生化检测，另一部分用于代谢组学分析。

2.2生物标志物研究

血清样品100μl，加入400μl甲醇和4μl 2-氯苯丙氨酸(2mg/mL)，振摇2min，4℃离心机中以15000r/min离心10min，吸取200μl上清，转入进样小瓶中待检测。使用高分辨质谱，通过精确分子量并结合HMDB，mz/cloud等数据库鉴定生物标志物。

仪器方法如下：色谱柱:ACQUITYUPLC HSST3，(100mm*2.1mm，1.8μm)；流速0.3ml/min；柱温为40℃；流动相A:纯水(0.1％甲酸)，B:乙腈(0.1％甲酸)。

梯度洗脱如下：0～2min 95％A,2～12min 95％～5％A,12～15min,5％A,15～17min5％～95％A。

2.3数据分析

使用SIEVE软件(Thermo公司)对LC/MS检测数据进行提取和预处理，并在Excel2010中对数据进行归一化后，使用SMICA-P软件进行主成分分析(PCA)，对模型组和正常组小鼠血清样本进行正交偏最小二乘-判别分析(OPLS-DA)。采用SPSS22.0统计软件进行两样本t检验，计量资料以x±s表示，以p<0.05为差异有统计学意义。

3实验结果

见图1-5，在NASH模型中除了常见的胆汁酸和脂质代谢产物紊乱外，我们首次发现了磷酸鞘氨醇相关的代谢物异常。其中Sphingosine，Sphingosine 1-phosphate，Sphinganine1-phosphate的含量显著上升，这可能和NASH炎症有关。

表1

注：FOLD change数值是由NASH组/正常人得到。

Vip值＞1为筛选显著性标志物的指标。

4结论

我们用CDAA饮食诱导C57/BL6小鼠20周后建立了NASH肝纤维化模型。结果显示，HE染色及天狼星红染色均出现典型的NASH肝纤维化病理表现，运用透射电镜观察，也验证了模型组小鼠出现了典型的肝脏细胞脂肪变性及线粒体的变形。进一步采用质谱分析两组小鼠代谢谱变化，鉴定生物标志物。发现两组小鼠的血清及肝组织样本中代谢差异均出现在鞘脂代谢中，通过进一步的定量分析研究，发现了SG、S1P和DHS1P在CDAA模型组小鼠中含量明显上升。S1P是一种重要的生物活性鞘脂类代谢物，越来越多的证据表明S1P信号传导参与了纤维化的发展，因此近年来已成为纤维化机制研究的热点。最近的研究表明，S1P介导的SphK1/S1P/S1PR信号通路参与了肝损伤和肝纤维化的发生。在实验中，对CDAA大鼠的SG、S1P和DHS1P都进行了测定。这些血清指标可能成为评价NASH严重程度的新的生物标志物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。