阅读说明：本技术 一种矾根丛生芽超低温保存及恢复培养方法 (Ultralow-temperature preservation and recovery culture method for alum root clump buds ) 是由 林田 殷丽青 腾小英 李天菲 韩静 周丽 杨华 刘鸿艳 龙萍 罗利军 于 2020-05-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种矾根丛生芽超低温保存及恢复培养方法；包括如下步骤：1.无菌苗体系建立；2.叶片丛生芽的诱导；3.丛生芽的预培养；4.丛生芽的机械固定；5.丛生芽的装载及玻璃化的处理；6.冷冻及解冻洗涤；7.恢复培养。本发明首次提出对矾根叶片诱导丛生芽成功进行超低温保存,保存后矾根恢复生长状况良好。本发明将丛生芽带叶基盘整体作为冻存材料,省去了茎尖剥取的繁琐技术手段,并通过机械固定批量处理,进一步简化操作步骤,最终得到矾根的再生植株；因此,对建立便捷稳定高效的矾根超低温保存体系,有利于矾根属资源规模保存,构建资源库,具有很好的参考价值。(The invention discloses a method for ultralow-temperature preservation and recovery culture of alum root clump buds; the method comprises the following steps: 1. establishing an aseptic seedling system; 2. inducing leaf cluster buds; 3. pre-culturing cluster buds; 4. mechanically fixing the cluster buds; 5. loading cluster buds and vitrifying; 6. freezing and unfreezing and washing; 7. and (5) recovering culture. The invention firstly proposes that the alum root leaves can successfully carry out ultralow temperature preservation on the induced cluster buds, and the recovery growth condition of the alum root after preservation is good. The method takes the cluster bud basal disc with leaves as the whole cryopreservation material, omits the complicated technical means of stem tip stripping, further simplifies the operation steps by mechanical fixation and batch processing, and finally obtains the regeneration plant of the alum root; therefore, the method has good reference value for establishing a convenient, stable and efficient alum root ultralow temperature preservation system, facilitating the scale preservation of alum root resources and establishing a resource library.)

一种矾根丛生芽超低温保存及恢复培养方法

技术领域

本发明属植物细胞工程技术领域；涉及一种矾根丛生芽超低温保存及恢复培养方法，尤其涉及一种矾根叶片诱导丛生芽的超低温保存及再生植株的方法。

背景技术

矾根(Heuchera micrantha)为虎耳草科矾根属多年生彩叶草本花卉，因其叶色多彩常绿及具有耐寒、耐阴、抗旱、耐盐碱等特点，在园林中应用广泛，具有良好的发展前景。矾根属有40多个种及许多园艺杂交品种，其种质资源有效保存对于培育具有自主知识产权的新品种十分重要。矾根常规的繁殖方法为播种、分株，大多数矾根品种结实困难，有性繁殖的方法不能保持矾根原有的品种特性；分株繁殖系数极低，无法规模化生产；在圃地保存不但费时费工，且容易受到自然灾害影响造成种质流失。

植物组织与细胞的培养为植物的种质保存开辟了新的途径。组织培养物能迅速大量繁殖,再生植株可保持原有的遗传特性。近几年科研人员加大了对矾根组织培养技术的研究，但组培繁殖成本较高，过程繁琐，周期较长，亟需建立更有较的保存方法。超低温保存(-196℃)下，植物的生物化学活性近乎停止，贮藏过程中的生理和遗传变化能够控制在最低限度内，避免了田间保存易受自然灾害影响而导致种质变异或毁灭，以及组织培养保存中因多次继代引起遗传性状变异或污染的危险，被认为是植物遗传资源长期保存的最优选择。关于植物超低温保存的研究，保存技术的多样化与简易化方面不断取得进步，能够保存的植物物种数也在不断地增长，但多数集中在苹果、樱桃、柑桔、香蕉、木薯等木本植物以及马铃薯、红薯、草莓等经济植物为主的植物遗传资源的超低温保存。目前未见矾根超低温保存的报道。茎尖组织由于遗传稳定性好，一般作为超低温保存冻存材料，但由于茎尖组织较小且幼嫩，对工作人员的技术水平要求较高，在剥取及其后冻存的操作过程中容易受到机械损伤，影响成活率。本发明将丛生芽带叶片基部组织整体作为冻存材料，省去了茎尖剥取的繁琐技术手段，并通过现成易获得的大头针作为固定物，利用材料本身进行机械固定批量处理，进一步简化操作步骤，最终得到矾根的再生植株；因此，对建立便捷稳定高效的矾根超低温保存体系，有利于矾根属资源规模保存，构建资源库，具有很好的参考价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种矾根丛生芽的超低温保存方法,同时还提供一种矾根丛生芽的超低温保存后的恢复培养方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种矾根丛生芽的超低温保存方法，所述方法包括如下步骤：

S1、无菌系的建立与增殖：矾根茎基部组织经消毒后，接种在含BA及NAA的MS培养基上，20-40d后形成丛生芽；将丛生芽分割成单芽，转接于含BA的MS培养基上进行增殖培养；

S2、叶片丛生芽诱导：取4-7mm的无菌组培苗叶片，背面向上放入含BA及NAA的MS培养基中，15-30天诱导出0.5-1.5mm的丛生芽；

S3、丛生芽预培养：将丛生芽带叶基盘转入含蔗糖的MS培养基培养1-3天；

S4、丛生芽的机械固定:用镊子将带丛生芽的叶基盘串连到灭菌过的12-15mm大头针上,每根针串连3-8片叶基盘，组成叶基盘串；

S5、丛生芽装载及玻璃化处理：将丛生芽叶基盘串放于预处理溶液中装载1hr后转入玻璃化保护剂PVS2中进行20-60分钟的冰浴处理。

S6、冷冻：将丛生芽叶基盘串迅速投入液氮中冻存。

由装载及玻璃化到冷冻，以及后续的解冻步骤，均以丛生芽叶基盘串整体作为冻存材料。解冻洗涤后的恢复培养阶段，需将丛生芽由叶片基部组织剥离进行恢复培养。

作为本发明的一个实施方案，步骤S1中，含BA及NAA的MS培养基中含6-BA 2.0mg/L、NAA 0.1mg/L；含BA的MS培养基中含6-BA 0.1mg/L。

作为本发明的一个实施方案，步骤S1中，增殖培养的培养温度24±2℃，光照强度为30-35μmol·m^-2·s^-1，光照时间为10-12h/d。每20-40d继代1次。

作为本发明的一个实施方案，步骤S2中，含BA及NAA的MS培养基中含6-BA 2.0mg/L，NAA 0.1mg/L。

作为本发明的一个实施方案，步骤S3中，含蔗糖的MS培养基中含蔗糖0.3mol/L。

作为本发明的一个实施方案，步骤S4中，所述预处理溶液为MS培养基+1.2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖。

本发明还涉及一种采用所述方法超低温保存后的矾根丛生芽的恢复培养方法，所述方法包括如下步骤：

A1、解冻洗涤：取出冻存的丛生芽叶基盘串，在35-40℃水浴中解冻60-90S后在1.2M蔗糖MS液体培养基洗涤15-20分钟；

A2、恢复培养：用镊子将带丛生芽的叶基盘由叶基盘串分离，在无菌滤纸上吸干，并在体视显微镜下逐一将丛生芽与叶片基部组织剥离，将丛生芽接种到恢复培养基上，黑暗培养7天后转到正常光照培养。

作为本发明的一个实施方案，步骤A1中，所述1.2M蔗糖液体培养基为1/2MS培养基+1.2mol/L蔗糖。

作为本发明的一个实施方案，步骤A2中，所述恢复培养基为1/2MS培养基+6-BA2mg/L+NAA 0.1mg/L+GA₃0.5mg/L。

作为本发明的一个实施方案，步骤A2中，所述黑暗培养的参数为培养温度24±2℃，光照强度为0μmol·m^-2·s^-1；所述光照培养的参数为培养温度24±2℃，光照强度为30-35μmol·m^-2·s^-1，光照时间为12h/d。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)本发明首次对矾根叶片诱导丛生芽成功进行超低温保存，保存后矾根恢复生长状况良好；

2)本发明将带丛生芽的叶基盘整体作为冻存材料，省去了茎尖剥取的繁琐技术手段，最终得到矾根的再生植株；

3)通过机械固定的方法，将多个带丛生芽的叶基盘进行组装形成叶基盘串，有利于批量处理，进一步简化操作步骤，具体来说，优点在于：1、对冷冻材料进一步批量处理(茎尖－丛生芽－叶基盘—叶基盘串)；2、在其后的操作过程中可以通过对载体(大头针)的处理，避免镊子直接接触材料，从而避免机械损伤；3、由于是直接用大头针机械固定，避免了包埋固定操作程序的繁琐及可能带来的污染及包埋试剂配制的麻烦；

4)本发明有利于建立便捷稳定高效的矾根超低温保存体系，有利于矾根属资源规模保存，构建资源库，具有很好的参考价值。

附图说明

图1为矾根的无菌组培苗示意图；

图2为矾根丛生芽继代示意图；

图3为带丛生芽的叶基盘示意图；

图4为叶基盘串示意图；

图5为冻后恢复培养再生芽示意图；其中右上图为再生芽细部。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1、矾根无菌苗的获得及与增殖

将矾根茎基部组织用洗洁精溶液搅拌清洗，用自来水流动冲洗1h，置于超净工作台上；用浓度为75％的乙醇浸泡30s，冲洗后用添加吐温的10％次氯酸钠溶液浸泡12min；最后经无菌水冲洗5次后用无菌纱布吸干表面水份，接种于含6-BA 2.0mg/L+NAA0.1mg/LMS培养基上进行无菌芽的诱导，获得无菌苗(图1继代3个月的矾根无菌苗))后在含6-BA 0.1mg/L的MS培养基上进行继代培养，培养温度24±2℃，光照强度为30-35μmol·m^-2·s^-1，光照时间为12h/d。每30天继代1次(图2继代扩繁30d的矾根丛生苗)。

实施例2、矾根的丛生芽诱导

取实施例1所得的无菌组培苗，取5mm的无菌组培苗叶片，背面向上放入丛生芽诱导培养基(MS培养基+6-BA 2mg/L+NAA 0.1mg/L)中，15d后开始有淡绿色芽点并有少量小芽长出(图3带丛生芽的叶基盘)，30d后形成丛芽。

实施例3、矾根丛生芽的超低温冻存流程：

取实施例2所得带丛生芽的叶基盘(图3带丛生芽的叶基盘)转入含蔗糖0.3mol/LMS培养基培养3天后，用镊子将带丛生芽的叶基盘串连到灭菌过的12-15mm大头针上,每根针串连4片叶基盘，组成叶基盘串(图4叶基盘串)，将叶基盘串转移至含0.4mol/L蔗糖及1.2mol/L甘油的预处理液(MS培养基+1.2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖)的培养瓶中，室温中缓慢振荡培养1hr后，转入装有预冷玻璃化保护剂PVS2(MS培养基+15％DMSO+15％乙二醇+30％甘油+0.4mol/L蔗糖)的冷冻管中进行20-60分钟的冰浴处理，冻存时将装有材料的冻存管迅速投入液氮中保存。

解冻时40度水浴中解冻1分钟后，将叶基盘串由安培管取出，投入含1.2mol/L蔗糖的液体培养基(1/2MS培养基+1.2mol/L蔗糖)洗涤若干次，总计约20分钟。

实施例4、矾根丛生芽恢复培养：

将实施例3解冻、洗涤后的带丛生芽的叶基盘由叶基盘串(图4叶基盘串)分离后，在无菌滤纸上吸去多余液体，体视显微镜下逐一将丛生芽与叶基盘剥离，将丛生芽接种到恢复培养基(1/2MS培养基+6-BA 2mg/L+NAA 0.1mg/L+GA₃0.5mg/L)上，黑暗中培养7天后转到正常光照培养(图5解冻后再生丛生芽，上部为细部)。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。