阅读说明：本技术 一种酶催化精氨酸制备l-瓜氨酸的方法 (Method for preparing L-citrulline by catalyzing arginine through enzyme ) 是由 汪大顺 于 2018-08-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种酶催化精氨酸制备L-瓜氨酸的方法,其特征在于包含以下步骤：1)确定酶类；2)酶重复利用；3)实验生产。本发明一种酶催化精氨酸制备L-瓜氨酸的方法克服了精氨酸酶转化法生产L-瓜氨酸的瓶颈,价格低廉易得,工艺简单,产品纯度高。(The invention relates to a method for preparing L-citrulline by catalyzing arginine through enzyme, which is characterized by comprising the following steps: 1) determining enzymes; 2) recycling the enzyme; 3) and (5) experimental production. The method for preparing L-citrulline by catalyzing arginine with enzyme overcomes the bottleneck of producing L-citrulline by an arginase conversion method, and has the advantages of low price, easy obtainment, simple process and high product purity.)

一种酶催化精氨酸制备L-瓜氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种酶催化精氨酸制备L-瓜氨酸的方法。

背景技术

1914年右贺太郎等从西瓜榨汁中第一次分离得到了瓜氨酸，此后由和田光德认出它是一种氨基酸。瓜氨酸以游离态存在于葫芦科植物的种子中，至今为止，人们已成功从西瓜榨汁中，野西瓜叶中，核桃仁，核桃幼苗及种子中分离得到了瓜氨酸H1。瓜氨酸是一种非蛋白质氨基酸，国外科学家在瓜氨酸方面的研究较多，尤其是在日本、美国和欧洲。在国内，对瓜氨酸的研究却还只是处于认识阶段，生产方法没有相应的报道对其检测方法和生理功能研究的也不多，只有少量的文献报道。岳瑞等用双波长薄层扫描法测定天花粉中瓜氨酸的含量。在研究粗糙孢霉突变株诱导与培养时，发现了瓜氨酸对此突变株有明显的促生长作用。郑春福等研究发现增加细胞外源的L瓜氨酸可明显提高活化巨噬细胞诱生的NO产量，进而降低活化巨噬细胞的感染率，并抑制细胞内弓形虫速殖子的增殖。曾小峰等发现抗环瓜氨酸肽抗体在类风湿关节炎的诊断中有重要的作用。

在瓜氨酸的生理功能方面，国外科学家已研究得出瓜氨酸具有一些很重要的药理功能，如自由基清除作用，在人体的健康保健方面具有很重要的意义；血管舒张作用，这有望成为治疗内毒症、脓毒症的良药。日本一科学家已研制出一种瓜氨酸新多肽，并将该新多肽研究发展成抗艾滋病药物。同时瓜氨酸被认为是一种非常有效的抗氧化剂，这一功能已应用于化妆品、药物、保健食品等各个领域。近年来国外的众多研究表明，瓜氨酸具有很多重要的生理功能，如清除自由基，异体排斥效应指示剂，血管舒张作用，稳定血压以及诊断类风湿关节炎，抗氧化等，应用前景十分广阔。

在瓜氨酸的制备方法上主要有三种，国外主要采用发酵法和酶法生产，分离纯化多数使用离子交换等常用的分离方法。

(1)化学法：是指碱性条件下水解L-精氨酸得L-瓜氨酸，过程控制比较困难，产品中含有旋光对映体D-瓜氨酸，影响产品质量，生产过程中产生大量废水，污染环境，但化学法是国内目前L-瓜氨酸工业化生产的唯一方法。

(2)发酵法生产的难点在于单位体积L-瓜氨酸产率低，最高仅为1.7g/L，从发酵液中提取L-瓜氨酸的成本较高。发酵法的优点是成本低，产量高，产物的纯度高，在产品的生产过程中没有有毒物质的产生，给产物后加工提供了方便，降低了成本。目前，对发酵法生产瓜氨酸研究最多的国家是日本，在上世纪30年代就有这方面的研究，到了60年代达到了一定的水平。

(3)酶法：是指在精氨酸脱亚胺酶的作用下，L-精氨酸被转化为L-瓜氨酸，生产条件温和，不产生有毒物质，转化体系中杂质较少，提取工艺简单，污染少。该法是以专一性强、转化率高的微生物菌体细胞为催化剂，催化精氨酸脱亚胺基生成L瓜氨酸。利用酶法合成瓜氨酸，大多采用一步酶促反应，因而可避免瓜氨酸全合成途径中复杂的反馈调节作用，使瓜氨酸可以积累到较高的浓度。

1973年，IchifoChibata等‘261报道PsudomonasputidaATCC4359，PseudomonasfluorescenIFO3081,PseudomonsovalisiAM1002,LeuconostoccitrovorumATCC8081等可以生产精氨酸脱亚氨基酶，以L-精氨酸或DL精氨酸为底物，可生产瓜氨酸浓度达80班以上。酶法合成瓜氨酸的优点是产物浓度高，纯化步骤少，产品中无D-型旋光对映体，生产工艺简单、成本低。但其缺点是目前酶法很难满足工业生产的要求，原因是依靠动物内脏获得的精氨酸脱亚氨基酶的活性较低，转化率较低，同时精氨酸原料的价格高，影响了瓜氨酸的酶法生产放大。因此，廉价的精氨酸原料价格和精氨酸脱亚胺酶的获得是酶法生产能否成功的关键。

发明内容

本发明的目的在于提供一种酶催化精氨酸制备L-瓜氨酸的方法。

本发明一种酶催化精氨酸制备L-瓜氨酸的方法，其特征在于包含以下步骤：

1)确定酶类：采用精氨酸脱亚胺酶，根据酶分子的三维空间结构对酶分子的催化活性位点进行定向设计、理性进化，提高酶的催化活性；

2)酶重复利用：对构建的大肠杆菌工程菌进行固定化，通过添加表面活性剂及其他基质等提高细胞的通透性与固定化细胞的硬度；

3)实验生产：对已完成的小试工作进行中试实验生产，为规模化生产提供科学合理的参数。

本发明一种酶催化精氨酸制备L-瓜氨酸的方法克服了精氨酸酶转化法生产L-瓜氨酸的瓶颈，价格低廉易得，工艺简单，产品纯度高。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。

实施例1：一种酶催化精氨酸制备L-瓜氨酸的方法，其特征在于包含以下步骤：

1)确定酶类：采用精氨酸脱亚胺酶，根据酶分子的三维空间结构对酶分子的催化活性位点进行定向设计、理性进化，提高酶的催化活性；

2)酶重复利用：对构建的大肠杆菌工程菌进行固定化，通过添加表面活性剂及其他基质等提高细胞的通透性与固定化细胞的硬度；

3)实验生产：对已完成的小试工作进行中试实验生产，为规模化生产提供科学合理的参数。

以上所述是本发明的优选实施方式，具有工艺简便，易于工业化生产，产品质量优良，储存稳定性良好，可以满足生产、运输、储存、使用的实际需要。需要特别指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干润饰，这些润饰也视为本发明的保护范围。