一株ⅱ型鲤疱疹病毒orf121蛋白的单克隆抗体及其应用
阅读说明：本技术 一株ⅱ型鲤疱疹病毒orf121蛋白的单克隆抗体及其应用 (Monoclonal antibody of II-type carp herpesvirus ORF121 protein and application thereof ) 是由 姜有声 高娃 王浩 吕利群 郑义华 于 2020-04-09 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一株Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121蛋白的单克隆抗体及其应用,该单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C2019330杂交瘤细胞分泌,杂交瘤细胞以GST-ORF121重组蛋白为抗原免疫的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合而成；本发明成功克隆了PGEX-4T-3-ORF121重组质粒,筛选出一株抗Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121蛋白的细胞株CyHV-2-ORF121-3D9,首次获得了抗CyHV-2-ORF121的单克隆抗体,可特异性识纯化的CyHV-2病毒颗粒、ORF121重组蛋白以及感染CyHV-2的异育银鲫尾鳍细胞系,可用于制备关于CyHV-2检测试纸条或试剂盒的应用。(The invention provides a monoclonal antibody of II type carp herpes virus ORF121 protein and application thereof, wherein the monoclonal antibody is secreted by a hybridoma cell with the preservation number of CCTCC NO: C2019330, and the hybridoma cell is formed by fusing a mouse spleen cell immunized by taking GST-ORF121 recombinant protein as an antigen and a mouse myeloma cell; the invention successfully clones PGEX-4T-3-ORF121 recombinant plasmid, screens out a cell strain CyHV-2-ORF121-3D9 of II-type carp herpes virus ORF121 protein, obtains a monoclonal antibody of anti-CyHV-2-ORF 121 for the first time, can specifically identify purified CyHV-2 virus particles, ORF121 recombinant protein and a crucian carp tail fin cell line infected with CyHV-2, and can be used for preparing application of a CyHV-2 detection test paper strip or a kit.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121蛋白的单克隆抗体及 其应用。
背景技术
鲫鱼(Crucian carp)在我国淡水养殖业的养殖规模越来越大，据2018年中国渔业统计年 鉴显示，我国的鲫鱼年产量为277.2万吨，其中主要养殖品种为异育银鲫(Carassius auratus gibelio)。近几年，由于疱疹病毒性造血器官坏死病(Herpesviralhaematopoietic necrosis,HVHN) 的爆发，给国内外异育银鲫养殖产业带来了巨大的经济损失，该病的主要病原为鲤疱疹病毒 Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)。目前针对CyHV-2比较成熟的检测方法包括电镜诊断技 术、PCR扩增技术[1]、细胞培养分离鉴定和环介导等温扩增技术[2]等，但是基于免疫学的检测 方法研究相对较少，其中，有研究利用CyHV-2壳蛋白ORF72[3]，ORF92[4]为抗原制备了单克隆 抗体，可以有效检测感染CyHV-2的组织及细胞，首次建立了CyHV-2的免疫学检测方法。
参考文献:
[1]Goodwin A E,Merry G E,Sadler J.Detection of the herpesviralhematopoietic necrosis disease agent(Cyprinid herpesvirus 2)in moribund andhealthy goldfish:validation of a quantitative PCR diagnostic method[J].Diseases of Aquatic Organisms,2006,69(2-3):137-143.
[2]He J Q,Shi X J,Yu L,et al.Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for diagnosis of Cyprinid herpesvirus2[J].Journal of virological methods,2013, 194(1-2):206-210.
[3]Kong S Y,Jisng Y S,Wang Q,et al.Detection methods of Cyprinidherpesvirus 2infection in silver crucian carp(Carassius auratus gibelio)via apORF72 monoclonal antibody[J].Journal of Fish Diseases,2017,40(12):1791-1798.
[4]Shen Z Y,Jiang Y S,Lu J F,et al.Application of a monoclonalantibody specific for the ORF92 capsid protein of Cyprinid herpesvirus 2[J].Journal of Virological Methods,2018,261:22-27。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的首要目的是提供一株Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121蛋白的 单克隆抗体。因此，本发明制备的CyHV-2-ORF121单克隆抗体3D9细胞株可以为开发CyHV-2 免疫学检测方法提供更多的理论依据。
本发明的第二个目的是提供上述单克隆抗体的应用。
本发明的第三个目的是提供分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞。
为达到上述首要目的，本发明的解决方案是：
一株Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121蛋白的单克隆抗体，单克隆抗体由保藏号为CCTCCNO:C2019330的杂交瘤细胞分泌，单克隆抗体特异性识别纯化的CyHV-2病毒颗粒、ORF121重组蛋白以及感染CyHV-2的GiCF细胞。
优选地，杂交瘤细胞的制备方法为：以GST-ORF121重组蛋白为抗原免疫的小鼠脾脏细胞 与小鼠骨髓瘤细胞融合而成的杂交瘤细胞。
优选地，GST-ORF121重组蛋白为抗原免疫小鼠脾脏细胞的获得方法为：第一次免疫为抗 原与弗氏完全佐剂等体积充分乳化后对小鼠腹腔注射免疫；14天后进行第二次免疫，抗原与 弗氏不完全佐剂等体积充分乳化后腹腔注射小鼠进行免疫；7天后第三次免疫采用不加佐剂 的抗原腹腔注射免疫；7天后进行第四次免疫，不加佐剂的抗原腹腔注射。
优选地，GST-ORF121重组蛋白的制备方法为：从Ⅱ型鲤疱疹病毒PCR扩增出ORF121基 因，将ORF121基因克隆至PGEX-4T-3质粒上，获得重组质粒PGEX-4T-3-ORF121；将重组质粒 PGEX-4T-3-ORF121转染到大肠杆菌中诱导表达出GST-ORF121重组蛋白。
为达到上述第二个目的，本发明的解决方案是：
一种上述的单克隆抗体特异性识别纯化的CyHV-2病毒颗粒和ORF121重组蛋白，其在制 备Ⅱ型鲤疱疹病毒检测试纸条或试剂盒中应用。
为达到上述第三个目的，本发明的解决方案是：
一株分泌Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞，杂交瘤细胞的保藏 号为CCTCC NO:C2019330。
优选地，杂交瘤细胞的制备方法为：以GST-ORF121重组蛋白为抗原免疫的小鼠脾脏细胞 与小鼠骨髓瘤细胞融合而成的杂交瘤细胞。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
本发明成功克隆了PGEX-4T-3-ORF121重组质粒，筛选出一株抗Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121 蛋白的细胞株CyHV-2-ORF121-3D9，首次获得了抗CyHV-2-ORF121的单克隆抗体，可特异性识 别纯化的CyHV-2病毒颗粒、ORF121重组蛋白以及感染CyHV-2的GiCF细胞，可用于制备关 于CyHV-2检测试纸条或试剂盒的应用。
附图说明
图1为Dot-Blot法筛选阳性最强的细胞株结果图。
图2为Western-blo验证阳性细胞株结果图。
图3为免疫荧光检测感染CyHV-2的GiCF细胞图。
Ⅱ型鲤疱疹病毒(CyHV-2)ORF121 3D9杂交瘤细胞株在2019年12月12日保藏于武汉 大学中国典型培养物保藏中心，其保藏号为：CCTCC NO:C2019330。
具体实施方式
本发明提供了一株Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121蛋白的单克隆抗体及其应用。
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：
多克隆抗体制备：本发明中采用的重组质粒在上海海洋大学病原库本实验室内保存，感 受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司，限制性内切酶、T4连接酶均购自TaKaRa公 司(即宝生物工程(大连)有限公司)。
ORF121原核表达
1.1ORF121基因片段扩增
根据CyHV-2ORF121的基因序列设计特异性引物
(F:5′-CCGGAATTCCATGTCTACAGAAATGGTTTTCATCG-3′(SEQ ID NO.1)；R:5′ -CCGCTCGAGTCCTACATATCGTCTTCATCCTCGGGT-3′(SEQ ID NO.2))，在上下游引物序列中分 别插入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点。收集感染CyHV-2的GiCF细胞感染液反复冻融2-3次，于4℃ 下4000r/min离心20min，收集上清液于4℃下32000r/min离心1.5h，弃上清，用无菌PBS (pH为7.4)重悬沉淀；将病毒悬液加入由质量体积比分别为20％、30％、40％、50％和66％ 的蔗糖密度梯度离心管上层，于4℃下25000r/min离心1h；收集每一层的病毒样品于试管中， 加入无菌水使蔗糖质量体积比接近20％，上层加入20％蔗糖溶液于4℃下32000r/min离心2h，收集每一管沉淀，用无菌水重悬为纯化的CyHV-2病毒颗粒。从纯化的CyHV-2病毒中提取DNA作为基因扩增模板，对ORF121基因进行扩增，PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后，利用DNA片段传话回收试剂盒进行回收。
1.2ORF121基因的克隆
将纯化回收的PCR产物和原核表达的质粒PGEX-4T-3双酶切处理(体系：EcoRⅠ3μL，XhoⅠ 3μL，10×Buffer 10μL，PCR纯化回收产物≤600ng，加ddH2O至90μL；质粒体系：EcoRⅠ2μL， XhoⅠ2μL，10将纯化回收的ORF121基因PCR产物和原核表达的质粒PGEX-4T-3双酶切处理 (体系：EcoRⅠ3μL，XhoⅠ3μL，10×Buffer 10μL，PCR纯化回收产物≤600ng，加ddH2O至 90μL；质粒体系：EcoRⅠ2μL，XhoⅠ2μL，10×Buffer 10μL，质粒≤2μg，加ddH2O至100μL) 37℃反应2h，利用T4连接酶将酶切后的ORF121基因产物和PGEX-4T-3质粒进行连接反应， (连接体系：T4Liqase 1μL，T4Liqase buffer 2.5μL，PGEX-4T-3 98ng，ORF121基因产物220ng， 加ddH2O至25μL)，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，菌液PCR鉴定 为阳性的提取其重组质粒，经测序鉴定正确后，命名为PGEX-4T-3-ORF121Buffer 10μL，质粒 ≤2μg，加ddH2O至100μL)37℃反应2h，利用T4连接酶将酶切后的ORF121基因产物和 PGEX-4T-3质粒进行连接反应，(连接体系：T4Liqase 1μL，T4Liqase buffer 2.5μL，PGEX-4T-3 98ng，ORF121基因产物220ng，加ddH2O至25μL)，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，筛选 阳性克隆，菌液PCR鉴定为阳性的提取其重组质粒，经测序鉴定正确后，命名为 PGEX-4T-3-ORF121。
1.3ORF121基因的诱导表达和可溶性分析
将PGEX-4T-3-ORF121转化至BL21(DE3)感受态细胞中，挑选含有氨苄西林抗生素的LB 平板筛选的阳性克隆，接种阳性克隆于13mlLB(含100mg/mL Amp+)培养基中，37℃，180r/min 培养12h，取200μL于200mL LB液体培养基(含100mg/mL Amp+)中扩大培养，于37℃，180r/min 恒温摇床培养5h，加入IPTG使其终浓度为1mmol/L，诱导5h，收集菌液8500r/min离心10min， 经PBS缓冲液重悬菌体后离心收集菌体，进行超声破碎30min(超声6s/间隔6s，功率60％， 100次)至菌液透明，4℃、12000r/min离心30min，分别收集菌体和上清液，制样后进行 SDS-PAGE电泳，鉴定表达蛋白的可溶性。
1.4目的蛋白纯化
将菌液沉淀依次用2mol/L、4mol/L、6mol/L和8mol/L的尿素洗去杂蛋白，每次洗涤后4℃ 条件下8500r/min离心20min，冰上孵30min，每次离心前按照1:1000的比例加入蛋白酶抑 制剂PMSF。洗脱蛋白依次经含有8mol/L、6mol/L、4mol/L、2mol/L和0mol/L尿素的PBS溶 液中透析，每次透析4h。透析后用BCA法测定微量蛋白浓度测定试剂盒，测其浓度，置于-80℃保存。
实施例2：
单克隆抗体制备：
2.1SP2/0小鼠骨髓瘤细胞和实验用小鼠
SP2/0小鼠骨髓瘤细胞由本实验室保存，免疫前进行复苏培养，使其处于对数生长期。实 验用SPF级BABL/C小鼠购于上海雷根生物科技有限公司，免疫前实验室暂养7天。
2.2免疫程序
用已纯化好的目的蛋白免疫小鼠，分四次进行免疫，每次200μl/只。第一次免疫时使用 弗氏完全佐剂与ORF121重组蛋白1:1混合完全乳化后腹腔注射；第二次免疫于第一次免疫后 的14天进行，将ORF121重组蛋白与弗氏不完全佐剂1:1混合完全乳化后腹腔注射；第三次 和第四次免疫都在上一次免疫的一周后进行，采用不加佐剂的ORF121重组蛋白稀释液腹腔 注射。
2.3细胞融合及培养
在最后一次免疫后的第三天进行细胞融合实验。将正常小鼠的胸腺用1640培养液充分研 磨后1000r/min离心5min，弃上清，用40ml含1％HAT的1640培养液重悬备用；取用ORF121 重组蛋白免疫的小鼠的脾脏，用1640培养液充分研磨后1000r/min离心5min，用10ml 1640 培养液重悬备用；将SP2/0细胞培养液倒掉后用1640培养液吹打至完全脱落，倒入有脾细胞 的试管中吹匀后1200r/min离心8min，弃上清，轻击离心管底部使两种细胞充分混合成糊状， 在1.5min中缓慢加入预热到37℃的PEG溶液1ml，继续作用90s，在5min内缓慢滴加预热 到37℃的1640培养液10ml使PEG稀释失去作用，补加1640培养液至40ml，吹起沉淀， 800r/min离心6min，弃上清，将备用的胸腺细胞加入到离心管中，混匀，加至96孔板中， 每孔100μl，共计4个板，放入含有5％CO2的37℃培养箱中培养。
2.4细胞株亚克隆
细胞融合后第7天观察96孔板中杂交瘤细胞堆的生长情况，第10天记录杂交瘤细胞堆 的大小及位置，待细胞堆长到96孔板的一半大小时取细胞上清液用Dot-blot法进行检测，将 检测结果为阳性的细胞继续培养，对长出单细胞堆的孔进行亚克隆处理，直至亚克隆的细胞 上清阳性率达到100％为止，并采用Dot-blot法进行检测，筛选阳性杂交瘤细胞，结果如图1 所示，选出的效果最佳的细胞株(即阳性最强的细胞株)为3D9，转孔并扩大培养并建立细 胞株用DMSO保存。
2.5对阳性细胞株进行Western-blot验证
配5％的上层胶与10％的分离胶，纯化的CyHV-2病毒粒子与2×蛋白上样Buffer等体积 混合，100℃水浴5min，离心后上样进行电泳，用湿转法将蛋白转到PVDF膜上。PVDF膜用 5％的脱脂牛奶封闭2h，筛选出的阳性细胞株上清液4℃孵育过夜，PBST洗膜，1:5000HRP标 记羊抗小鼠IgG抗体孵育1h，PBST洗膜，用ECL显色试剂盒进行显色后用蛋白成像仪拍照记 录结果。结果如图2所示，Dot-Blot验证后，扩大培养3D9细胞株，3D9细胞株分泌上清在Western-Blotting中特异识别CyHV-2病毒中的ORF121蛋白，验证表明该细胞株为ORF121重组蛋白抗体的细胞株。
2.6免疫荧光检测感染CyHV-2的GiCF细胞
将GiCF细胞传至6孔板中，待其生长铺满80％以上时进行感染，500μl CyHV-2感染液孵 育1h后吸出，加入含5％胎牛血清的Medium 199培养液，25℃培养，待细胞出现明显细胞 病变效应(Cytopathic Effect，CPE)时检测。弃去上清，PBS洗3次，4％多聚甲醛室温固定细 胞10min，PBS洗三次，5％脱脂牛奶封闭2h后PBS洗三次，加入筛选出的阳性细胞株上清液 孵育2h，PBS洗三次，加入FITC-conjugated anti-mouse antibody，PBS洗三次，加入DAPI染 核10min，PBS洗三次，抗荧光封片剂封片后，用共聚焦显微镜拍照观察，结果如图3所示， 3D9细胞株分泌上清在免疫荧光实验中特异性识别感染CyHV-2的GiCF细胞，表明该细胞株 可以特异性识别感染CyHV-2的细胞。
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉 本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用 到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术 人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范 围之内。
序列表
<110> 上海海洋大学
<120> 一株Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121蛋白的单克隆抗体及其应用
<141> 2020-04-09
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
ccggaattcc atgtctacag aaatggtttt catcg 35
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
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