(s)-3-硫代吗啉甲酸促进脐带间充质干细胞增殖的用途、脐带间充质干细胞培养基
阅读说明：本技术 (s)-3-硫代吗啉甲酸促进脐带间充质干细胞增殖的用途、脐带间充质干细胞培养基 (Application of (S) -3-thiomorpholine formic acid in promoting proliferation of umbilical cord mesenchymal stem cells and umbilical cord mesenchymal stem cell culture medium ) 是由 于海涛 杨晓旭 李响 于 2020-05-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了(S)-3-硫代吗啉甲酸促进脐带间充质干细胞增殖的用途、脐带间充质干细胞培养基。本发明发现,(S)-3-硫代吗啉甲酸具有促进UC-MSCs增殖的作用,在培养基中添加适量(S)-3-硫代吗啉甲酸可以显著提高UC-MSCs的增殖率,且培养增殖后的UC-MSCs依然具有高纯度,不会被诱导分化。(S)-3-硫代吗啉甲酸促进UC-MSCs增殖的作用可能与Notch1通路有关。(S)-3-硫代吗啉甲酸具有开发成脐带间充质干细胞体外增殖培养基的前景。(The invention discloses application of (S) -3-thiomorpholine formic acid in promoting proliferation of umbilical cord mesenchymal stem cells and an umbilical cord mesenchymal stem cell culture medium. The invention discovers that (S) -3-thiomorpholine formic acid has the effect of promoting the proliferation of UC-MSCs, the proliferation rate of the UC-MSCs can be obviously improved by adding a proper amount of (S) -3-thiomorpholine formic acid into a culture medium, and the UC-MSCs after being cultured and proliferated still have high purity and cannot be induced to differentiate. The effect of (S) -3-thiomorpholinoic acid on promoting proliferation of UC-MSCs may be related to the Notch1 pathway. The (S) -3-thiomorpholine formic acid has the prospect of being developed into an in-vitro proliferation culture medium of umbilical cord mesenchymal stem cells.)
技术领域
本发明涉及干细胞领域，具体涉及(S)-3-硫代吗啉甲酸体外促进脐带间充质干细胞增殖的用途、脐带间充质干细胞培养基。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是目前最有前景的种子细胞。MSCs作为一类具有自我更新和多向分化潜能的未分化细胞，因其具有自我更新复制和多向分化潜能，已被证明具有强大的修复再生损伤组织的能力。MSCs的主要作用机制包括：迁移定植于损伤部位、分化再生损伤的组织细胞，分泌细胞生长因子、营养局部组织、刺激内源性干细胞活化，分泌免疫调节和炎症抑制因子、降低局部炎性反应、保护组织细胞等。
在多种MSCs中，脐带间充质干细胞(UC-MSCs)又是一种更为理想的选择：与骨髓间充质干细胞相比，脐带间充质干细胞取材简单、自我更新快；与胚胎干细胞相比，脐带间充质干细胞的来源没有伦理争议，不涉及伦理问题。
促进脐带间充质干细胞应用的一个重要方面就是如何促进其体外快速扩增。
Notch信号通路由Notch受体、Notch配体(DSL蛋白)、转录因子CSL(一类DNA结合蛋白)和下游效应物组成。现有研究表明，Notch信号通路在促进细胞增殖中有重要的调控作用，Notch1表达上调后具有促进UC-MSCs细胞增殖的作用。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种(S)-3-硫代吗啉甲酸体外促进脐带间充质干细胞增殖的用途，和促进脐带间充质干细胞体外增殖的培养基。
实现上述目的的技术方案如下：
一种(S)-3-硫代吗啉甲酸用于体外促进脐带间充质干细胞增殖的用途。
一种(S)-3-硫代吗啉甲酸用于制备脐带间充质干细胞体外增殖培养基的用途。
一种脐带间充质干细胞的体外增殖培养基，含有(S)-3-硫代吗啉甲酸。
进一步地，还含有胎牛血清等。
有益效果：
本发明发现，(S)-3-硫代吗啉甲酸具有促进UC-MSCs增殖的作用，在培养基中添加适量(S)-3-硫代吗啉甲酸可以显著提高UC-MSCs的增殖率，且培养增殖后的UC-MSCs依然具有高纯度，不会被诱导分化。(S)-3-硫代吗啉甲酸促进UC-MSCs增殖的作用可能与Notch1通路有关。(S)-3-硫代吗啉甲酸具有开发成脐带间充质干细胞体外增殖培养基的前景。
附图说明
图1为第5代UC-MSCs的流式鉴定结果；
图2为各组UC-MSCs的体外增殖率；
图3为Western Blot测定结果。
具体实施方式
实施例1：
一、试验材料
脐带取自江苏省妇幼保健院妇产科，经产妇同意后取足月剖宫产后新生儿完整脐带，保存PBS溶液中，4℃保存，12h内进行UC-MSCs分离培养。
DMEM/F12培养基、胎牛血清购自Gibco公司。
不同萤光素标记的抗体购自Beckman产品。
二、试验方法
1、UC-MSCs分离、培养、传代与鉴定
取新生儿脐带，在无菌操作环境下，用含1％青霉素/链霉素的的PBS反复冲洗，保留沃顿胶，剪碎后均匀分散平铺于培养皿中，加入含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，在37℃、5％CO2的培养箱中培养，每2～3天换液1次，待细胞克隆长至约85％融合时，用0.25％胰蛋白酶消化并传代，反复传代培养至第5代UC-MSCs备用。
UC-MSCs的鉴定采用流式法，具体为：取生长状态良好的第5代UC-MSCs，PBS洗涤，制备成细胞悬液，分装，分别加入适量不同萤光素标记的CD105、CD90、CD44、CD73、CD19、CD34、CD45、HLA-DR单抗，轻微振荡混匀，避光室温孵育0.5h，PBS洗涤后重悬，上样于流式细胞仪，检测分析表面标记物的阳性表达率。
按常规方法冻存于液氮中，使用时按照常规方法复苏。
2、UC-MSCs体外增殖活性测定
取生长状态良好的第5代UC-MSCs，消化重悬制成细胞密度为1×105/mL的细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔90μL，并加入10μL不同浓度(S)-3-硫代吗啉甲酸的药物溶液，使(S)-3-硫代吗啉甲酸的终浓度为1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL，每个浓度设3个复孔，并设不加药培养的细胞为对照组(仅加入10μL溶解药物的溶剂)，另设不含细胞的培养液为空白组(仅加入10μL溶解药物的溶剂)，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的恒温培养箱中培养48h后，每孔加入10μL的CCK8试剂，孵育4h后在酶联免疫检测仪450nm波长处测定每孔OD450值，取3孔平均值，按如下公式测算增殖率，对照组增殖率按100％计。
增殖率(％)＝(OD药物组－OD空白组)/(OD对照组－OD空白组)×100％。
平行操作三份。
3、UC-MSCs中蛋白表达水平测定
取生长状态良好的第5代UC-MSCs，消化重悬制成细胞密度为1×105/mL的细胞悬液，接种于细胞培养瓶中，并加入(S)-3-硫代吗啉甲酸溶液使(S)-3-硫代吗啉甲酸的终浓度为1μg/mL(低浓度)、4μg/mL(高浓度)，并设不加药培养的细胞为对照组(仅加入等体积药物溶剂)，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的恒温培养箱中培养48h，收集细胞，加入细胞裂解液混匀后冰上裂解40min，离心收集上清，BCA法检测蛋白浓度。取40μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜、封闭后，加入兔抗人Notch1、兔抗人β-Actin一抗，于4℃孵育过夜，次日加入相应的二抗，室温避光孵育120min，PBST洗去未结合的二抗，用化学发光显色后进行图像分析，采用Image J软件对显影的条带进行灰度分析。
4、UC-MSCs增殖后的纯度测定
取生长状态良好的第5代UC-MSCs，消化重悬制成细胞密度为1×105/mL的细胞悬液，接种于细胞培养瓶中，并加入(S)-3-硫代吗啉甲酸溶液使(S)-3-硫代吗啉甲酸的终浓度为1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的恒温培养箱中培养48h，收集细胞，PBS洗涤，制备成细胞悬液，分装，分别加入适量不同萤光素标记的CD105、CD90、CD44、CD73、CD19、CD34、CD45、HLA-DR单抗，轻微振荡混匀，避光室温孵育0.5h，PBS洗涤后重悬，上样于流式细胞仪，检测分析表面标记物的表达率。
5、统计学分析
采用软件SPSS 17.0进行统计学分析处理，计量数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
三、试验结果
1、UC-MSCs分离、培养、传代与鉴定结果
第5代UC-MSCs的流式鉴定结果如表1和图1所示，CD73、CD90、CD105阳性表达率均不低于98％，CD34、CD14、CD45、CD19、HLA-DR阳性表达率均不高于2％，符合UC-MSCs表面免疫标志物特征，可以用于后续实验。
表1第5代UC-MSCs的流式鉴定结果
表面标志蛋白类型
阳性表达率(％)
CD73
99.4
CD90
99.1
CD105
99.6
CD34
0.2
CD14
0.1
CD45
0.1
CD19
0.3
HLA-DR
0.2
2、UC-MSCs体外增殖活性测定结果
各组UC-MSCs的体外增殖率如表2和图2所示，从该结果可以看出，不同浓度的(S)-3-硫代吗啉甲酸均可以显著促进UC-MSCs的体外增殖，且具有明显的浓度-增殖关联效应。
表2各组UC-MSCs的体外增殖率
组别
体外增殖率(％)
对照组
100.0±3.7
药物组(1μg/mL)
145.5±4.3
药物组(2μg/mL)
196.4±4.9
药物组(4μg/mL)
285.2±4.8
3、UC-MSCs中蛋白表达水平测定
Western Blot测定结果如图3所示，该结果显示，与对照组相比，高浓度(S)-3-硫代吗啉甲酸可以显著促进UC-MSCs中Notch1蛋白的表达。
4、UC-MSCs增殖后的纯度测定
UC-MSCs增殖后的纯度测定结果如表3所示，流式结果显示，UC-MSCs经不同浓度的(S)-3-硫代吗啉甲酸体外培养48h后，CD73、CD90、CD105阳性表达率依然均不低于98％，CD34、CD14、CD45、CD19、HLA-DR阳性表达率依然均不高于2％，这说明UC-MSCs经(S)-3-硫代吗啉甲酸干预培养后依然能维持良好的干细胞特性，未被诱导分化。
表3第5代UC-MSCs增殖后的的流式鉴定结果
上述实施例说明，(S)-3-硫代吗啉甲酸具有促进UC-MSCs增殖的作用，在培养基中添加适量(S)-3-硫代吗啉甲酸可以显著提高UC-MSCs的增殖率，且培养增殖后的UC-MSCs依然具有高纯度，不会被诱导分化。(S)-3-硫代吗啉甲酸促进UC-MSCs增殖的作用可能与Notch1通路有关。(S)-3-硫代吗啉甲酸具有开发成脐带间充质干细胞体外增殖培养基的前景。
实施例2：
一种UC-MSCs的体外增殖培养基，通过在DMEM/F12培养基中添加适量(S)-3-硫代吗啉甲酸制备而成，还可以添加适量胎牛血清。(S)-3-硫代吗啉甲酸可以在生产培养基时加入，也可以在临用前将适量(S)-3-硫代吗啉甲酸添加于DMEM/F12培养基中。