阅读说明：本技术 一种固定化酶连续制备[14/15n]-l-瓜氨酸的方法 (Continuous preparation of immobilized enzyme14/15N]Method for producing L-citrulline ) 是由 黄钢 李斌 于 2020-04-23 设计创作，主要内容包括：本申请公开了一种固定化酶连续制备[<Sup>14/</Sup><Sup>15</Sup>N]-L-瓜氨酸的方法,属于酶学与酶工程技术领域。其方法是将包含固定化酶的融合蛋白悬浮于填充床反应器；再将包含[<Sup>14/15</Sup>N]-L-精氨酸的溶液在20-55℃条件下,以流速0.3-0.5BV/h流经填充床反应器进行反应,反应液经分离、纯化即可得到[14/15N]-L-瓜氨酸。本发明的技术构思是采用cipA固定化融合蛋白为载体将精氨酸脱亚胺酶arc固定于包涵体蛋白cipA上,产生具有催化活性的包涵体蛋白cipA-arc,即cipA-arc融合蛋白。本申请提供的具有催化活性的固定化cipA-精氨酸脱亚胺酶cipA-arc融合蛋白,能连续反应560小时以上；同时得到的具有同位素标记的[<Sup>14/15</Sup>N]L-瓜氨酸,为前列腺疾病、心血管疾病等的诊断与治疗提供了有效途径。(The application discloses a continuous preparation of immobilized enzyme 14/ 15 N]A method of-L-citrulline, belonging to the technical field of enzymology and enzyme engineering. The method is that the fusion protein containing the immobilized enzyme is suspended in a packed bed reactor; then will comprise 14/15 N]The solution of-L-arginine flows through a packed bed reactor at the flow rate of 0.3-0.5BV/h for reaction at the temperature of 20-55 ℃, and the reaction solution is separated and purified to obtain the [14/15N]-L-citrulline. The invention adopts the technical conception that the cipA immobilized fusion protein is used as a carrier to fix arginine deiminase arc on the inclusion body protein cipA, and the inclusion body protein cipA-arc with catalytic activity, namely the cipA-arc fusion protein, is generated. The application provides an immobilized cipA-arginine deiminase cipA-arc fusion protein with catalytic activityWhite, and can continuously react for more than 560 hours; simultaneously obtaining the product with isotope labeling 14/15 N]The L-citrulline provides an effective way for diagnosing and treating prostate diseases, cardiovascular diseases and the like.)

一种固定化酶连续制备[14/15N]-L-瓜氨酸的方法

技术领域

本申请涉及一种生产高纯度[^14/15N]-L-瓜氨酸的方法，尤其是一种利用重组精氨酸脱亚胺酶分解[^14/15N]-L-精氨酸生产高纯度[^14/15N]-L-瓜氨酸的方法，属于酶学与酶工程技术领域。

背景技术

L-瓜氨酸(L-citrulline)是一种特殊氨基酸。参与体内多种代谢过程，如清除自由基，异体排斥效应指示剂，血管舒张作用，稳定血压以及诊断类风湿关节炎，抗氧化等，防止前列腺疾病和提高性功能，抗衰老以及增强免疫力等，应用前景十分广阔。

生产L-瓜氨酸的方法有：化学法、发酵法、酶法。化学法是指在碱性条件下水解L-精氨酸得L-瓜氨酸，水解过程控制比较困难，产品中含有旋光对映体D-瓜氨酸，影响产品质量，而且生产过程中产生大量废水，污染环境；发酵法生产的难点在于单位体积L-瓜氨酸产率低，从发酵液中提取L-瓜氨酸操作工艺复杂，收率低，成本高；酶法生产是指在精氨酸脱亚胺酶的作用下，L-精氨酸被转化为L-瓜氨酸，该法具有专一性强，产品浓度高的优点，但这种方法也存在催化剂利用率不高，即每一次生产后都得重新发酵制备菌体，这不但需要消耗大量的原料，而且会产生大量的废水，增加环保处理成本；以及由酶催化剂带入反应体系的杂质(大量的菌体、蛋白和发酵液残留的各种金属离子等杂质)，导致在L-瓜氨酸后处理过程中，产物分离纯化要经过一系列的除菌体、除蛋白和离交柱等工艺步骤，进一步增加生产成本。

由于化学法、发酵法或酶法生产L-瓜氨酸均有许多缺点，导致生产成本高居不下，给实际推广应用带来了很大困难。

为了克服这些问题，提出了固定化酶或细胞的解决方案，固定化酶或细胞的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应，整体结构保持不变，酶的催化活性得到很好保留。但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。化学法包括结合法、交联法。化学法酶与载体之间结合紧密，不易脱落，稳定性好，但反应条件激烈，操作复杂，控制条件苛刻，活力损失较大。

2008年郑璞(郑璞，倪晔，张文.填充床反应器中固定化假单胞菌细胞连续制备L-瓜氨酸[J].食品与生物技术学报，2008，27(5)：1673-1689)等报道了填充床反应器中固定化假单胞菌细胞连续制备L-瓜氨酸可在0.0108g·(h.g)^-1(每小时每克细胞产生的瓜氨酸克数)条件下进行连续54d运转，但是菌体发酵生产过程复杂，而且固定化细胞时间过长，底物浓度低，产量不高，固定化细胞虽然简单，但仍然存在胞体破碎释放菌体中的杂蛋白及其它有机物质的问题，增加了反应体系中产物的分离纯化的难度，而且细胞固定化也增加操作的步骤，增大了生产成本。

发明内容

根据本申请的第一方面，提供了一种固定化酶连续制备[^14/15N]-L-瓜氨酸的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将包含固定化酶的融合蛋白悬浮于填充床反应器；

(2)将包含[^14/15N]-L-精氨酸的溶液在20-55℃条件下，以流速0.3-0.5BV/h流经填充床反应器。

可选地，步骤(1)中所述包含固定化酶的融合蛋白步骤(1)中所述包含固定化酶的融合蛋白为9000-12000U，优选为10000U，所述步骤(2)中包含[^14/15N]-L-精氨酸的溶液中[^14/15N]-L-精氨酸的浓度为1.0-2.5mol/L。

可选地，步骤(1)中所述填充床反应器为径高比为15-40，体积为450-2000mL的玻璃柱。

可选地，所述包含[^14/15N]-L-精氨酸的溶液中[^14/15N]-L-精氨酸的浓度为1.0-2.5mol/L。

可选地，步骤(1)中所述包含固定化酶的融合蛋白为采用cipA为载体将精氨酸脱亚胺酶arc固定于包涵体蛋白cipA上得到的具有催化活性的包涵体蛋白cipA-arc，即cipA-arc融合蛋白。

可选地，所述cipA-arc融合蛋白由以下步骤制备：

(1)制备谷氨酸棒杆菌感受态细胞；

(2)采用重组质粒pXMJ19-cipA-arc电击转化步骤(1)所述的谷氨酸棒杆菌感受态细胞，得到重组菌；

(3)将步骤(2)所述得到的重组菌经基因工程菌诱导表达得到的重组菌体全细胞，经超声破碎、离心后，所得的沉淀即为cipA-arc融合蛋白。

可选地，所述谷氨酸棒杆菌感受态细胞由如下方法制备：

将谷氨酸棒杆菌ATCC13032在含LBG固体培养基中培养后，挑取新鲜菌株接种于LBG液体培养基中，经培养后按0.8-1.5％的接种量将活化菌液转接至LBG培养基中，继续培养至OD600为0.8-1.0；将菌液经冰水混合物预冷、离心，吸出上清液后加入甘油，吹吸至菌体悬浮，再次经离心、吸出上清液后加入甘油，吹吸至菌体悬浮，即可得到谷氨酸棒杆菌感受态细胞。

作为优选方案，将谷氨酸棒杆菌ATCC13032划线于含LBG固体培养基的平板中，于培养箱培养，待菌体长出挑取新鲜菌株接种于LBG液体培养基中，于温度为20-40℃转速为150-300r/min摇床中培养12-24h；按1％接种量将活化菌液转接至LBG培养基中，于温度为20-40℃转速为150-300r/min摇床中培养至OD600约为0.9；将菌液置于冰水混合物中预冷15-20min，再于超净台中将预冷的菌液分装至灭菌的离心管中，4℃6000g离心30s，冰水放置2min；将离心管中的上清液吸出，向离心管中各加入预冷的10％甘油，用移液枪缓慢吹吸至菌体悬浮；悬浮液于4℃6000g离心30s，将离心管中的上清液吸出，向离心管中加入预冷的10％甘油，用移液枪缓慢吹吸至菌体悬浮。

可选地，所述培养的温度均为30℃；所述培养时的转速均为200r/min。

可选地，所述重组质粒pXMJ19-cipA-arc电击转化感受态细胞由如下方法制备：

取谷氨酸棒杆菌感受态细胞和重组质粒pXMJ19-cipA-arc混匀，冰上冷却后，在相同温度条件下，以电击条件为电压1-5kV，电击1-10ms；再在室温下加入LBG液体培养基，转移到离心管中，经振荡培养后取所得液体涂布于含氯霉素抗性平板，挑选单菌落提取质粒，再通过双酶切、PCR确认目的片段的插入，得到的重组菌接种。

作为优选方案，取感受态细胞和重组质粒pXMJ19-cipA-arc混匀，冰上冷却10min；迅速加入冰冷的电击杯电击，电击条件为电压2-4kV，时间3-7ms；脉冲结束后尽快取出电击杯，室温下加入LBG液体培养基，转移到离心管中轻柔振荡培养2h，取所得液体涂布于含20μg/mL氯霉素抗性平板；挑选单菌落提取质粒，再通过双酶切或PCR确认目的片段的插入。

可选地，所述电击的电压为2.5kV；所述电击的时间为5ms。

可选地，其特征在于，所述基因工程菌的诱导表达方法如下：

将重组菌接种于含氯霉素的LBG培养基中，经摇床培养至菌体OD600值达到0.8-1.0时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，经诱导过夜后离心收集重组菌体全细胞，用Tris-HCl缓冲液洗涤菌体后重悬于磷酸缓冲液，超声破碎细胞后再次离心，沉淀即为获得的cipA-arc融合蛋白。

作为优选方案，将鉴定成功的重组菌接种于含终浓度为20μg/mL氯霉素的LBG培养基中，培养温度设置为20-40℃，摇床转速150-300r/min，培养至菌体OD600值达到0.9时加入终浓度为1mM的IPTG，于温度20-40℃，转速150-300r/min条件下诱导过夜；4℃离心收集重组菌体细胞，用缓冲液洗涤菌体后重悬于另一缓冲液，超声破碎细胞后再次于4℃离心，沉淀即为获得的cipA-arc融合蛋白。

可选地，所述培养和所述诱导的温度均为30℃；所述培养时的转速为200r/min；所述诱导时的转速为180r/min。

可选地，所述洗涤的缓冲液为Tris-HCl；所述重悬的另一缓冲液为磷酸缓冲液；

优选地，所述Tris-HCl的pH值为7.0；

优选地，所述磷酸缓冲液的pH值为6.5。

可选地，所述基因工程菌中表达精氨酸脱亚胺酶。

可选地，所述基因工程菌由以下方法构建：

1)将cipA基因序列在DNA5’端引入HindIII位点，3’端引入SalI位点，得到基因序列为SEQ ID NO.1的片段，合成的片段经过测序后，用HindIII/SalI双酶切目标基因和表达载体pXMJ19，酶切产物经过凝胶回收后，将目标片段和载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得阳性转化子pXMJ19-cipA；

2)将arc基因序列在DNA5’端引入XhoI位点，3’端引入SacI位点，得到基因序列为SEQ ID NO.2的片段，合成的片段经过测序后，用XhoI/SacI双酶切目标基因和表达载体pXMJ19-cipA，酶切产物经过凝胶回收后，将目标片段和载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得阳性转化子pXMJ19-cipA-arc，即为含精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌。

所述的含精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌保藏名称为谷氨酸棒杆菌SUMHS-2020.01，分类命名为Corynebacterium glutamicum，该菌株已于2020年1月17日保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏中心的保藏编号为CGMCC No.19404。

本发明的又一技术方案是将所述的含精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌中表达精氨酸脱亚胺酶。

可选地，所述包含[^14/15N]-L-精氨酸的溶液还包含醋酸铵缓冲溶液、甲酸铵缓冲溶液、氯化铵水溶液、碳酸氢铵水溶液或水溶液。

优选地，所述包含[^14/15N]-L-精氨酸的溶液还包含醋酸铵缓冲溶液、甲酸铵缓冲溶液、氯化铵水溶液或碳酸氢铵水溶液。

可选地，所述醋酸铵缓冲溶液的浓度为0.2mol/L，pH为6.0；所述甲酸铵缓冲溶液的浓度为0.2mol/L，pH为6.0；所述氯化铵水溶液的浓度为0.3mol/L，pH为4.5；所述碳酸氢铵水溶液的浓度为0.3mol/L，pH为8.5；所述水溶液的pH为7.5。

可选地，所述方法还包括[^14/15N]-L-瓜氨酸的分离纯化。

可选地，所述分离纯化步骤如下：

1)收集填充床反应器流出的反应液，通过纳滤脱除缓冲盐，返回反应体系，循环使用，收集产物浓缩液；

2)把经过第1)步骤后的反应液真空减压浓缩、结晶、干燥，得到白色粉末状固体，即为纯度为99.5％以上的[^14/15N]-L-瓜氨酸。

本申请中，“cipA基因序列”，是指Kirsten Jung等(Wang Y,Heermann R,JungK.CipA and CipB as Scaffolds To Organize Proteins into Crystalline Inclusions[J].ACS Synthetic Biology,2017,6,826-836)报道的cipA基因序列。

本申请中，“arc基因序列”，是指Kim等(Kim J E,Jeong D W,Lee HJ.Expression,purification,and characterization of arginine deiminase fromLactococcus lactis ssp.lactis ATCC 7962in Escherichia coli BL21[J].ProteinExpression and Purification,2007,53(1):0-15)报道的精氨酸脱亚胺酶(arc)基因序列。

本申请中，“pXMJ19”，是指在谷氨酸棒杆菌中携带基因表达蛋白的载体。

本申请能产生的有益效果包括：

1)本申请中合成并克隆了精氨酸脱亚胺酶的基因，构建了一种高产精氨酸脱亚胺酶工程菌，在谷氨酸棒杆菌中表达出精氨酸脱亚胺酶；

2)本申请将精氨酸脱亚胺酶固定于包涵体蛋白cipA上，产生具有催化活性的包涵体蛋白cipA-arc(即cipA-arc融合蛋白)，该固定化方式简单，快捷，成本低，效率高，使用方便；

3)本申请提供的具有催化活性的固定化cipA-精氨酸脱亚胺酶(cipA-arc)融合蛋白，能连续反应560小时以上；

4)本申请提供的包涵体蛋白cipA-arc即arc-cipA固定化融合蛋白能催化[^14/15N]-L-精氨酸转化为[^14/15N]-L-瓜氨酸，通过固定床反应器，后处理简单，产物分离纯化方便，成本低，易于放大生产，为酶法制备[^14/15N]-L-瓜氨酸增加了一条新途径；

5)本申请提供的同位素标记的[^14/15N]L-瓜氨酸，为前列腺疾病、心血管疾病等的诊断与治疗提供了有效途径。

具体实施方式

下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。

如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过购买自探索平台，其中质粒pXMJ19购自武汉淼灵生物科技有限公司。

谷氨酸棒杆菌ATCC13032购自广东省微生物保藏中心。

[^14/15N]-L-瓜氨酸测定方法：采用HPLC测定产物[^14/15N]-L-瓜氨酸，色谱柱C18，5μm，250mm×4.6mm；流动相为5％的甲醇；流速1mL/min；检测波长290nm；柱温为室温。

cipA-精氨酸脱亚胺酶酶活定义:在37℃、pH 6.0的条件下，每分钟催化[^14/15N]-L-精氨酸转化生成1μmol的[^14/15N]-L-瓜氨酸的酶量定义为一个单位酶活力((1U)。

比酶活定义：每mg蛋白里包含的酶活数量(U/mg)。蛋白质浓度采用Bradford法测定。

根据本申请的一种实施方式，主要包括：1)化学合成目的基因(cipA、arc)；2)将合成好的cipA、arc连续与载体pXMG19连接，构建表达载体pXMJ19-cipA-arc；3)将pXMJ19-cipA-arc通过电转化法导入谷氨酸棒杆菌ATCC13032中；4)诱导表达并分离包涵体蛋白cipA-arc(即cipA-arc融合蛋白)；5)利用包涵体蛋白cipA-arc在填充床反应器中连续催化精氨酸合成[^14/15N]-L-瓜氨酸。

本申请的实施例中，[^14/15N]L-瓜氨酸转化率基于碳摩尔数进行计算。

实施例1含精氨酸脱亚胺酶基因工程菌的构建

1.1根据Kirsten Jung等(2017)报道的cipA基因序列化学合成按照谷氨酸棒杆菌密码子偏好性优化的编码区DNA。化学合成由苏州金唯智生物科技公司完成。cipA基因序列如下：

ATGATCAACGACATGCACCCATCCCTGATCAAGGACAAGGACATGATGGACGACGTTATGCTGCGCTCCTGCAAGATCATCGCTATGAAGATCATGCCAGACAAGGTTATGCAGGTTATGGTTACCGTTCTGATGCTGGACGGCACCTCCGAGGAGATGCTGCTGAAGTGGAACCTGCTGGACAACCGCGGCATGGCTATCTACAAGGTTCTGATGGAGGCTCTGTGCGGCAAGAAGGACGTTAAGATCGGCACCGTTGGCAAGGTTGGCCCACTGGGCTGCGACTACATCAACTGCGTTGAGATCTCCATG

合成的基因序列(SEQ ID NO.1)在DNA5’端引入HindIII位点，3’端引入SalI位点，合成的片段经过测序后，用HindIII/SalI双酶切目标基因和表达载体pXMJ19(生物风)，酶切产物经过凝胶回收后，将目标片段和载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得阳性转化子鉴定成功后命名为pXMJ19-cipA。

1.2根据Kim等(2007)报道的精氨酸脱亚胺酶(arc)基因序列化学合成按照谷氨酸棒杆菌密码子偏好性优化的编码区DNA。化学合成由苏州金唯智生物科技公司完成。arc基因序列如下：

ATGAACAACGGCATCAACGTTAACTCCGAGATCGGCAAGCTGAAGTCCGTTCTGCTGCACCGCCCAGGCGCTGAGGTTGAGAACATCACCCCAGACACCATGAAGCAGCTGCTGTTCGACGACATCCCATACCTGAAGATCGCTCAGAAGGAGCACGACTTCTTCGCTCAGACCCTGCGCGACAACGGCGCTGAGACCGTTTACATCGAGAACCTGGCTACCGAGGTTTTCGAGAAGTCCTCCGAGACCAAGGAGGAGTTCCTGTCCCACCTGCTGCACGAGGCTGGCTACCGCCCAGGCCGCACCTACGACGGCCTGACCGAGTACCTGACCTCCATGTCCACCAAGGACATGGTTGAGAAGATCTACGCTGGCGTTCGCAAGAACGAGCTGGACATCAAGCGCACCGCTCTGTCCGACATGGCTGGCTCCGACGCTGAGAACTACTTCTACCTGAACCCACTGCCAAACGCTTACTTCACCCGCGACCCACAGGCTTCCATGGGCGTTGGCATGACCATCAACAAGATGACCTTCCCAGCTCGCCAGCCAGAGTCCCTGATCACCGAGTACGTTATGGCTAACCACCCACGCTTCAAGGACACCCCAATCTGGCGCGACCGCAACCACACCACCCGCATCGAGGGCGGCGACGAGCTGATCCTGAACAAGACCACCGTTGCTATCGGCGTTTCCGAGCGCACCTCCTCCAAGACCATCCAGAACCTGGCTAAGGAGCTGTTCGCTAACCCACTGTCCACCTTCGACACCGTTCTGGCTGTTGAGATCCCACACAACCACGCTATGATGCACCTGGACACCGTTTTCACCATGATCAACCACGACCAGTTCACCGTTTTCCCAGGCATCATGGACGGCGCTGGCAACATCAACGTTTTCATCCTGCGCCCAGGCAAGGACGACGAGGTTGAGATCGAGCACCTGACCGACCTGAAGGCTGCTCTGAAGAAGGTTCTGAACCTGTCCGAGCTGGACCTGATCGAGTGCGGCGCTGGCGACCCAATCGCTGCTCCACGCGAGCAGTGGAACGACGGCTCCAACACCCTGGCTATCGCTCCAGGCGAGATCGTTACCTACGACCGCAACTACGTTACCGTTGAGCTGCTGAAGGAGCACGGCATCAAGGTTCACGAGATCCTGTCCTCCGAGCTGGGCCGCGGCCGCGGCGGCGCTCGCTGCATGTCCCAGCCACTGTGGCGCGAGGACCTGTAA

合成的基因序列(SEQ ID NO.2)在DNA5’端引入XhoI位点，3’端引入SacI位点，合成的片段经过测序后，用XhoI/SacI双酶切目标基因和表达载体pXMJ19-cipA，酶切产物经过凝胶回收后，将目标片段和载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得阳性转化子鉴定成功后命名为pXMJ19-cipA-arc，即为含精氨酸脱亚胺酶基因工程菌。

所述的含精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌保藏名称为谷氨酸棒杆菌SUMHS-2020.01，分类命名为Corynebacterium glutamicum，该菌株已于2020年1月17日保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏中心的保藏编号为CGMCC No.19404。

实施例2融合蛋白cipA-arc表达

2.1谷氨酸棒杆菌感受态细胞的制备

将谷氨酸棒杆菌ATCC13032划线于含LBG固体培养基的平板中，于300C培养箱培养，待菌体长出挑取新鲜菌株接种于LBG液体培养基中，于温度为30℃转速为200r/min摇床中培养12-24h。按1％接种量将活化菌液转接至LBG培养基中，于温度为30℃转速为200r/min摇床中培养至OD600约为0.9。将菌液置于冰水混合物中预冷15-20min，再于超净台中将预冷的菌液分装至灭菌的50mL离心管中，4℃6000g离心30s，冰水放置2min。将离心管中的上清液吸出，快速向离心管中各加入2.5mL预冷的10％甘油，用移液枪缓慢吹吸至菌体悬浮。悬浮液于4℃6000g离心30s，将离心管中的上清液吸出，快速向离心管中加入500μL预冷的10％甘油，用移液枪缓慢吹吸至菌体悬浮，并重复此操作三次，即可得到谷氨酸棒杆菌感受态细胞。

2.2重组质粒pXMJ19-cipA-arc电击转化感受态细胞

取80μL感受态细胞和2μL重组质粒pXMJ19-cipA-arc混匀，冰上冷却10min；迅速加入冰冷的电击杯电击，电击条件为电压2.5kV，时间5ms。脉冲结束后尽快取出电击杯，室温下加入lmL的LBG液体培养基，转移到离心管中30℃轻柔振荡培养2h，取200μL涂布于含20μg/mL氯霉素抗性平板。挑选单菌落提取质粒，再通过双酶切或PCR确认目的片段的插入。

2.3基因工程菌的诱导表达

将鉴定成功的重组菌接种于含终浓度为20μg/mL氯霉素的LBG培养基中，培养温度设置为30℃，摇床转速200r/min，培养至菌体OD600值达到0.9时加入终浓度为1mM的IPTG，于30℃，转速180r/min条件下诱导过夜。4℃离心收集重组菌体全细胞，用50mM的pH 7.0的Tris-HCl洗涤菌体两次后重悬50mM的pH 6.5的磷酸缓冲液，超声破碎细胞后再次于4℃离心，沉淀即为获得的包涵体蛋白cipA-arc(即cipA-arc融合蛋白)。

2.4分光光度法测定cipA-arc融合蛋白活性

利用L-瓜氨酸在强酸性溶液中与二乙酰一肟的专一性显色反应及反应复合物在490nm处吸光度与L-瓜氨酸浓度呈线性关系来测定cipA-精氨酸脱亚胺酶融合蛋白的酶活。配制含终浓度200mM的[^14/15N]-L-精氨酸的底物缓冲液((pH 6.0,50mM磷酸盐缓冲液)，取2.8mL底物溶液，加入0.2mL酶液，37℃反应10min。将酶反应液稀释适当的倍数(10-100倍)，取2mL稀释后的反应液，加入3mL混合酸(体积比H₂SO₄:H₃PO₄＝1:3)溶液，0.5二乙酰-肟、氨基硫脲混合液，摇匀，立即沸水浴10min，测定其530nm处的吸光度值。cipA-精氨酸脱亚胺酶融合蛋白酶活定义:在37℃、pH 6.0的条件下，每分钟催化[^14/15N]-L-精氨酸转化生成1μmol瓜氨酸的酶量定义为一个单位酶活力((1U)，融合蛋白酶活力为10000U。比酶活定义:每mg蛋白里包含的酶活数量(U/mg)。蛋白质浓度采用Bradford法测定。

实施例3融合蛋白cipA-arc表达

除步骤2.1中的培养的温度为20℃，培养时的转速为300r/min，培养至OD600约为0.3外，其余实验条件及实验步骤与实施例2相同。

实施例4融合蛋白cipA-arc表达

除步骤2.1中的培养的温度为37℃，培养时的转速为150r/min，培养至OD600约为1.0外，其余实验条件及实验步骤与实施例2相同。

实施例5融合蛋白cipA-arc表达

除步骤2.1中的培养的温度为40℃，培养时的转速为180r/min，培养至OD600约为0.72外，其余实验条件及实验步骤与实施例2相同。

不同的实施条件对谷氨酸棒杆菌感受态细胞制备效果影响

实施例	培养温度(℃)	转速(r/min)	OD<sub>600</sub>	感受态细胞数量
					实施例2-2.1	30	200	0.9	正常
实施例3	20	300	0.3	弱
					实施例4	37	150	1.0	正常
实施例5	40	180	0.72	弱

实施例6融合蛋白cipA-arc表达

除步骤2.2中的电击的电压为1kV，电击的时间为10ms外，其余实验条件及实验步骤与实施例2相同。

实施例7融合蛋白cipA-arc表达

除步骤2.2中的电击的电压为5kV，电击的时间为1ms外，其余实验条件及实验步骤与实施例2相同。

不同的电击下条件下对谷氨酸棒杆菌感受态细胞转化效率的影响

实施例8融合蛋白cipA-arc表达

除步骤2.3中的培养温度为30℃，培养时的转速为200r/min，培养至OD600约为0.9，诱导剂浓度为1.0mM，诱导温度为30℃，诱导时的转速为180r/min外，其余实验条件及实验步骤与实施例2相同。

实施例9融合蛋白cipA-arc表达

除步骤2.3中的培养温度为20℃，培养时的转速为300r/min，培养至OD600约为0.5，诱导剂浓度为0.5mM，诱导的温度为20℃，诱导时的转速为200r/min外，其余实验条件及实验步骤与实施例2相同。

实施例10融合蛋白cipA-arc表达

除步骤2.3中的培养温度为25℃，培养时的转速为150r/min，培养至OD600约为1.0，诱导剂浓度为1.5mM，诱导的温度为35℃，诱导时的转速为220r/min外，其余实验条件及实验步骤与实施例2相同。

不同的培养条件下对重组谷氨酸棒杆菌融合蛋白cipA-arc表达效率的影响

实施例11转化[^14/15N]-L-精氨酸生产[^14/15N]-L-瓜氨酸

步骤一、固定化融合蛋白cipA-arc悬浮于玻璃柱反应器中：

取一根高径比为15的有机玻璃柱作为填充柱，把固定化融合蛋白cipA-arc填充入填充柱内。

步骤二、固定化融合蛋白cipA-arc填充柱催化合成[^14/15N]-L-瓜氨酸：

将[^14/15N]-L精氨酸的物质量浓度为2.5mol/L的醋酸铵缓冲溶液(0.2mol/l，pH6.0)，在温度为30℃条件下，以流速为0.3BV/h流经填充柱。在此反应条件下，[^14/15N]-L-精氨酸的转化率为99.8％，每升发酵液中含[^14/15N]-L-瓜氨酸435g，固定化融合蛋白cipA-arc转化520h后，融合蛋白cipA-arc催化活力仍是稳定的，即固定化融合蛋白cipA-arc的使用寿命为520h。

步骤三、[^14/15N]-L-瓜氨酸的分离纯化，包括以下三个步骤：

a、收集填充柱流出的反应液，通过纳滤脱除缓冲盐，返回反应体系，循环使用，收集产物浓缩液；

b、把经过a步骤后的反应液真空减压浓缩、结晶，即可得到纯度为99.8％以上的[^14/15N]-L-瓜氨酸，经过喷雾干燥得到白色粉末状固体。

实施例12转化[^14/15N]-L-精氨酸生产[^14/15N]-L-瓜氨酸

步骤一、固定化融合蛋白cipA-arc悬浮于玻璃柱反应器中：

取一根高径比为25的有机玻璃柱作为填充柱，把固定化融合蛋白cipA-arc填充入填充柱内。

步骤二、固定化融合蛋白cipA-arc填充柱催化合成L-瓜氨酸：

将[^14/15N]-L-精氨酸的物质量浓度为2.0mol/L的甲酸铵缓冲溶液(0.2mol/L，pH6.0)，在温度为35℃条件下，以流速为0.4BV/h流经填充柱。在此反应条件下，[^14/15N]-L-精氨酸的转化率为98.8％，每升发酵液中含[^14/15N]-L-瓜氨酸348g，固定化融合蛋白cipA-arc转化560h后，融合蛋白cipA-arc催化活力仍是稳定的，即固定化融合蛋白cipA-arc的使用寿命为560h。

步骤三、[^14/15N]-L-瓜氨酸的分离纯化，包括以下三个步骤：

a、收集填充柱流出的反应液，通过纳滤脱除缓冲盐，返回反应体系，循环使用，收集产物浓缩液；

b、把经过a步骤后的反应液真空减压浓缩、结晶，即可得到纯度为99.5％以上的[^14/15N]-L-瓜氨酸，经过喷雾干燥得到白色粉末状固体。

实施例13转化[^14/15N]-L-精氨酸生产[^14/15N]-L-瓜氨酸

步骤一、固定化融合蛋白cipA-arc悬浮于玻璃柱反应器中：：

取一根高径比为30的有机玻璃柱作为填充柱，把固定化融合蛋白cipA-arc填充入填充柱内。

步骤二、固定化融合蛋白cipA-arc填充柱催化合成[^14/15N]-L-瓜氨酸：

将[^14/15N]-L-精氨酸的物质量浓度为1.5mol/L的氯化铵水溶液(0.3mol/L，pH4.5)，在温度为40℃条件下，以流速为0.5BV/h流经填充柱。在此反应条件下，[^14/15N]-L-精氨酸的转化率为99.5％，每升发酵液中含[^14/15N]-L-瓜氨酸261g，固定化融合蛋白cipA-arc转化530h后，融合蛋白cipA-arc催化活力仍是稳定的，即固定化融合蛋白cipA-arc的使用寿命为530h。

步骤三、[^14/15N]-L-瓜氨酸的分离纯化，包括以下三个步骤：

a、收集填充柱流出的反应液，通过纳滤脱除缓冲盐，返回反应体系，循环使用，收集产物浓缩液；

b、把经过a步骤后的反应液真空减压浓缩、结晶，即可得到纯度为99.6％以上的[^14/15N]-L-瓜氨酸，经过喷雾干燥得到白色粉末状固体。

实施例14转化[^14/15N]-L-精氨酸生产[^14/15N]-L-瓜氨酸

步骤一、固定化融合蛋白cipA-arc悬浮于玻璃柱反应器中：：

取一根高径比为40的有机玻璃柱作为填充柱，把固定化融合蛋白cipA-arc填充入填充柱内。

步骤二、固定化融合蛋白cipA-arc填充柱催化合成[^14/15N]-L-瓜氨酸：

将[^14/15N]-L-精氨酸的物质量浓度为1.0mol/L的水溶液(pH7.5)，在温度为55℃条件下，以流速为0.3BV/h流经填充柱。在此反应条件下，[^14/15N]-L-精氨酸的转化率为95％，每升发酵液中含[^14/15N]-L-瓜氨酸174g，固定化融合蛋白cipA-arc转化480h后，融合蛋白cipA-arc催化活力仍是稳定的，即固定化融合蛋白cipA-arc的使用寿命为480h。

步骤三、[^14/15N]-L-瓜氨酸的分离纯化，包括以下三个步骤：

a、收集填充柱流出的反应液，通过纳滤脱除缓冲盐，返回反应体系，循环使用，收集产物浓缩液；

b、把经过a步骤后的反应液真空减压浓缩、结晶，即可得到纯度为99.5％以上的[^14/15N]-L-瓜氨酸，经过喷雾干燥得到白色粉末状固体。

实施例15转化[^14/15N]-L-精氨酸生产[^14/15N]-L-瓜氨酸

步骤一、固定化融合蛋白cipA-arc悬浮于玻璃柱反应器中：：

取一根高径比为35的有机玻璃柱作为填充柱，把固定化融合蛋白cipA-arc填充入填充柱内。

步骤二、固定化融合蛋白cipA-arc填充柱催化合成[^14/15N]-L-瓜氨酸：

将[^14/15N]-L-精氨酸的物质量浓度为1.8mol/l的碳酸氢铵水溶液(0.3mol/L，pH8.5)，在温度为20℃条件下，以流速为0.3BV/h流经填充柱。在此反应条件下，[^14/15N]-L-精氨酸的转化率为98％，每升发酵液中含[^14/15N]-L-瓜氨酸313g，固定化融合蛋白cipA-arc转化450h后，融合蛋白cipA-arc催化活力仍是稳定的，即固定化融合蛋白cipA-arc的使用寿命为450h。

步骤三、[^14/15N]-L-瓜氨酸的分离纯化，包括以下三个步骤：

a、收集填充柱流出的反应液，通过纳滤脱除缓冲盐，返回反应体系，循环使用，收集产物浓缩液；

b、把经过a步骤后的反应液真空减压浓缩、结晶，即可得到纯度为99.7％以上的[^14/15N]-L-瓜氨酸，经过喷雾干燥得到白色粉末状固体。

以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

序列表

<110> 上海健康医学院

<120> 一种固定化酶连续制备[14/15N]-L-瓜氨酸的方法

<150> 2019110775729

<151> 2019-11-06

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1567

<212> PRT

<213> 一种固定化酶连续制备[14/15N]-L-瓜氨酸的方法(Corynebacteriumglutamicum)

<400> 1

Ser Glu Gln Glu Asn Cys Glu Leu Ile Ser Thr Ile Asn Gly Asn Leu

1 5 10 15

Pro Arg Thr Ala Thr Gly Ala Thr Cys Ala Ala Cys Gly Ala Cys Ala

20 25 30

Thr Gly Cys Ala Cys Cys Cys Ala Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Thr

35 40 45

Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Ala Thr Gly

50 55 60

Ala Thr Gly Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Thr Thr Ala Thr Gly Cys

65 70 75 80

Thr Gly Cys Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly Cys Ala Ala Gly Ala Thr

85 90 95

Cys Ala Thr Cys Gly Cys Thr Ala Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Cys

100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

Cys Gly Thr Thr Cys Thr Gly Ala Thr Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys

145 150 155 160

Gly Gly Cys Ala Cys Cys Thr Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala

165 170 175

Thr Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Thr Gly Gly Ala Ala

180 185 190

Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys Cys Gly Cys

195 200 205

Gly Gly Cys Ala Thr Gly Gly Cys Thr Ala Thr Cys Thr Ala Cys Ala

210 215 220

Ala Gly Gly Thr Thr Cys Thr Gly Ala Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys

225 230 235 240

Thr Cys Thr Gly Thr Gly Cys Gly Gly Cys Ala Ala Gly Ala Ala Gly

245 250 255

Gly Ala Cys Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Thr Cys Gly Gly Cys Ala

260 265 270

Cys Cys Gly Thr Thr Gly Gly Cys Ala Ala Gly Gly Thr Thr Gly Gly

275 280 285

Cys Cys Cys Ala Cys Thr Gly Gly Gly Cys Thr Gly Cys Gly Ala Cys

290 295 300

Thr Ala Cys Ala Thr Cys Ala Ala Cys Thr Gly Cys Gly Thr Thr Gly

305 310 315 320

Ala Gly Ala Thr Cys Thr Cys Cys Ala Thr Gly Pro Arg Thr Ala Thr

325 330 335

Gly Ala Ala Cys Ala Ala Cys Gly Gly Cys Ala Thr Cys Ala Ala Cys

340 345 350

Gly Thr Thr Ala Ala Cys Thr Cys Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Gly

355 360 365

Gly Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Thr Cys Cys Gly Thr

370 375 380

Thr Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Cys Ala

385 390 395 400

Gly Gly Cys Gly Cys Thr Gly Ala Gly Gly Thr Thr Gly Ala Gly Ala

405 410 415

Ala Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Cys Cys Ala Gly Ala Cys Ala Cys

420 425 430

Cys Ala Thr Gly Ala Ala Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly

435 440 445

Thr Thr Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Ala Thr Cys Cys Cys Ala Thr

450 455 460

Ala Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Cys Gly Cys Thr Cys Ala

465 470 475 480

Gly Ala Ala Gly Gly Ala Gly Cys Ala Cys Gly Ala Cys Thr Thr Cys

485 490 495

Thr Thr Cys Gly Cys Thr Cys Ala Gly Ala Cys Cys Cys Thr Gly Cys

500 505 510

Gly Cys Gly Ala Cys Ala Ala Cys Gly Gly Cys Gly Cys Thr Gly Ala

515 520 525

Gly Ala Cys Cys Gly Thr Thr Thr Ala Cys Ala Thr Cys Gly Ala Gly

530 535 540

Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Cys Thr Ala Cys Cys Gly Ala Gly Gly

545 550 555 560

Thr Thr Thr Thr Cys Gly Ala Gly Ala Ala Gly Thr Cys Cys Thr Cys

565 570 575

Cys Gly Ala Gly Ala Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly

580 585 590

Thr Thr Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Cys Ala Cys Cys Thr Gly Cys

595 600 605

Thr Gly Cys Ala Cys Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Gly Cys Thr Ala

610 615 620

Cys Cys Gly Cys Cys Cys Ala Gly Gly Cys Cys Gly Cys Ala Cys Cys

625 630 635 640

Thr Ala Cys Gly Ala Cys Gly Gly Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Gly

645 650 655

Ala Gly Thr Ala Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Thr Cys Cys Ala Thr

660 665 670

Gly Thr Cys Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Ala Thr Gly

675 680 685

Gly Thr Thr Gly Ala Gly Ala Ala Gly Ala Thr Cys Thr Ala Cys Gly

690 695 700

Cys Thr Gly Gly Cys Gly Thr Thr Cys Gly Cys Ala Ala Gly Ala Ala

705 710 715 720

Cys Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Thr Cys Ala Ala Gly

725 730 735

Cys Gly Cys Ala Cys Cys Gly Cys Thr Cys Thr Gly Thr Cys Cys Gly

740 745 750

Ala Cys Ala Thr Gly Gly Cys Thr Gly Gly Cys Thr Cys Cys Gly Ala

755 760 765

Cys Gly Cys Thr Gly Ala Gly Ala Ala Cys Thr Ala Cys Thr Thr Cys

770 775 780

Thr Ala Cys Cys Thr Gly Ala Ala Cys Cys Cys Ala Cys Thr Gly Cys

785 790 795 800

Cys Ala Ala Ala Cys Gly Cys Thr Thr Ala Cys Thr Thr Cys Ala Cys

805 810 815

Cys Cys Gly Cys Gly Ala Cys Cys Cys Ala Cys Ala Gly Gly Cys Thr

820 825 830

Thr Cys Cys Ala Thr Gly Gly Gly Cys Gly Thr Thr Gly Gly Cys Ala

835 840 845

Thr Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Ala Cys Ala Ala Gly Ala Thr

850 855 860

Gly Ala Cys Cys Thr Thr Cys Cys Cys Ala Gly Cys Thr Cys Gly Cys

865 870 875 880

Cys Ala Gly Cys Cys Ala Gly Ala Gly Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala

885 890 895

Thr Cys Ala Cys Cys Gly Ala Gly Thr Ala Cys Gly Thr Thr Ala Thr

900 905 910

Gly Gly Cys Thr Ala Ala Cys Cys Ala Cys Cys Cys Ala Cys Gly Cys

915 920 925

Thr Thr Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys Cys Cys Cys Ala Ala

930 935 940

Thr Cys Thr Gly Gly Cys Gly Cys Gly Ala Cys Cys Gly Cys Ala Ala

945 950 955 960

Cys Cys Ala Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Cys Gly Cys Ala Thr Cys

965 970 975

Gly Ala Gly Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Ala Cys Gly Ala Gly Cys

980 985 990

Thr Gly Ala Thr Cys Cys Thr Gly Ala Ala Cys Ala Ala Gly Ala Cys

995 1000 1005

Cys Ala Cys Cys Gly Thr Thr Gly Cys Thr Ala Thr Cys Gly Gly Cys

1010 1015 1020

Gly Thr Thr Thr Cys Cys Gly Ala Gly Cys Gly Cys Ala Cys Cys Thr

1025 1030 1035 1040

Cys Cys Thr Cys Cys Ala Ala Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Cys Ala

1045 1050 1055

Gly Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Cys Thr Ala Ala Gly Gly Ala Gly

1060 1065 1070

Cys Thr Gly Thr Thr Cys Gly Cys Thr Ala Ala Cys Cys Cys Ala Cys

1075 1080 1085

Thr Gly Thr Cys Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Gly Ala Cys Ala Cys

1090 1095 1100

Cys Gly Thr Thr Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Thr Thr Gly Ala Gly

1105 1110 1115 1120

Ala Thr Cys Cys Cys Ala Cys Ala Cys Ala Ala Cys Cys Ala Cys Gly

1125 1130 1135

Cys Thr Ala Thr Gly Ala Thr Gly Cys Ala Cys Cys Thr Gly Gly Ala

1140 1145 1150

Cys Ala Cys Cys Gly Thr Thr Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Gly

1155 1160 1165

Ala Thr Cys Ala Ala Cys Cys Ala Cys Gly Ala Cys Cys Ala Gly Thr

1170 1175 1180

Thr Cys Ala Cys Cys Gly Thr Thr Thr Thr Cys Cys Cys Ala Gly Gly

1185 1190 1195 1200

Cys Ala Thr Cys Ala Thr Gly Gly Ala Cys Gly Gly Cys Gly Cys Thr

1205 1210 1215

Gly Gly Cys Ala Ala Cys Ala Thr Cys Ala Ala Cys Gly Thr Thr Thr

1220 1225 1230

Thr Cys Ala Thr Cys Cys Thr Gly Cys Gly Cys Cys Cys Ala Gly Gly

1235 1240 1245

Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Ala Gly Gly Thr Thr

1250 1255 1260

Gly Ala Gly Ala Thr Cys Gly Ala Gly Cys Ala Cys Cys Thr Gly Ala

1265 1270 1275 1280

Cys Cys Gly Ala Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly Gly Cys Thr Gly Cys

1285 1290 1295

Thr Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly Thr Thr Cys Thr Gly

1300 1305 1310

Ala Ala Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly

1315 1320 1325

Ala Cys Cys Thr Gly Ala Thr Cys Gly Ala Gly Thr Gly Cys Gly Gly

1330 1335 1340

Cys Gly Cys Thr Gly Gly Cys Gly Ala Cys Cys Cys Ala Ala Thr Cys

1345 1350 1355 1360

Gly Cys Thr Gly Cys Thr Cys Cys Ala Cys Gly Cys Gly Ala Gly Cys

1365 1370 1375

Ala Gly Thr Gly Gly Ala Ala Cys Gly Ala Cys Gly Gly Cys Thr Cys

1380 1385 1390

Cys Ala Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly Cys Thr Ala Thr Cys

1395 1400 1405

Gly Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Gly

1410 1415 1420

Thr Thr Ala Cys Cys Thr Ala Cys Gly Ala Cys Cys Gly Cys Ala Ala

1425 1430 1435 1440

Cys Thr Ala Cys Gly Thr Thr Ala Cys Cys Gly Thr Thr Gly Ala Gly

1445 1450 1455

Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Gly Ala Gly Cys Ala Cys Gly

1460 1465 1470

Gly Cys Ala Thr Cys Ala Ala Gly Gly Thr Thr Cys Ala Cys Gly Ala

1475 1480 1485

Gly Ala Thr Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr Cys Cys Gly Ala Gly

1490 1495 1500

Cys Thr Gly Gly Gly Cys Cys Gly Cys Gly Gly Cys Cys Gly Cys Gly

1505 1510 1515 1520

Gly Cys Gly Gly Cys Gly Cys Thr Cys Gly Cys Thr Gly Cys Ala Thr

1525 1530 1535

Gly Thr Cys Cys Cys Ala Gly Cys Cys Ala Cys Thr Gly Thr Gly Gly

1540 1545 1550

Cys Gly Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Cys Thr Gly Thr Ala Ala

1555 1560 1565