阅读说明：本技术 一种用于肺病治疗的脐带间充质干细胞及其制备方法 (Umbilical cord mesenchymal stem cells for treating lung diseases and preparation method thereof ) 是由 王宇环 罗晓玲 张正涵 于 2020-04-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种用于治疗肺部疾病的脐带间充质干细胞及其制备方法。本发明提供的脐带间充质干细胞可用于制备预防或治疗尘肺损伤及纤维化的药物。该药物应用于肺病治疗,尤其是尘肺肺损伤及其纤维化时,安全性高,对对应病症的干预和治疗效果好,通过成熟的细胞培养技术手段可以实现量化生产,具有很好的应用前景。(The invention provides umbilical cord mesenchymal stem cells for treating lung diseases and a preparation method thereof. The umbilical cord mesenchymal stem cells provided by the invention can be used for preparing medicines for preventing or treating pneumoconiosis injury and fibrosis. The medicine is applied to lung disease treatment, particularly pneumoconiosis lung injury and fibrosis thereof, has high safety, good intervention and treatment effects on corresponding diseases, can realize quantitative production by mature cell culture technical means, and has good application prospect.)

一种用于肺病治疗的脐带间充质干细胞及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种用于肺病治疗的脐带间充质干细胞及其制备方法。

背景技术

干细胞具有自我更新能力和多向分化潜能等特征，间充质干细胞(mesenchymalstem cells，间充质干细胞)是干细胞家族的重要成员之一，始发于早期中胚层和外胚层，最先在骨髓中被发现，随后其多向分化、造血辅助、免疫调控的特点逐渐被发现，无论体内还是体外，间充质干细胞均可诱导、分化为多种组织细胞。

2001年Kotton提出，成体组织来源的间充质干细胞可以归巢到肺脏，这为干细胞治疗呼吸系统疾病带来了新的契机。Burt等的报道称：干细胞在肺内可能通过与体细胞接触而发生融合现象，表现出相应的类上皮样组织形态学特征和功能，实现修复损伤肺组织的目的。对于干细胞减缓炎症、对抗纤维化的机制，一种假说认为干细胞可替代肺泡上皮细胞，发挥促进受损肺泡细胞增殖、再生和修复的功能；另一种假说认为干细胞可以改变受损部位微环境，促进细胞因子的分泌。

而尘肺病一旦发生即呈进行性发展，目前全世界对尘肺病的治疗都缺乏特效的药物，临床上应用的药物主要是抑制肺纤维化，药物治疗只能一定程度上缓解患者的通气功能，不能有效治愈疾病。另一种较为直接的方法为肺灌洗，可物理性清除肺泡腔内残留的粉尘、吞尘肺巨噬细胞和致炎、致纤维化因子等物质，疏通气道、逆转气道痉挛，增加肺通气量和血氧比值等，被认为是目前尘肺病唯一有效的治疗方法。大容量全肺灌洗术的疗效主要与尘肺的病程有关，在尘肺早期(0-Ⅰ期)，大量的粉尘还在肺泡内，全肺灌洗可把肺泡内的粉尘洗出来，治疗效果好；在晚期(Ⅲ期)，大量粉尘已转运到肺间质内，从而无法洗出，治疗效果远不如早期，并且晚期常因有并发症而不能行大容量全肺灌洗术。此外有研究证实，肺灌洗过程中可能存在肺泡表面活性物质(PS)的丢失。

将间充质干细胞应用于各种严重肺疾病的治疗是近年研究热点，已经有研究证实间充质干细胞可改善或减轻肺损伤。间充质干细胞的自我更新、多向分化的潜能以及它们所具有的低免疫原性和免疫抑制的作用，为其临床应用的安全性和有效性提供了可靠的理论基础；另外，间充质干细胞输注到体内后，不仅可以迁移至受损组织部位，还能抑制前炎症因子的释放，并促进受损组织的修复，这为改善尘肺患者的症状及延缓患者肺纤维化提供一种更有效的治疗手段。

中国专利CN 106038597 A中公开了一种人羊膜间充质干细胞在制备治疗急性肺损伤制剂中的应用，采用人羊膜组织分离出来的间充质干细胞，以腹膜腔注射PQ制作急性肺损伤动物模型，经舌下静脉移植hAD-MSCs制剂，对急性肺损伤有很好的治疗效果。但该方法只针对治疗百草枯诱导的急性肺损伤。

中国专利CN 110680833 A中公开了一种结合肺灌洗治疗尘肺病的套药，该套药由间充质干细胞和肺灌洗液组成。该套药使尘肺病患者的血清免疫学指标、肺通气功能、血清纤维化指标和CT密度直方图均有明显好转，肺纤维化出现明显改善。但该方法操作繁琐，成分复杂，有待进一步优化。

发明内容

本发明的目的在于提供间充质干细胞的新用途，包括在尘肺肺损伤及其纤维化中的新应用。

一方面，本发明提供了间充质干细胞在制备用于肺部疾病治疗的药物中的应用。

所述的间充质干细胞包括但不限于脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞中的一种或多种。

所述的肺病包括但不限于尘肺、特发性肺纤维化(IPF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、重症新型冠状病毒肺炎、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、各种急慢性肺损伤。

所述的脐带间充质干细胞包括分离自胎儿脐带的原代细胞及其传代细胞。

所述的脐带间充质干细胞传代细胞可以是第1-50代。

所述的脐带间充质干细胞的制备方法为取健康足月妊娠剖宫产的胎儿脐带，采集后在12h内用组织块贴壁法进行分离培养，培养的具体步骤如下：

(1)沿脐静脉内腔纵向剪开血管，剥离脐静脉内膜，将剩余组织切成小块，转移至细胞培养瓶中，加入10mL完全培养基使其均匀分布，置于CO₂培养箱中；

(2)第7天全量换液，第12天半量换液，于培养的第14天计数集落数，超过50个细胞计为集落；当细胞达到70％-80％融合时，以含0.125％胰蛋白酶的0.1％EDTA消化传代细胞，以2.5×10³-5×10³/cm²密度接种，记为第一代细胞，即P1；

(3)取P1代细胞以3-6×10³/cm²密度接种，再进行接种传代培养，添加完全培养基20mL至培养瓶，置于CO₂培养箱中，当细胞达到70％-80％融合时，以含0.125％胰蛋白酶的0.1％EDTA消化传代细胞，记为第二代细胞，即P2。

(4)依次制备培养第三到第八代次细胞，即P3-P8；

所述的步骤(1)中的完全培养基为含2％血清替代品的Lonza UltraCULTURE通用型无血清基础培养基或DMEM/F12培养基；所述的步骤(1)和步骤(3)中CO₂培养箱设置条件为37℃、5％CO₂、饱和湿度。

所述的脐带间充质干细胞通过注射的方式对肺病进行治疗。

所述的脐带间充质干细胞注射方式为一次性注射或分阶段注射。

优选地，所述的脐带间充质干细胞一次性注射的注射量为1×10⁶-6×10⁶个/kg体重；进一步优选为2×10⁶个/kg体重。

优选地，所述的脐带间充质干细胞分阶段注射为等量或非等量注射1-6次，总注射量为1×10⁶-36×10⁶个/kg体重；进一步优选为注射4次，总注射量为8×10⁶个/kg体重。

优选地，所述的人脐带间充质干细胞用于注射时的细胞密度为2.5×10⁵-7.5×10⁵个/mL；优选为5×10⁵个/mL。

所述的注射方法包括但不限于：静脉注射、气管给药。

所述的脂肪间充质干细胞的制备方法为：

(1)无菌操作采集脂肪组织，采集后在12h内用胶原酶消化法进行分离培养，洗涤脂肪组织，除去血细胞，加入与脂肪组织悬液等量新配制的预热的0.075％浓度的胶原酶I或者胶原酶IV工作液，剧烈晃动培养瓶5-10秒，置于振动气浴锅中，37℃，70rpm，消化50-70min，并每隔15分钟将培养瓶取出剧烈晃动培养瓶5-10秒后继续置于振动气浴锅中消化；

(2)分离基质血管组分：将消化后的组织用输血器滤网过滤，然后平均分装到2个50mL的离心管中，300g-500g室温离心10min，得到的沉淀即为基质血管组分；

(3)净化沉淀：离心后，基质血管组分沉积于离心管底部，用移液管自上而下小心除去上层油脂和下层的胶原酶溶液；适量生理盐水重悬基质血管组分，吹散，300g-500g室温离心10min；

(4)离心完毕后，小心吸去上清液，注意不要直接倾倒；用10mL培养基重悬基质血管组分，然后将基质血管组分汇总到1个新的50mL离心管中，再次室温离心，200g-400g，10min；

(5)种瓶：离心后取15mL上清送检进行无菌检测，用20mL培养基充分重悬组织，将20mL组织悬液均分至培养瓶中，将培养瓶置于37℃，5％CO₂培养箱中；原代培养第24小时，进行全量换液，镜下观察细胞状态；将培养瓶中漂浮的、没有贴壁的基质血管组分及培养液一起倒入新的50mL离心管，700g-900g离心5min；倒去离心上清，重新往每个培养瓶中加入新完全培养液8mL，再用适量完全培养液定容，吹打混匀，分别往每个培养瓶中加入2mL基质血管组分；第五天全量换液；第七天收集细胞传代或冻存再培养7天左右，原代培养的细胞克隆团的面积百分比达到70％-80％时，消化收获；

(6)收获后的细胞悬液定容后接种至新的培养容器中，传代细胞密度为5000-6000个/cm²，即3.75×10⁵-4.5×10⁵个/培养瓶，按照4.5×10⁵个/培养瓶进行传代，每瓶加培养基至10mL；置于37℃，5％CO₂培养箱中培养至细胞融合度达到85％-90％，即得到P1代脂肪干细胞；

(7)传代：轻轻吹打重悬浮细胞，定容后接种至新的培养容器中，传代细胞密度为5000-6000个/cm²，即3.75×10⁵-4.5×10⁵个/培养瓶，按照4.5×10⁵个/培养瓶进行传代，每瓶加培养基至10mL，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养至细胞融合度达到85％-90％，即得到P2代脂肪干细胞；

(8)依次制备培养第三到第八代次细胞，即P3-P8。

另一方面，本发明提供了一种脐带间充质干细胞。

所述的脐带间充质干细胞取自健康足月妊娠剖宫产的胎儿脐带，采集后在12h内用组织块贴壁法进行分离培养，培养的具体步骤如下：

(1)沿脐静脉内腔纵向剪开血管，剥离脐静脉内膜，将剩余组织切成小块，转移至细胞培养瓶中，加入10mL完全培养基使其均匀分布，置于CO₂培养箱中；

(2)第7天全量换液，第12天半量换液，于培养的第14天计数集落数，超过50个细胞计为集落；当细胞达到70％-80％融合时，以含0.125％胰蛋白酶的0.1％EDTA消化传代细胞，以2.5-5×10³/cm²密度接种，记为第一代细胞，即P1；

(3)取P1代细胞以3-6×10³/cm²密度接种，再进行接种传代培养，添加完全培养基20mL至培养瓶，置于CO₂培养箱中，当细胞达到70％-80％融合时，以含0.125％胰蛋白酶的0.1％EDTA消化传代细胞，记为第二代细胞，即P2；

(4)依次制备培养第三到第八代次细胞，即P3-P8。

所述的步骤(1)中的完全培养基为含2％血清替代品的Lonza UltraCULTURE通用型无血清基础培养基或DMEM/F12培养基；所述的步骤(1)和步骤(3)中CO₂培养箱设置条件为37℃、5％CO₂、饱和湿度。

再一方面，本发明还提供了一种脂肪间充质干细胞。

所述的脂肪间充质干细胞的制备方法为：

(1)无菌操作采集脂肪组织，采集后在12h内用胶原酶消化法进行分离培养，洗涤脂肪组织，除去血细胞，加入与脂肪组织悬液等量新配制的预热的0.075％浓度的胶原酶I或者胶原酶IV工作液，剧烈晃动培养瓶5-10秒，置于振动气浴锅中，37℃，70rpm，消化50-70min，并每隔15分钟将培养瓶取出剧烈晃动培养瓶5-10秒后继续置于振动气浴锅中消化；

(2)分离基质血管组分：将消化后的组织用输血器滤网过滤，然后平均分装到2个50mL的离心管中，300g-500g室温离心10min，得到的沉淀即为基质血管组分；

(3)净化沉淀：离心后，基质血管组分沉积于离心管底部，用移液管自上而下小心除去上层油脂和下层的胶原酶溶液；适量生理盐水重悬基质血管组分，吹散，300g-500g室温离心10min；

(4)离心完毕后，小心吸去上清液，注意不要直接倾倒；用10mL培养基重悬基质血管组分，然后将基质血管组分汇总到1个新的50mL离心管中，再次室温离心，200g-400g，10min；

(5)种瓶：离心后取15mL上清送检进行无菌检测，用20mL培养基充分重悬组织，将20mL组织悬液均分至培养瓶中，将培养瓶置于37℃，5％CO₂培养箱中；原代培养第24小时，进行全量换液，镜下观察细胞状态；将培养瓶中漂浮的、没有贴壁的基质血管组分及培养液一起倒入新的50mL离心管，700g-900g离心5min；倒去离心上清，重新往每个培养瓶中加入新完全培养液8mL，再用适量完全培养液定容，吹打混匀，分别往每个培养瓶中加入2mL基质血管组分；第五天全量换液；第七天收集细胞传代或冻存再培养7天左右，原代培养的细胞克隆团的面积百分比达到70％-80％时，消化收获；

(6)收获后的细胞悬液定容后接种至新的培养容器中，传代细胞密度为5000-6000个/cm²，即3.75×10⁵-4.5×10⁵个/培养瓶，按照4.5×10⁵个/培养瓶进行传代，每瓶加培养基至10mL；置于37℃，5％CO₂培养箱中培养至细胞融合度达到85％-90％，即得到P1代脂肪干细胞；

(7)传代：轻轻吹打重悬浮细胞，定容后接种至新的培养容器中，传代细胞密度为5000-6000个/cm²，即3.75×10⁵-4.5×10⁵个/培养瓶，按照4.5×10⁵个/培养瓶进行传代，每瓶加培养基至10mL，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养至细胞融合度达到85％-90％，即得到P2代脂肪干细胞；

(8)依次制备培养第三到第八代次细胞，即P3-P8。

再一方面，本发明还提供了一种用于治疗肺部疾病的药物。

所述的药物包含人间充质干细胞。

所述的间充质干细胞来源包括但不限于脐带、脂肪、胎盘、骨髓。

优选地，所述的药物中的人间充质干细胞为前述制备方法制备的脐带间充质干细胞。

优选地，所述的药物为注射液。

所述的药物还包含其他药学上可接受的载体，如：海藻糖、无水或含水的氯化钠、葡萄糖、蔗糖、木糖醇、果糖、甘油、山梨醇、甘露醇、氯化钾、甘露糖、氯化钙和氯化镁。

在一些实施例中，所述的药物为注射液，其成分包括：间充质干细胞、人血白蛋白、0.9％氯化钠注射液，其中间充质干细胞含量为1×10⁵-25×10⁵个/mL、人血白蛋白含量为0.01-0.05g/mL。

本发明提供的方法应用于治疗肺部疾病，尤其是尘肺肺损伤及其纤维化时，安全性高，对对应病症的干预和治疗效果好，通过成熟的细胞培养技术手段可以实现量化生产，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为P1、P5代及P8代脐带间充质干细胞细胞集落形成率结果图。其中A为形成的总数，B为形成率。

图2为采用P1、P2、P5代及P8代脐带间充质干细胞作为研究对象，应用流式细胞仪检测结果。

图3为分析P1、P2、P5和P8代脐带间充质干细胞不同细胞周期的百分比。

图4为脐带间充质干细胞经过TNF-α和INF-γ刺激后吲哚胺2,3-双加氧酶的表达结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1一种脐带间充质干细胞制备方法

取自健康足月妊娠剖宫产的胎儿脐带，采集后在12h内用组织块贴壁法进行分离培养，具体步骤如下：

(1)沿脐静脉内腔纵向剪开血管，剥离脐静脉内膜，将剩余组织切成3-5mm³小块，转移至T75细胞培养瓶中，加入10mL完全培养基(含2％血清替代品的DMEM/F12培养基)使其均匀分布，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱中。

(2)第7天全量换液，第12天半量换液，于培养的第14天计数集落数，超过50个细胞计为集落。当细胞达到70％-80％融合时，以含0.125％胰蛋白酶的0.1％EDTA消化传代细胞，以2.5-5×10³/cm²密度接种，记为第一代细胞(P1)。

(3)取P1代细胞以5.7×10³/cm²密度接种，再进行接种传代培养，添加完全培养基20mL至T175培养瓶，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱中，当细胞达到70％-80％融合时，以含0.125％胰蛋白酶的0.1％EDTA消化传代细胞，记为第二代细胞(P2)。

(4)依次制备培养P3-P8代次细胞。比较所获代次细胞的形态学特征，用流式细胞学技术分析细胞的表面标记，特异性染色方法鉴定所获代次细胞在不同诱导条件下向成骨细胞及脂肪细胞分化的潜能。

本实施例中脐带间充质干细胞检测和鉴定方法如下：

形态和生长特性初步鉴定：采用P1、P3、P5、P8代人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)作为研究对象，观察细胞形态并拍照，与从其它途径(文献/书籍/图络)经典细胞图片进行对比。结果显示：所有代次细胞均呈现贴壁生长的特性；P1/P3/P5细胞按面积大致分为三类，0-2000μm²细胞比例最多，P8 0-2000μm²细胞比例减小，≥6000μm²细胞比例增多，统计数据与目测镜下观察结果一致。经研究，本项目所有代次细胞均符合ISCT标准。

细胞增殖实验：采用P1-P5代及P8代脐带间充质干细胞作为研究对象，应用CCK8试剂盒(购自Sigma，货号为96992)检测在不同时点的增殖情况，同时描绘生长曲线。结果显示，P8代脐带间充质干细胞增殖趋势和P1-P5代脐带间充质干细胞存在显著性差异，而P1-P5代之间的脐带间充质干细胞细胞增殖曲线无差异，单因素方差分析进行两两比较均无显著性差异(P>0.05)。

细胞群体倍增实验：采用P1-P5代及P8代脐带间充质干细胞作为研究对象，检测细胞群体倍增时间并分析它们的差异性。通过分析不同细胞数目，计算倍增时间，结果显示，P1代平均倍增时间为25.10h；P2和P3的倍增时间分别为22.72h和23.33h，两者差别不大；P4和P5的倍增时间也类似，分别是27.87h和27.45h；P8倍增时间相对较长，为36.86h。

细胞CFU形成能力：采用P1、P5代及P8代脐带间充质干细胞作为研究对象，检测细胞集落形成率。通过结晶紫染色发现，P1、P5和P8代细胞均能形成CFU细胞集落，P1代CFU实验6孔板中，集落形成总数为：24个，形成率为：20％(24/120＝0.1083)；而P5代CFU实验6孔板中，总共为：13个，形成率为：10.83％(13/120＝0.1083)；P8代CFU总数为7个，形成率为：5.83％(7/120＝0.0583)(如图1所示)。

细胞表面标记物检测：采用P1-P5代脐带间充质干细胞作为研究对象，应用流式细胞仪检测细胞表面标记。结果显示：CD90、CD73、CD105、HLA-ABC、CD29、CD166随代次增加，表达量有增加趋势，P2-P5代表达量均≥95.0％；CD14、CD34、HLA-DR、CD271、CD45、CD19、CD314，表达量有减少趋势，P2-P5代表达量均≤2％。P2-P5代细胞均符合ISCT的国际标准(CD105、CD73和CD90高表达，CD34、CD45、CD19和HLA-DR低表达)。

细胞分化能力检测：采用P2和P5代脐带间充质干细胞作为研究对象，分析比较不同代次脐带间充质干细胞体外诱导成骨、成脂、成软骨分化能力。结果显示P2和P5代细胞均在体外成功诱导成脂、成骨分化，P2与P5代体外诱导成脂分化能力无显著差异，P2与P5代体外诱导成骨分化能力无显著差异，P2与P5代体外诱导成软骨分化能力无显著差异。同一代次细胞，体外诱导成脂分化能力相对弱于成骨、成软骨能力。

实施例2脐带间充质干细胞安全性评估

对实施例1提供的人脐带间充质干细胞进行安全性评估。

细胞周期分析实验：采用P1、P2、P5代及P8代脐带间充质干细胞作为研究对象，应用流式细胞仪检测并分析P1、P2、P5和P8代脐带间充质干细胞各细胞周期百分比。图2、3可以看出，P1-P8的脐带间充质干细胞大部分细胞周期聚集在G0-G1期，虽然个别存在少许差别，但是G1期占比均能保持在84％以上，进行分裂的细胞较少，DNA倍体无异常。

端粒酶活性分析实验:采用P0、P1、P2、P5代脐带间充质干细胞作为研究对象，应用PCR扩增联合ELISA方法检测细胞端粒酶相对活性，结果显示P2代后端粒酶相对活性降低，估计与细胞生长和产生衰老有关，但不影响细胞的其他功能。

软琼脂克隆形成实验:采用P1、P2、P5代脐带间充质干细胞作为研究对象，检测细胞在软琼脂中的克隆形成能力和克隆大小。结果显示P1/2/5代细胞和阳性对照海拉细胞都有成克隆，成纤维细胞为阴性结果。对P5代克隆团观察结果表明细胞成团是自身增殖所致。P1、P2、P5代细胞均有成克隆团能力，且各代次的成团能力无显著差异。

核型分析:采用产P1和P5代脐带间充质干细胞作为研究对象，镜下观察细胞在传代后染色体组是否正常，结果显示P1和P5代细胞未发现异常。

实施例3淋巴细胞抑制实验结果

本实施例采用实施例1培养获得的人脐带间充质干细胞作为研究对象，用CCK8法检测脐带间充质干细胞对外周血单核细胞(PMBC)的抑制效果，用流式细胞术评估脐带间充质干细胞对外周血单核细胞的影响，同时分析它对免疫调节的作用。结果显示脐带间充质干细胞对淋巴细胞具有免疫调节作用，可以促进Treg细胞的生产和抑制IL-17等炎性因子的分泌。

(1)CCK8检测脐带间充质干细胞对外周血单核细胞的抑制效果

P2代脐带间充质干细胞抑制外周血单核细胞3天后的结果显示：外周血单核细胞的扩增随着脐带间充质干细胞细胞比例的增加而受到抑制，而且脐带间充质干细胞：外周血单核细胞大于1：50时，与正常对照组相比，差异具有显著性意义，P<0.001；而且外周血单核细胞的增殖情况随着脐带间充质干细胞细胞的增加而抑制作用增强，(脐带间充质干细胞:外周血单核细胞＝1:10)vs(脐带间充质干细胞:外周血单核细胞＝1：50)，P<0.05。

P5代脐带间充质干细胞抑制外周血单核细胞3天后的结果：同P2代脐带间充质干细胞的效果，外周血单核细胞的扩增随着P5代脐带间充质干细胞细胞比例的增加而受到抑制，而且脐带间充质干细胞:外周血单核细胞大于1：50时，与正常对照组相比，具有显著性差异，P<0.001；而且外周血单核细胞的增殖情况随着脐带间充质干细胞细胞的增加而抑制作用增强，(脐带间充质干细胞:外周血单核细胞＝1:10)vs(脐带间充质干细胞:外周血单核细胞＝1：50)，P<0.05。

(2)流式检测脐带间充质干细胞对外周血单核细胞细胞中IL17细胞的影响

P2代脐带间充质干细胞对Th17细胞群的影响：结果显示，脐带间充质干细胞对CD4⁺IL17⁺的细胞抑制作用随着浓度的增加而增强，而且具有显著性差异,即(脐带间充质干细胞:外周血单核细胞＝1:10)VS(脐带间充质干细胞:外周血单核细胞＝1：50)，P<0.01。

P5代脐带间充质干细胞对Th17细胞群的影响：结果显示，P5代脐带间充质干细胞对CD4⁺IL17⁺的细胞抑制作用与P2代脐带间充质干细胞效果类似，它随着脐带间充质干细胞细胞量的增加而增强。

(3)流式检测脐带间充质干细胞对外周血单核细胞细胞中Foxp3⁺CD4⁺CD25⁺细胞的影响

P2代脐带间充质干细胞对Foxp3⁺CD4⁺CD25⁺细胞群的影响：P2代脐带间充质干细胞可显著诱导Foxp3⁺CD4⁺CD25⁺细胞的生存，还随着脐带间充质干细胞细胞比例增加而增大。

P5代脐带间充质干细胞对Foxp3+CD4+CD25+细胞群的影响：本次实验P5代脐带间充质干细胞可显著诱导Foxp3⁺CD4⁺CD25⁺细胞的生存，还随着脐带间充质干细胞细胞比例增加而增大。

实施例4炎症因子刺激人脐带间充质干细胞分泌吲哚胺2,3-双加氧酶的能力检测

本实施例采用实施例1得到的人脐带间充质干细胞进行。

采用P1、P5代脐带间充质干细胞作为研究对象，用ELISA法测定脐带间充质干细胞经过TNF-α和INF-γ刺激后吲哚胺2,3-双加氧酶的表达，并评估其免疫调节作用。结果显示(图4)，P1与P5代细胞与对照组相比，刺激组的吲哚胺2,3-双加氧酶浓度均显著提高，P＜0.05；说明细胞在炎症环境中可发挥良好的免疫调节功能。说明细胞在具有良好的旁分泌功能，且P1与P5代细胞具有同等的功能。

实施例5脐带间充质干细胞完全培养基诱导人脐静脉内皮细胞血管生成实验

本实施例采用实施例1得到的人间充质干细胞进行。

采用P2、P5代脐带间充质干细胞作为研究对象，应用脐带间充质干细胞完全培养基刺激人脐静脉内皮细胞(HUVECs)血管生成的能力。结果显示在4h或8h生成环数P2与P5均显著性高于相同时间的对照组，同时间段P2与P5无显著差异；4h节点数P2及P5代细胞均显著性高于对照组，同时间段P2与P5无显著差异。

实施例6人脐带间充质干细胞对尘肺大鼠的干预和治疗效果

本实施例采用实施例1得到的人间充质干细胞进行。尘肺大鼠模型构建方法为：非暴露式气管插管内灌注二氧化硅(SiO₂)混悬液法。

对照组：正常大鼠；

模型组：模型大鼠；

干预组：在首次尘肺大鼠造模后第1天、第4天、第8天、第15天经尾静脉注射脐带间充质干细胞，细胞密度3×10⁶个/mL，注射量为0.5mL/鼠。

治疗组：在首次尘肺大鼠造模后第29天、第36天、第43天、第50天经尾静脉注射脐带间充质干细胞，细胞密度3×10⁶个/mL，注射量为0.5mL/鼠。

(1)各组大鼠肺部的CT扫描：各组大鼠在造模后第60天，第75天分别行CT扫描检查，腹腔注射麻醉大鼠后，将大鼠正常体位胶带固定于检查床。使用德国西门子SOMATOMEmotion 16层螺旋CT进行扫描。

(2)动物处理：于第一次染尘后第75天处理动物。麻醉大鼠，腹主动脉采血，放血处死。分离血清，取大鼠肺脏、心脏、肝脏、肾脏，一部分甲醛固定，一部分液氮冻存。

(3)肺脏器系数检测：各组大鼠处死后，取全肺，生理盐水清洗血污，观察肺脏大体形态。称重，按照“肺脏器系数(mg/g)＝肺湿质量(mg)/体质量(g)”计算肺脏器系数。

(4)肺脏组织病理学观察：取各组大鼠的肺组织常规制作5μm切片，分别行苏木素－伊红(Hematoxylin-Eosin，HE)和Masson染色，于光学显微镜下观察肺组织的形态学变化和胶原纤维染色情况。

(5)肺组织羟脯氨酸(HYP)水平检测：按羟脯氨酸检测试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)说明书步骤，采用碱水解法，以酶标仪在波长450nm下检测肺组织羟脯氨酸水平。计算公式为：羟脯氨酸水平(mg/g湿质量)＝(测定管光密度－对照管光密度)/(标准管光密度－空白管光密度)×标准管水平(5mg/L)×水解液总体积(10mL)/组织湿质量(mg)。

(6)ELISA法检测大鼠肺组织TGF-β1及血清IL-6水平：按照ELISA检测试剂盒说明书的双抗夹心法实验步骤，以酶标仪在波长450nm下检测肺组织中TGF-β及血清IL-6水平。

结果分析

(1)肺脏大体观察可见对照组大鼠肺脏外观正常，表明光滑，肺组织呈粉红色，色泽均匀；模型组肺组织表面可见散在灰白色斑点，质地较韧，切开有磨砂感，干预组和治疗组肺组织可见灰白色斑点，与模型组相比，明显减少。

(2)各组大鼠肺部病理检查

肺组织HE染色显示对照组显示正常肺组织结构，模型组20例均有明显的病理学改变。对照组肺泡结构完整，无明显炎症细胞浸润、水肿及纤维增生，血管壁无增厚。与对照组比较，模型组肺组织病理学改变明显：可见各种炎性细胞浸润，肺泡腔内大量渗出液，肺泡壁增厚，肺间质充血，出现细胞性结节(肉芽肿)，部分结节中心出现纤维化，或有大小不等的细胞性结节与纤维性结节同时存在，可见结节逐渐增大融合，甚至成片，正常肺泡结构明显减少。可见部分肺泡、细支气管或间质内双折光二氧化硅颗粒。干预组和治疗组大鼠肺泡结构轻度破坏，正常肺泡结构增多，肺泡上皮轻度增厚，偶见散在细胞性结节。Masson染色结果显示，对照组大鼠肺组织见正常少量蓝染胶原纤维支架；模型组大鼠肺组织见大量蓝染的胶原纤维沉着；干预组和治疗组大鼠肺组织仅见少量蓝色胶原纤维。

(3)各组大鼠肺部CT扫描：对照组呈正常影像学表现，显示肺野清晰透明，可见较大支气管或较大血管形成纹理影，走行自然光滑，无增粗，肺实质内密度均匀，未见局部增高或减低区。模型组主要表现为肺部弥漫性云雾片状高密度影，可见肺纹理粗糙，肺间质可见磨砂样细颗粒高密度影。干预组和治疗组可见肺部弥漫性云雾片状影范围有所减少，密度减轻，肺纹理增粗减轻，肺野清晰度增加。

(4)空白组、模型组、干预组和治疗组大鼠(每组12只)肺脏器系数、肺组织羟脯氨酸和TGF-β1及血清IL-6水平：模型组大鼠脏器系数、肺组织羟脯氨酸水平和TGF-β，血清IL-6水平均显著高于对照组(各组肺脏器系数分别为2.45±0.31、8.54±0.47、5.87±0.82和5.64±0.34)，干预组及治疗组大鼠上述4个指标均低于模型组，差异均具有统计学意义，干预组与治疗组相比差异无统计学意义。