阅读说明：本技术 一种生物催化法生产2,5-二甲基吡嗪的方法 (Method for producing 2, 5-dimethylpyrazine by biocatalysis method ) 是由 郭宏明 于 2020-04-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种生物催化法生产2,5-二甲基吡嗪的方法,涉及生物催化技术领域。本发明于LB培养基中添加氨苄青霉素作为液体培养基,培养2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株,得种子培养物,对所得种子培养物进行发酵、补糖处理,得发酵处理物,再对发酵处理物进行诱导处理,得2,5-二甲基吡嗪合成酶,接着以L-苏氨酸为底物,采用所得酶进行生物催化,得到2,5-二甲基吡嗪。本发明公布了一种全新的合成路线,反应条件温和,原料价格低廉,并可避免化学合成造成的环境污染。本发明解决了目前制备2,5-二甲基吡嗪常用采用化学合成,合成过程的条件苛刻,并有毒气散发和爆炸的危险,往往会造成严重污染,所用试剂成本高的问题。(The invention discloses a method for producing 2, 5-dimethylpyrazine by a biocatalysis method, and relates to the technical field of biocatalysis. Ampicillin is added into an LB culture medium to be used as a liquid culture medium, a 2, 5-dimethylpyrazine synthetase strain is cultured to obtain a seed culture, the obtained seed culture is fermented and subjected to sugar supplement treatment to obtain a fermentation treatment product, the fermentation treatment product is subjected to induction treatment to obtain 2, 5-dimethylpyrazine synthetase, and then L-threonine is used as a substrate and the obtained enzyme is adopted for biological catalysis to obtain the 2, 5-dimethylpyrazine. The invention discloses a brand new synthetic route, which has mild reaction conditions and low raw material price and can avoid environmental pollution caused by chemical synthesis. The invention solves the problems that the existing method for preparing 2, 5-dimethyl pyrazine usually adopts chemical synthesis, the synthesis process has harsh conditions, toxic gas emission and explosion risks, serious pollution is often caused, and the cost of used reagents is high.)

一种生物催化法生产2,5-二甲基吡嗪的方法

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，尤其涉及一种生物催化法生产2,5-二甲基吡嗪的方法。

背景技术

2,5-二甲基吡嗪是一种无色至微黄色液体，沸点155℃，闪点64℃，混溶于水和有机溶剂。天然品存在于球茎甘兰、猪肉、朗姆酒、可可、咖啡、土豆片、河虾等中。该品具有坚果香、花生、霉味、壤香、土豆、脂肪香、可可粉的气味，7.5mg/kg的溶液具有坚果、土豆、脂肪的味道，是我国GB-2760-86规定为允许使用的香料，主要用于配制可可、咖啡、肉类、坚果和马铃薯等型香精，还可用于染料及制药工业。

目前2,5-二甲基吡嗪的合成方法主要有以下几种：

1.由含有活泼亚甲基的酮类化合物合成。首先用亚硝酸盐把含有活泼亚甲基的酮还原成α-氨基酮，然后脱水环化生成二氢吡嗪，进一步脱氢生成吡嗪。该方法反应步骤多，不适宜大规模工业化生产。

2.以一异丙醇胺和乙二胺为原料，采用氨水沉淀法制备反应所需的催化剂，由α-二胺和α-乙醇胺合成2,5-二甲基吡嗪。此法虽然工艺路线短，但选择性差，不能得到单一产物，产品分离较困难。

3.在铵盐的存在下，丙烯醛和氨在甘油中加热反应可得到2,5-二甲基吡嗪，但丙烯醛为剧毒物质且反应过程易发生爆炸，故不宜采用此法。

4.由α-二胺和环氧丙烷合成，该法采用气固相接触催化反应，产物是2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪的混合物，产品分离、纯化困难。

5.以一异丙醇胺为原料，气固催化合成2,5-二甲基吡嗪，不同催化剂的结果也相差较大，铝硅酸盐沸石和氧化锌做催化剂时收率较低，含银催化剂的工业制备成本较高。

目前制备2,5-二甲基吡嗪常用采用化学合成，合成过程的条件苛刻，并有毒气散发和爆炸的危险，往往会造成严重污染，所用试剂成本高的问题。因而对全新的温和、能够降低生产成本的工艺具有迫切的需求。

发明内容

本发明的目的在于：为了解决目前制备2,5-二甲基吡嗪常用采用化学合成，合成过程的条件苛刻，并有毒气散发和爆炸的危险，往往会造成严重污染，所用试剂成本高的问题，而提出的一种生物催化法生产2,5-二甲基吡嗪的方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种生物催化法生产2,5-二甲基吡嗪的方法，该方法如下：

(1)于LB培养基中添加抗生素作为液体培养基；

(2)以步骤(1)所得液体培养基培养2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株，得种子培养物；

(3)对步骤(2)所得种子培养物进行发酵；

(4)对步骤(3)的发酵过程进行补糖处理，继续发酵，得发酵处理物；

(5)对步骤(4)所得发酵处理物进行诱导处理，得2,5-二甲基吡嗪合成酶；

(6)以L-苏氨酸为底物，采用步骤(5)所得2,5-二甲基吡嗪合成酶进行生物催化。

作为上述技术方案的进一步描述：

所述LB培养基：按质量份数计，取11～14份KH₂PO₄、3～5份(NH₄)₂SO₄、1.2～2.5份一水合柠檬酸、0.4～0.8份MgSO₄·7H₂O、8～12份一水合葡萄糖、1000份水混合，灭菌，即得LB培养基；

所述步骤(1)～(5)构成2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株的高密度发酵表达的过程。

作为上述技术方案的进一步描述：

所述一种生物催化法生产2,5-二甲基吡嗪的方法，该方法包括如下步骤：

(1)液体培养基的制备：按质量份数计，取11～14份KH₂PO₄、3～5份(NH₄)₂SO₄、1.2～2.5份一水合柠檬酸、0.4～0.8份MgSO₄·7H₂O、8～12份一水合葡萄糖、1000份水混合，灭菌，冷却至20～39℃，加入无菌水质量1‰的抗生素混合，得液体培养基；

(2)种子培养物的制备：按5％的接种量取2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株在液体培养基中培养，控制温度为37℃，培养4～6h，得种子培养物；

(3)发酵过程控制：调节步骤(2)所得种子培养物的pH，密闭通气维持内部溶氧量为总质量的30～60％，于37℃震荡摇床，保温发酵处理；

(4)补糖处理：对步骤(3)的发酵过程进行补糖处理，控制溶氧为总质量的20～30％，根据溶氧调整补糖速率，控制残糖浓度为0～0.1g/L；

(5)诱导处理：待发酵培养过程经过12～14h，控制菌体OD₆₀₀值为20～40，则降温，按质量体积比为0.01～1％加入诱导剂，震荡摇床诱酶表达10～24h，得2,5-二甲基吡嗪合成酶；

(6)生物催化：按质量份数计，取78～100份Tris-HCl缓冲液、5～80份2,5-二甲基吡嗪合成酶、1～100份底物、0～6份NAD⁺液混合，于20～40℃反应，出料，即得2,5-二甲基吡嗪。

作为上述技术方案的进一步描述：

所述一种生物催化法生产2,5-二甲基吡嗪的方法，该方法具体包括如下步骤：

(1)液体培养基的制备：按质量份数计，取11～14份KH₂PO₄、3～5份(NH₄)₂SO₄、1.2～2.5份一水合柠檬酸、0.4～0.8份MgSO₄·7H₂O、8～12份一水合葡萄糖、1000份水混合，于121℃保温灭菌12～20min后，自然冷却至20～39℃，加入无菌水质量1‰的抗生素混合均匀，得液体培养基；

(2)种子培养物的制备：按5％的接种量取2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株在液体培养基中培养，控制温度为37℃，培养4～6h，控制OD₆₀₀为1.8～2.0，得种子培养物；

(3)发酵过程控制：调节步骤(2)所得种子培养物的pH至4～8，移至可通气试管进行密闭并控制通气速率为1～1.5mL/min维持其内部溶氧量为总质量的30～60％，于20～40℃，以220r/min震荡摇床，保温发酵处理6～8h，并控制OD₆₀₀值在9.7～10.3；

(4)补糖处理：对步骤(3)的发酵过程的第8～30h期间内补充一水葡萄糖，控制溶氧为总质量的20～30％，控制残糖浓度为0～0.1g/L；

(5)诱导处理：待发酵培养过程经过12～14h，控制菌体OD₆₀₀值为20～40，则降温至20～37℃，按质量体积比为0.01～1％加入诱导剂混合，以220r/min震荡摇床诱酶表达10～24h，得2,5-二甲基吡嗪合成酶；

(6)生物催化：按质量份数计，取78～100份浓度0.5M且pH值为6.0～8.5的Tris-HCl缓冲液、5～80份2,5-二甲基吡嗪合成酶、1～100份底物、0～6份浓度为0～1mM的NAD⁺液混合，于20～40℃，反应25～30h，出料，灭酶，即得2,5-二甲基吡嗪。

作为上述技术方案的进一步描述：

所述步骤(1)中的抗生素为浓度50μg/mL的氨苄青霉素。

作为上述技术方案的进一步描述：

所述步骤(5)中的酶诱导剂为浓度5g/L的乳糖溶液、浓度30～50ppm的异丙基硫代半乳糖苷中的任意一种。

作为上述技术方案的进一步描述：

所述步骤(5)或步骤(6)中的酶为2,5-二甲基吡嗪合成酶。

作为上述技术方案的进一步描述：

所述2,5-二甲基吡嗪合成酶的酶形式为酶粉、酶液、已固定化的酶、产2,5-二甲基吡嗪合成酶的菌体、产2,5-二甲基吡嗪合成酶的细胞中的任意一种。

作为上述技术方案的进一步描述：

所述2,5-二甲基吡嗪合成酶为粗酶或纯酶。

作为上述技术方案的进一步描述：

所述步骤(6)中的底物为浓度200mM的L-苏氨酸。

作为上述技术方案的进一步描述：

所述2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株为2,5-二甲基吡嗪生产菌株(DMP009)。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

(1)本发明于LB培养基中添加氨苄青霉素作为液体培养基，培养2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株，得种子培养物，对所得种子培养物进行发酵、补糖处理，得发酵处理物，再对发酵处理物进行诱导处理，得2,5-二甲基吡嗪合成酶，接着以L-苏氨酸为底物，采用所得酶进行生物催化，在2,5-二甲基吡嗪合成酶的作用下使得苏氨酸羟基上的氢发生解离，羧基自动脱离，同时发生缩合重排，形成中间体，两分子中间体发生自动环化，得到2,5-二甲基吡嗪；

(2)由本发明实施例所得结果作图，可得如下结论：由图2可知，不同菌体细胞终浓度的2,5-二甲基吡嗪合成酶均可起到促进底物进行转换的作用，并且随着作用时间的延长，转化率都得以提升，作用时间至8h后逐渐平缓；由图3可知，不同pH条件下，均能够稳定表现出对转化效果，在该pH范围内，pH为6.0时的转化率最低，pH为8.0时的转化率最高；由图4可知，不同NAD⁺浓度作用下，均可完成底物的转化，其中浓度为1mM的转化效率最高，浓度为0时的转化率最低，可见在一定浓度范围内，NAD⁺浓度的升高对于转化率提升作用；由图5可知，添加酵母粉可使得底物转化效果得到提升，并在一定浓度范围内，随着酵母粉的用量的增大，可提升转化效果，而蛋白胨含量的增多则反而促使质量转化效果的降低，蛋白胨添加量占比1％时的转化效果与不添加酵母粉、蛋白胨时效果相接近；由图6可知，根据生物器反应曲线，OD值为25的转化效果高于OD值为12.5时的，可表明在一定浓度范围内，菌体终浓度与转化效果正相关；综上可知，本发明在不同转化条件下，经所得酶作用转化均可获得2,5-二甲基吡嗪，并且，条件可以优化为pH＝8.0，NAD⁺浓度为1mM，酵母粉占比1％，菌体OD值为25；

(3)本发明公布了一种全新的合成路线，反应条件温和，原料价格低廉，并可避免化学合成造成的环境污染，本发明解决了目前制备2,5-二甲基吡嗪常用采用化学合成，合成过程的条件苛刻，并有毒气散发和爆炸的危险，往往会造成严重污染，所用试剂成本高的问题。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明的催化路线图；

图2是反应时间对催化效果影响图；

图3是反应pH对催化效果的影响图；

图4是辅酶因子NAD⁺浓度对催化效果的影响图

图5是添加酵母或者蛋白胨对催化反应的影响图；

图6是生物反应器扩大反应体系的影响图；

图7是高密度发酵曲线图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

抗生素为浓度为50μg/mL的氨苄青霉素。

酶诱导剂为浓度5g/L的乳糖溶液、浓度30～50ppm的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)中的任意一种。

底物为浓度200mM的L-苏氨酸。

2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株为2,5-二甲基吡嗪生产菌株(DMP009)。

酶为2,5-二甲基吡嗪合成酶，并且2,5-二甲基吡嗪合成酶的酶形式不限，为酶粉、酶液、已固定化的酶以及产2,5-二甲基吡嗪合成酶的菌体或细胞中的任意一种，2,5-二甲基吡嗪合成酶可以是粗酶也可以是纯酶。

步骤(1)～(5)构成2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株的高密度发酵表达的过程。

一种生物催化法生产2,5-二甲基吡嗪的方法，包括如下步骤：

(1)液体培养基的制备：按质量份数计，取11～14份KH₂PO₄、3～5份(NH₄)₂SO₄、1.2～2.5份一水合柠檬酸、0.4～0.8份MgSO₄·7H₂O、8～12份一水合葡萄糖、1000份水混合，于121℃保温灭菌12～20min后，自然冷却至20～39℃，加入无菌水质量1‰的抗生素混合均匀，得液体培养基；

(2)种子培养物的制备：按5％的接种量取2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株在液体培养基中培养，控制温度为20～37℃，培养4～6h，控制OD₆₀₀为1.8～2.0，得种子培养物；

(3)发酵过程控制：用浓度1M的HCl溶液调节步骤(2)所得种子培养物的pH至4～8，移至可通气试管进行密闭并控制通气速率为1～1.5mL/min维持其内部溶氧量为总质量的30～60％，于20～40℃，以220r/min震荡摇床，保温发酵处理6～8h，控制OD₆₀₀值在9.7～10.3；

(4)补糖处理：对步骤(3)的发酵过程的第8～30h期间内补充一水葡萄糖，控制溶氧为总质量的20～30％，控制残糖浓度为0～0.1g/L；

(5)诱导处理：待发酵培养过程经过12～14h，控制菌体OD₆₀₀值为20～40，则降温至20～37℃，按质量体积比为0.01～1％加入诱导剂，以220r/min震荡摇床诱酶表达10-24h，得2,5-二甲基吡嗪合成酶；

(6)生物催化：按质量份数计，取78～100份浓度0.5M且pH值为6.0～8.5的Tris-HCl缓冲液、5～80份OD₆₀₀值为20～40的2,5-二甲基吡嗪合成酶、1～100份底物、0～6份浓度为0～1mM的NAD⁺液于可通气试管混合，于20～40℃，以200rpm反应25～30h，出料，灭酶，即得2,5-二甲基吡嗪。

实施例1

抗生素为浓度为50μg/mL的氨苄青霉素。

酶诱导剂为浓度5g/L的乳糖溶液。

底物为浓度200mM的L-苏氨酸。

酶为2,5-二甲基吡嗪合成酶，酶形式为粗酶液。

2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株为2,5-二甲基吡嗪生产菌株(DMP009)。

步骤(1)～(5)构成2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株的高密度发酵表达的过程。

一种生物催化法生产2,5-二甲基吡嗪的方法，包括如下步骤：

(1)液体培养基的制备：按质量份数计，取12份KH₂PO₄、4份(NH₄)₂SO₄、1.6份一水合柠檬酸、0.6份MgSO₄·7H₂O、10份一水合葡萄糖、1000份水混合，于121℃保温灭菌16min后，自然冷却至25℃，加入无菌水质量1‰的抗生素混合均匀，得液体培养基；

(2)种子培养物的制备：按5％的接种量取2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株在液体培养基中培养，控制温度为37℃，培养5h，控制OD₆₀₀为2.0，得种子培养物；

(3)发酵过程控制：用浓度1M的HCl溶液调节步骤(2)所得种子培养物的pH至4.2，移至可通气试管进行密闭并控制通气速率为1～1.5mL/min维持其内部溶氧量为总质量的45％，于37℃，以220r/min震荡保温发酵处理7h，控制OD₆₀₀值在10；

(4)补糖处理：对步骤(3)的发酵过程的第8～30h期间内补充一水葡萄糖，控制溶氧为总质量的25％，控制残糖浓度为0.05g/L；

(5)诱导处理：待发酵培养过程经过13h，控制菌体OD₆₀₀值为20～40，则降温至30℃，按质量体积比为0.05％加入诱导剂，以220r/min震荡诱酶表达16h，得2,5-二甲基吡嗪合成酶；

(6)生物催化：按质量份数计，取100份浓度0.5M且pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液、50份OD₆₀₀值为20～40的2,5-二甲基吡嗪合成酶、80份底物、4份浓度为0～1mM的NAD⁺液于可通气试管混合，于25℃，以200rpm反应28h，出料，灭酶，即得2,5-二甲基吡嗪。

本实施例1以步骤(6)中的NAD⁺浓度、2,5-二甲基吡嗪合成酶的OD值为变量，进行6组实施试验，包括：NAD⁺浓度为1mM、酶的OD为20；NAD⁺浓度为0.1mM、酶的OD为20；NAD⁺浓度为0.1mM、冻干菌OD为20(冻干菌的处理：取OD为20的粗酶液以5000r/min离心12min，收集沉积物冷冻干燥，即得冻干菌。)；NAD⁺浓度为0mM、酶的OD为20；NAD⁺浓度为0mM、酶的OD为30；NAD⁺浓度为0mM、酶的OD为40。

实施例1不同菌体细胞浓度酶转化结果如图2所示。

实施例2

抗生素为浓度为50μg/mL的氨苄青霉素。

酶诱导剂为浓度5g/L的乳糖溶液。

底物为浓度200mM的L-苏氨酸。

酶为2,5-二甲基吡嗪合成酶，酶形式为粗酶液。

2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株为2,5-二甲基吡嗪生产菌株(DMP009)。

步骤(1)～(5)构成2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株的高密度发酵表达的过程。

一种生物催化法生产2,5-二甲基吡嗪的方法，包括如下步骤：

(1)液体培养基的制备：按质量份数计，取12份KH₂PO₄、4份(NH₄)₂SO₄、1.6份一水合柠檬酸、0.6份MgSO₄·7H₂O、10份一水合葡萄糖、1000份水混合，于121℃保温灭菌16min后，自然冷却至25℃，加入无菌水质量1‰的抗生素混合均匀，得液体培养基；

(2)种子培养物的制备：按5％的接种量取2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株在液体培养基中培养，控制温度为37℃，培养5h，控制OD₆₀₀为2.0，得种子培养物；

(3)发酵过程控制：用浓度1M的HCl溶液调节步骤(2)所得种子培养物的pH至4.2，移至可通气试管进行密闭并控制通气速率为1～1.5mL/min维持其内部溶氧量为总质量的45％，于37℃，以220r/min震荡摇床，保温发酵处理7h，控制OD₆₀₀值在10；

(4)补糖处理：对步骤(3)的发酵过程的第8～30h期间内补充一水葡萄糖，控制溶氧为总质量的25％，控制残糖浓度为0.05g/L；

(5)诱导处理：待发酵培养过程经过13h，控制菌体OD₆₀₀值为20，则降温至30℃，按质量体积比为0.05％加入诱导剂，以220r/min震荡摇床诱酶表达16h，得2,5-二甲基吡嗪合成酶；

(6)生物催化：按质量份数计，取100份浓度0.5M且pH值为6.0～8.5的Tris-HCl缓冲液、40份OD₆₀₀值为20的2,5-二甲基吡嗪合成酶、50份底物、10份浓度为1mM的NAD⁺液于可通气试管混合，于25℃，以200rpm反应28h，出料，灭酶，即得2,5-二甲基吡嗪。

本实施例2以步骤(6)中的Tris-HCl缓冲液的pH值为变量，进行6组实施试验，包括pH值分别为8.5、8.0、7.5、7.0、6.5、6.0。

实施例2转化体系不同条件pH条件的结果如图3所示。

实施例3

抗生素为浓度为50μg/mL的氨苄青霉素。

酶诱导剂为浓度5g/L的乳糖溶液。

底物为浓度200mM的L-苏氨酸。

酶为2,5-二甲基吡嗪合成酶，酶形式为粗酶液。

2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株为2,5-二甲基吡嗪生产菌株(DMP009)。

步骤(1)～(5)构成2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株的高密度发酵表达的过程。

一种生物催化法生产2,5-二甲基吡嗪的方法，包括如下步骤：

(1)液体培养基的制备：按质量份数计，取12份KH₂PO₄、4份(NH₄)₂SO₄、1.6份一水合柠檬酸、0.6份MgSO₄·7H₂O、10份一水合葡萄糖、1000份水混合，于121℃保温灭菌16min后，自然冷却至25℃，加入无菌水质量1‰的抗生素混合均匀，得液体培养基；

(2)种子培养物的制备：按5％的接种量取2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株在液体培养基中培养，控制温度为37℃，培养5h，控制OD₆₀₀为2.0，得种子培养物；

(3)发酵过程控制：用浓度1M的HCl溶液调节步骤(2)所得种子培养物的pH至5.2，移至可通气试管进行密闭并控制通气速率为1～1.5mL/min维持其内部溶氧量为总质量的45％，于37℃，以220r/min震荡摇床，保温发酵处理7h，控制OD₆₀₀值在10；

(4)补糖处理：对步骤(3)的发酵过程的第8～30h期间内补充一水葡萄糖，控制溶氧为总质量的25％，控制残糖浓度为0.05g/L；

(5)诱导处理：待发酵培养过程经过13h，控制菌体OD₆₀₀值为20，则降温至30℃，按质量体积比为0.05％加入诱导剂，以220r/min震荡摇床诱酶表达16h，得2,5-二甲基吡嗪合成酶；

(6)生物催化：按质量份数计，取100份浓度0.5M且pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液、50份OD₆₀₀值为20的2,5-二甲基吡嗪合成酶、40份底物、10份浓度为0～1mM的NAD⁺液于可通气试管混合，于25℃，以200rpm反应28h，出料，灭酶，即得2,5-二甲基吡嗪。

本实施例3以步骤(6)中的NAD⁺液的浓度为变量，进行4组实施试验，包括浓度分别为0、0.05mM、0.1mM、1mM。

实施例3反应体系中不同NAD⁺浓度条件下的转化结果如图4所示。

实施例4

抗生素为浓度为50μg/mL的氨苄青霉素。

酶诱导剂为浓度5g/L的乳糖溶液。

底物为浓度200mM的L-苏氨酸。

酶为2,5-二甲基吡嗪合成酶，酶形式为粗酶液。

2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株为2,5-二甲基吡嗪生产菌株(DMP009)。

步骤(1)～(5)构成2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株的高密度发酵表达的过程。

一种生物催化法生产2,5-二甲基吡嗪的方法，包括如下步骤：

(1)液体培养基的制备：按质量份数计，取12份KH₂PO₄、4份(NH₄)₂SO₄、1.6份一水合柠檬酸、0.6份MgSO₄·7H₂O、10份一水合葡萄糖、1000份水混合，于121℃保温灭菌16min后，自然冷却至25℃，加入无菌水质量1‰的抗生素混合均匀，得液体培养基；

(2)种子培养物的制备：按5％的接种量取2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株在液体培养基中培养，控制温度为37℃，培养5h，控制OD₆₀₀为2.0，得种子培养物；

(3)发酵过程控制：用浓度1M的HCl溶液调节步骤(2)所得种子培养物的pH至5.2，移至可通气试管进行密闭并控制通气速率为1～1.5mL/min维持其内部溶氧量为总质量的45％，于37℃，以220r/min震荡摇床，保温发酵处理7h，控制OD₆₀₀值在10；

(4)补糖处理：对步骤(3)的发酵过程的第8～30h期间内补充一水葡萄糖，控制溶氧为总质量的25％，控制残糖浓度为0.05g/L；

(5)诱导处理：待发酵培养过程经过13h，控制菌体OD₆₀₀值为20，则降温至30℃，按质量体积比为0.05％加入诱导剂，以220r/min震荡摇床诱酶表达16h，得2,5-二甲基吡嗪合成酶；

(6)生物催化：按质量份数计，取100份浓度0.5M且pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液、50份OD₆₀₀值为20的2,5-二甲基吡嗪合成酶、40份底物、10份浓度为1mM的NAD⁺液于可通气试管混合，于25℃，以200rpm摇床反应28h，出料，灭酶，即得2,5-二甲基吡嗪。

本实施例4以在步骤(6)生物催化过程中加入酵母粉或蛋白胨为变量，进行5组实施试验，包括：不添加酵母粉或蛋白胨；按质量体积比0.1％加入酵母粉；按质量体积比加入1％加入酵母粉；按质量体积比0.1％加入蛋白胨；按质量体积比1％加入蛋白胨。

实施例4反应体系中添加不同浓度酵母粉(YE)和蛋白胨(TRP)条件下的转化结果如图5所示。

实施例5

抗生素为浓度为50μg/mL的氨苄青霉素。

酶诱导剂为浓度5g/L的乳糖溶液。

底物为浓度200mM的L-苏氨酸。

酶为2,5-二甲基吡嗪合成酶，酶形式为粗酶液。

2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株为2,5-二甲基吡嗪生产菌株(DMP009)。

步骤(1)～(5)构成2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株的高密度发酵表达的过程。

一种生物催化法生产2,5-二甲基吡嗪的方法，包括如下步骤：

(1)液体培养基的制备：按质量份数计，取12份KH₂PO₄、4份(NH₄)₂SO₄、1.6份一水合柠檬酸、0.6份MgSO₄·7H₂O、10份一水合葡萄糖、1000份水混合，于121℃保温灭菌16min后，自然冷却至25℃，加入无菌水质量1‰的抗生素混合均匀，得液体培养基；

(2)种子培养物的制备：按5％的接种量取2,5-二甲基吡嗪合成酶菌株在液体培养基中培养，控制温度为37℃，培养5h，控制OD₆₀₀为2.0，得种子培养物；

(3)发酵过程控制：用浓度1M的HCl溶液调节步骤(2)所得种子培养物的pH至5.2，移至可通气试管进行密闭并控制通气速率为1～1.5mL/min维持其内部溶氧量为总质量的45％，于37℃，以220r/min震荡摇床，保温发酵处理7h，控制OD₆₀₀值在10；

(4)补糖处理：对步骤(3)的发酵过程的第8～30h期间内补充一水葡萄糖，控制溶氧为总质量的25％，控制残糖浓度为0.05g/L；

(5)诱导处理：待发酵培养过程经过13h，控制菌体OD₆₀₀值为20，则降温至30℃，按质量体积比为0.05％加入诱导剂，以220r/min震荡摇床诱酶表达16h，得2,5-二甲基吡嗪合成酶；

(6)生物催化：按质量份数计，取70份水、50份OD₆₀₀值为25或12.5的2,5-二甲基吡嗪合成酶、40份底物、10份浓度为1mM的NAD⁺液混合于可通气试管混合，以浓度1M的NaOH溶液调节pH至8.0，于25℃，以200rpm反应28h，出料，灭酶，即得2,5-二甲基吡嗪。

本实施例5以在步骤(6)2,5-二甲基吡嗪合成酶的OD₆₀₀值为变量，进行2组实施试验，包括：酶的OD₆₀₀值为12.5；酶的OD₆₀₀值为25。

实施例5生物反应器放大体系酶转化结果如图6所示。

根据GB29970-2013标准，测试获得数据如图2～6所示。

由图2可知，不同菌体细胞终浓度的2,5-二甲基吡嗪合成酶均可起到促进底物进行转换的作用，并且随着作用时间的延长，转化率都得以提升，作用时间至8h后逐渐平缓；

由图3可知，不同pH条件下，均能够稳定表现出对转化效果，在该pH范围内，pH为6.0时的转化率最低，pH为8.0时的转化率最高；

由图4可知，不同NAD⁺浓度作用下，均可完成底物的转化，其中浓度为1mM的转化效率最高，浓度为0时的转化率最低，可见在一定浓度范围内，NAD⁺浓度的升高对于转化率提升作用；

由图5可知，添加酵母粉可使得底物转化效果得到提升，并在一定浓度范围内，随着酵母粉的用量的增大，可提升转化效果，而蛋白胨含量的增多则反而促使质量转化效果的降低，蛋白胨添加量占比1％时的转化效果与不添加酵母粉、蛋白胨时效果相接近；

由图6可知，根据生物器反应曲线，OD值为25的转化效果高于OD值为12.5时的，可表明在一定浓度范围内，2,5-二甲基吡嗪合成酶浓度与转化效果正相关；

综上可知，本发明在不同转化条件下，经所得酶作用转化均可获得2,5-二甲基吡嗪，并且，条件可以优化为pH＝8.0，NAD⁺浓度为1mM，酵母粉质量体积占比1％，菌体OD值为25。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。