一种高纯度l-精氨酸的生产工艺
阅读说明：本技术 一种高纯度l-精氨酸的生产工艺 (Production process of high-purity L-arginine ) 是由 冯世红 张宗华 韦树高 边恩来 李江涛 崔小红 于 2020-11-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种高纯度L-精氨酸的生产工艺,其包括如下步骤：步骤1)精氨酸发酵,步骤2)离心和陶瓷膜过滤,步骤3)过弱酸性阳离子树脂,步骤4)脱氨,步骤5)纳滤膜脱色,步骤6)过强碱性阴离子树脂,步骤7)浓缩结晶,步骤8)干燥包装。本发明产酸效率高,提取分离工艺简单可行,使L-精氨酸收率达到75%以上,纯度达到98.5%以上。(The invention relates to a production process of high-purity L-arginine, which comprises the following steps: step 1) arginine fermentation, step 2) centrifugation and ceramic membrane filtration, step 3) weak acidic cation resin, step 4) deamination, step 5) nanofiltration membrane decolorization, step 6) strong basic anion resin, step 7) concentration and crystallization, and step 8) drying and packaging. The invention has high acid production efficiency, simple and feasible extraction and separation process, and ensures that the yield of the L-arginine reaches over 75 percent and the purity reaches over 98.5 percent.)
技术领域
本发明属于L-精氨酸生产技术领域，具体涉及一种高纯度L-精氨酸的生产工艺。
背景技术
L-精氨酸是一种含胍基的碱性氨基酸，为白色结晶或结晶性粉末，水中易溶，在乙醇中几乎不溶；在稀盐酸中易溶。在生理条件下带正电荷。L-精氨酸是蛋白质合成中的编码氨基酸，哺乳动物必需氨基酸和生糖氨基酸。亦是20种普遍的自然氨基酸之一。在哺乳动物，精氨酸被分类为半必要或条件性必要的氨基酸，视乎生物的发育阶段及健康状况而定。一种复杂的氨基酸，在蛋白质和酶的反应点可以发现它。在幼儿生长期，精氨酸是一种必需氨基酸。
精氨酸的生产方法主要包括：水解法、酶法、化学合成法和微生物发酵法。我国精氨酸生产能力有限，早期主要是采用水解法，但由于水解法产品品质稳定性较差，回收率低，不适合用于大规模生产，逐渐被市场淘汰。微生物发酵法以廉价的碳源和氮源为底物，通过微生物菌体代谢，借助自身产精氨酸的能力，通过葡萄糖发酵直接合成精氨酸。发酵法原料来源成本相对较低，发酵反应条件较温和，生产工艺相对稳定，可控程度高，容易大规模放大生产，因而成为目前生产精氨酸的主要方法。
但是，我国目前发酵法生产精氨酸技术条件不成熟，产酸能力及转化率不高，从而导致发酵法生产精氨酸成本较高，因此，迫切需要新的技术突破和生产工艺，在提高精氨酸的产酸能力及转化率的同时降低生产成本。
发酵法所产生的精氨酸发酵液中成分复杂，除含有较高浓度的L-精氨酸以外，还含有微生物细胞，未利用的培养基，细胞碎片，微生物代谢过程中产生的色素及其他代谢产物。从发酵液中分离提纯L-精氨酸的通常方法是：发酵液经过膜过滤或絮凝沉淀除掉菌体蛋白，料液通过离交固定床吸附、解析L精氨酸，达到除杂的目的，解析液经驱氨脱色后浓缩料液，结晶干燥制成L精氨酸成品。上述方法中，絮凝除菌所得料液澄清度不高，且残留的絮凝剂可能导致移动床层堵塞，影响下游的产品纯化过程，使用传统的固定床进行离子交换，其产品收率低，树脂利用率不高，且洗脱剂和水的用量大，产品质量不稳定。
发明内容
本发明主要目的是提供一种高纯度L-精氨酸的生产工艺，发酵效率高，并且能够有效的分离出高纯度L-精氨酸，使L-精氨酸提取收率达到75％以上，产品纯度达到98.5％以上。
本发明是通过如下技术方案来实现的。
一种高纯度L-精氨酸的生产工艺，其特征在于，所述生产工艺包括如下步骤：
步骤1)精氨酸发酵，步骤2)离心和陶瓷膜过滤，步骤3)过弱酸性阳离子树脂，步骤4)脱氨，步骤5)纳滤膜脱色，步骤6)过强碱性阴离子树脂，步骤7)浓缩结晶，步骤8) 干燥包装。
进一步地，所述步骤1)精氨酸发酵，包括：将大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No.11674种子液以12％接种量接种于装有50L发酵培养基的发酵罐中发酵培养，转速为 280rpm，温度为34℃，pH为7.1，溶氧通过交替提高转速和风量控制在18％以上，发酵培养周期为55h，得到L-精氨酸发酵液。
进一步地，所述步骤2)离心和陶瓷膜过滤：L-精氨酸发酵液通过高速碟片离心机以 5000rpm的转速离心3min，去除沉淀，然后通过截留分子量为10000Da的陶瓷膜进行过滤，过滤温度控制在60℃，收集滤过液。
进一步地，所述步骤3)过弱酸性阳离子树脂，包括：将步骤2)所得的滤过液经弱酸性阳离子树脂吸附，然后用氨水洗脱，得到L-精氨酸洗脱液。
进一步地，所述步骤4)脱氨，包括：将步骤3)得到的洗脱液脱氨至含氨0.02％以下，温度控制在55℃-65℃。
进一步地，所述步骤5)纳滤膜脱色，包括：将步骤4)得到的洗脱液用分子量500Da的纳滤膜进行脱色，再通过分子量100Da纳滤膜纳滤除盐和浓缩。
进一步地，所述步骤6)过强碱性阴离子树脂，包括：将步骤5)所得浓缩液过强碱性阴离子树脂，收集交换液。
进一步地，所述步骤7)浓缩结晶，包括：将步骤6)得到的交换液打入四效蒸发器，蒸发温度50℃，浓缩至50％，将浓缩液经冷凝水冷却结晶，用30％酒精洗晶20s，得到L-精氨酸湿结晶，湿成品水份<10％。
进一步地，所述步骤8)干燥包装，包括：将步骤7)得到的湿成品经真空干燥机烘干后包装得到L-精氨酸成品，烘干温度控制在70℃，成品水分小于0.3％。
更进一步地，所述发酵培养还包括：
1)在发酵培养至2h时，于发酵罐中以80ml/h的流速补料流加硫酸铵水溶液；
2)在发酵培养至4h时，于发酵罐中以0.2L/h的流速补料流加葡萄糖水溶液，直至发酵结束；
所述硫酸铵水溶液的配制方法为：将350g硫酸铵与200g谷氨酸钠依次添加到水中，溶解后定容为1L；灭菌温度120℃，灭菌时间20min；
葡萄糖水溶液的配制方法为：将900g结晶糖与3g甜菜碱依次添加到水中，溶解后定容为1L；灭菌温度120℃，灭菌时间20min；
所述发酵培养基组分为：葡萄糖12g/L，甘油5g/L，酵母粉6g/L，甜菜碱0.8g/L，磷酸氢二钾8g/L，硫酸镁1.8g/L，硫酸亚铁0.03g/L，硫酸锰0.03g/L，氯霉素12mg/L，生物素0.004g/L。
本发明的创新点以及取得的有益结果主要包括但是并不限于以下：
本发明根据菌株的理化性质选择不同的辅用碳源，发现，甘油能够刺激大肠埃希氏菌 (Escherichia coli)CGMCC No.11674产精氨酸，最大可提高20％以上，而额外添加蔗糖对大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No.11674产精氨酸没有明显影响；可能是甘油的作用并不仅仅是提高碳源，而是提升了合成精氨酸的代谢流。
本发明通过流加糖和硫酸铵水溶液方式，达到精准控制发酵过程中残糖值和氨氮值；葡萄糖摄入量对精氨酸发酵具有重要意义，糖浓度过高，不但会使其产量下降，反而增加了生产成本；糖浓度过低，则会抑制菌株生产能力，使其不能发挥最大作用。硫酸铵作为精氨酸发酵的一种氮源，为菌体的核酸和蛋白质提供重要的氮源，适宜的氮源对微生物的、生产和产物积累产生重要作用。本发明采用流加硫酸铵水溶液，使其发酵过程中降低代谢副产物积累，从而进一步提高精氨酸的产率，同时降低生产成本。本发明开拓性地将甜菜碱和谷氨酸钠添加到葡萄糖水溶液和硫酸铵水溶液中，适量流加甜菜碱和谷氨酸钠能够提高精氨酸的合成效率，刺激效果持续，添加量较小，降低了成本。
本发明发酵工艺可控制程度高，投入成本小，且精准控制发酵过程，避免造成发酵失控和成本增加，同时降低了劳动强度，整个生产过程简单易操作，十分适用于工业化大生产。
本发明提取工艺采用了碟片离心和陶瓷膜过滤去除菌体蛋白，能够100％的过滤菌体，并且菌体蛋白可以回用，避免了资源的浪费。采用纳滤膜脱色，有效提高了L-精氨酸的纯度，减少了活性炭的用量，极大的节约了成本。采用四效蒸发器浓缩，产生的蒸汽经冷凝后回收到降温水池，作为冷凝水重复利用，减少了水资源的浪费。本发明制备得到的高纯度L-精氨酸，使L-精氨酸提取收率达到75％以上，产品纯度达到98.5％以上。
附图说明
图1：发酵培养基组分对精氨酸产量的影响；
图2：葡萄糖水溶液中甜菜碱添加量对精氨酸产量的影响；
图3：硫酸铵水溶液中谷氨酸钠添加量对精氨酸产量的影响。
具体实施方式
为了使本技术领域人员更好的理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本技术方案进行完整的描述。
本发明使用的菌株为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)XJFF-151106S，保藏号为CGMCC No.11674，该菌株由申请人筛选驯化获得，于2015年11月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株的主要理化性质为：能够利用葡萄糖、蔗糖、山梨醇、阿拉伯糖、甘油作为碳源，不能利用肌醇和柠檬酸；半乳糖苷酶、脲酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶阳性；不产明胶酶、色氨酸脱羧酶以及精氨酸双水解酶。
实施例1
精氨酸发酵工艺，包括：
步骤1)将活化后的精氨酸生产菌种大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCCNo.11674 菌液(1×108cfu/ml)接入种子罐中进行种子培养24h得到种子液，培养温度为38℃，pH为 6.8，风量为200L/h，转速为350rpm，罐压为0.04mpa。
步骤2)将种子液以12％接种量接种于装有50L发酵培养基的规格为100L发酵罐中培养，转速为280rpm，温度为34℃，pH为7.1(pH值通过氨水调整控制)，罐压0.03mpa，溶氧通过交替提高转速和风量控制在18％以上，发酵周期为55h。
发酵过程中流加培养液的流程为：
1)在发酵培养至2h时，于发酵罐中以80ml/h的流速补料流加硫酸铵水溶液；
2)在发酵培养至4h时，于发酵罐中以0.2L/h的流速补料流加葡萄糖水溶液，直至发酵结束。
所述硫酸铵水溶液的配制方法为：将350g硫酸铵与200g谷氨酸钠依次添加到水中，溶解后定容为1L；灭菌温度120℃，灭菌时间20min。
葡萄糖水溶液的配制方法为：将900g结晶糖与3g甜菜碱依次添加到水中，溶解后定容为1L；灭菌温度120℃，灭菌时间20min。
所述种子培养基组分为：葡萄糖28g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨6g/L，硫酸铵4g/L，磷酸氢二钾4g/L，硫酸镁2g/L，硫酸亚铁0.04g/L，硫酸锰0.04g/L，氯霉素14mg/L，生物素0.003g/L。
所述发酵培养基组分为：葡萄糖12g/L，甘油5g/L，酵母粉6g/L，甜菜碱0.8g/L，磷酸氢二钾8g/L，硫酸镁1.8g/L，硫酸亚铁0.03g/L，硫酸锰0.03g/L，氯霉素12mg/L，生物素0.004g/L。
对比例1
一种利用流加培养液发酵生产精氨酸的工艺，包括：
步骤1)将活化后的精氨酸生产菌种大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCCNo.11674 菌液(1×108cfu/ml)接入种子罐中进行种子培养24h得到种子液，培养温度为38℃，pH为 6.8，风量为200L/h，转速为350rpm，罐压为0.04mpa。
步骤2)将种子液以12％接种量接种于装有50L发酵培养基的规格为100L发酵罐中培养，转速为280rpm，温度为34℃，pH为7.1(pH值通过氨水调整控制)，罐压0.03mpa，溶氧通过交替提高转速和风量控制在18％以上，发酵周期为55h。
发酵过程中流加培养液的流程为：
1)在发酵培养至2h时，于发酵罐中以80ml/h的流速补料流加硫酸铵水溶液；
2)在发酵培养至4h时，于发酵罐中以0.2L/h的流速补料流加葡萄糖水溶液，直至发酵结束。
所述硫酸铵水溶液的配制方法为：将350g硫酸铵添加到水中，溶解后定容为1L；灭菌温度120℃，灭菌时间20min。
葡萄糖水溶液的配制方法为：将900g结晶糖添加到水中，溶解后定容为1L；灭菌温度 120℃，灭菌时间20min。
所述种子培养基组分为：葡萄糖28g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨6g/L，硫酸铵4g/L，磷酸氢二钾4g/L，硫酸镁2g/L，硫酸亚铁0.04g/L，硫酸锰0.04g/L，氯霉素14mg/L，生物素0.003g/L。
所述发酵培养基组分为：葡萄糖12g/L，酵母粉6g/L，甜菜碱0.8g/L，磷酸氢二钾8g/L，硫酸镁1.8g/L，硫酸亚铁0.03g/L，硫酸锰0.03g/L，氯霉素12mg/L，生物素0.004g/L。
实施例2
精氨酸提取工艺：
步骤1)离心和陶瓷膜过滤：L-精氨酸发酵液通过高速碟片离心机以5000rpm的转速离心3min，去除沉淀，然后通过截留分子量为10000Da的陶瓷膜进行过滤，过滤温度控制在60 ℃，收集滤过液。
步骤2)过弱酸性阳离子树脂：将步骤1)所得的滤过液经弱酸性阳离子树脂吸附，然后用氨水洗脱，得到L-精氨酸洗脱液。
步骤3)脱氨：将步骤2)得到的洗脱液浓缩2倍脱至含氨0.02％以下，温度控制在55℃-65℃。
步骤4)纳滤膜脱色：将步骤3)得到的洗脱液用分子量500Da的纳滤膜进行脱色，过膜过程中温度控制在40℃左右，脱色时间30min左右，压力10bar，加水量0.1-0.15倍。脱色液再通过分子量100Da纳滤膜纳滤除盐和浓缩，透光>95％。
步骤5)过强碱性阴离子树脂：将步骤4)所得的浓缩液过强碱性阴离子树脂，收集交换液。脱色液经强碱性阴离子树脂时流速为1～1.5BV/h，有波美度时开始收集，结束后压1.5 倍树脂体积的水，过程透光＞98％。
步骤6)浓缩结晶：将步骤5)得到的交换液打入四效蒸发器，蒸发温度50℃，浓缩至50％左右放罐，将浓缩液经冷凝水冷却结晶，用30％酒精洗晶20s，得到L-精氨酸湿结晶，湿成品水份<10％。
步骤7)干燥包装：将步骤6)得到的湿成品经真空干燥机烘干后包装得到L-精氨酸成品，烘干温度控制在70℃，成品水分小于0.3％。
实施例3
发酵培养基组分对精氨酸产量的影响。
一、在对比文件1的基础上，额外添加不同碳源，包括蔗糖、甘油，添加浓度分别为0， 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，单位为g/L，如图1所示，蔗糖添加对精氨酸产量没有明显影响，而甘油能够提高精氨酸产量，随着甘油浓度的增加，精氨酸的含量随之提高，但随着浓度增加到5g/L时接近峰值，继续增加时，精氨酸的产量没有明显变化。综合考虑产量和成本等因素，当甘油浓度为5g/L时，为最佳添加量。
二、验证葡萄糖水溶液添加量和组分对精氨酸产酸的影响。
通过实验验证葡萄糖水溶液添加量对发酵产酸的影响。分别以不同的流速添加葡萄糖水溶液，随着流加量的增大，精氨酸的含量随之提高，但随着流速继续增加时，精氨酸的产量逐渐开始下降。过高的糖浓度将会抑制菌株的最佳产酸能力，因而当流速为0.2L/h时，为最佳流加糖速率。在该流速的基础上，确定葡萄糖水溶液中甜菜碱添加量对精氨酸的影响，如图2所示，随着甜菜碱的增加，精氨酸的含量随之提高，但随着浓度增加到3g/L时接近峰值，继续增加时，精氨酸的产量没有明显变化。因而选择甜菜碱浓度为3g/L时，为最佳添加量。
三、硫酸铵水溶液添加量和组分对精氨酸产酸的影响。
通过实验验证硫酸铵水溶液添加量对发酵产酸的影响。设置不同梯度的硫酸铵水溶液添加量，当流速为80ml/h时，精氨酸产酸达到最大，氮源的增加促进了菌体生长和产物积累。当硫酸铵流速大于80ml/h时，继续增加流速，精氨酸的产量不在增加，说明80ml/h的流速已满足精氨酸产酸需求。
在该流速的基础上，确定硫酸铵水溶液中谷氨酸钠添加量对精氨酸的影响(甜菜碱浓度设为3g/L)，如图3所示，随着谷氨酸钠的增加，精氨酸的含量随之提高，但随着浓度增加到200g/L时达到峰值，继续增加时，精氨酸的产量并没有显著变化。因而选择谷氨酸钠浓度为200g/L时，为最佳添加量。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了介绍，但并非对本发明保护范围的限值，所属领域技术人员应该明白，这对本领域技术人员而言应该很明确，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明保护的范围。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：利用生物酶解制备芹菜素的方法