阅读说明：本技术 2-甲氧基雌莫司汀及其衍生物、制备方法和应用 (2-methoxy estramustine and derivatives, preparation method and application thereof ) 是由 周亚耀 于 2020-03-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了2-甲氧基雌莫司汀及其衍生物,其结构式如式1～4所示。本发明所述2-甲氧基雌莫司汀以2-甲氧雌二醇为载体,将烷化剂(氮芥)通过氨基甲酸酯连接组成双功能药物分子化合物,整个分子作为抗有丝分裂剂,氨基甲酸酯在体内代谢水解后,代谢物介导释放的2-甲氧基雌二醇仍可以继续发挥抗肿瘤作用。2-甲氧基雌莫司汀的衍生物可以作为2-甲氧基雌二醇的前药。本发明还公开了2-甲氧基雌莫司汀及其衍生物的制备方法,该制备方法可以制得2-甲氧基雌莫司汀及其衍生物,且收率较高。本发明还公开了2-甲氧基雌莫司汀及其衍生物在治疗肿瘤或多发性骨髓瘤药物中的应用。(The invention discloses 2-methoxy estramustine and derivatives thereof, and the structural formula of the 2-methoxy estramustine and the derivatives thereof is shown in formulas 1-4. The 2-methoxyestramustine takes 2-methoxyestradiol as a carrier, an alkylating agent (nitrogen mustard) is connected through carbamate to form a dual-functional drug molecular compound, the whole molecule is taken as an antimitotic agent, and after the carbamate is metabolized and hydrolyzed in vivo, the metabolite-mediated released 2-methoxyestradiol can still continuously play an antitumor role. Derivatives of 2-methoxyestramustine can be used as prodrugs of 2-methoxyestradiol. The invention also discloses a preparation method of the 2-methoxy estramustine and the derivatives thereof, and the preparation method can prepare the 2-methoxy estramustine and the derivatives thereof with higher yield. The invention also discloses application of the 2-methoxy estramustine and the derivatives thereof in medicaments for treating tumors or multiple myeloma.)

2-甲氧基雌莫司汀及其衍生物、制备方法和应用

技术领域

本发明涉及有机合成技术领域，具体涉及一类新化合物2-甲氧基雌莫司汀及其衍生物、制备方法和应用。

背景技术

目前，随着医学水平的提高，肿瘤治疗也取得了很大的进步，肿瘤患者的生存期明显延长，生存质量明显改善，主要得益于各种高效抗癌、抗肿瘤药物的发明和临床应用。但是，现在临床使用的一些肿瘤药物，在取得显著疗效的同时，往往也伴随着一些副作用和不良反应，对病人造成了极大的痛苦，严重影响了患者的生存质量。

如今,临床上使用的抗肿瘤药物有多种，氮芥抗肿瘤药物是其中的一类，如环磷酰胺、异环磷酰胺和氮甲等；这类药物在临床上应用广泛，但是靶向性不足，毒副作用严重等缺点严重地限制了氮芥类药物的广泛应用。目前，对氮芥类抗肿瘤化合物的开发研究集中在修饰载体结构部分上，主要通过设计具有靶向性载体的氮芥类药物减少毒副作用。雌莫司汀磷酸钠又称为磷酸雌二醇氮芥，临床上用于治疗前列腺癌，以雌二醇磷酸酯为载体，将氮芥(烷化剂)与雌二醇 -17-β-磷酸盐(激素)通过氨基甲酸酯连接组成，其整个分子为抗有丝分裂剂，氨基甲酸酯水解后，代谢物介导释放的雌激素发挥抗促性腺激素作用。雌莫司汀可通过类固醇受体特异性地把药物导入前列腺组织，产生细胞毒效能和激素效果，达到破坏癌细胞的目的。由于药物对肿瘤作用的专一性，从而提高了疗效，氮芥与雌二醇-17-β-磷酸盐通过氨基甲酸酯连接后，增加氮芥的稳定性，降低了氮芥和正常细胞的反应活性，从而减轻了氮芥的副作用及不良反应。

肿瘤的生长和转移均依赖于血管的营养和氧气供给，所以切断肿瘤血管新生成为当前寻求抗肿瘤药物的主要方向之一。2-甲氧基雌二醇(5)是已进入I- Ⅲ期临床研究的新生血管抑制剂，经验证对多种实体瘤的治疗有效，尤其是乳腺癌、前列腺癌及多发性骨髓瘤等。由于2-甲氧基雌二醇本身即为人体内源性的活性代谢产物而在临床上表现出低毒性，因此，2-甲氧基雌二醇作为新型的肿瘤化学治疗药物的开发前景非常具有优势。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供2-甲氧基雌莫司汀及其衍生物、制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

2-甲氧基雌莫司汀及其衍生物，其结构式如式1～4所示：

其中，R为氨基酸残基；可以为L-氨基酸，如甘氨酸，丙氨酸，组氨酸等常见的氨基酸，HY为盐酸、硫酸、磷酸、酒石酸、苹果酸或对甲苯磺酸；n＝2 或3。当n＝2或3时，对应不同的有机二元酸钠盐，如丁二酸、戊二酸。

本发明的目的还在于提供所述2-甲氧基雌莫司汀及其衍生物的制备方法，

式1和式2所示化合物的合成路线如下：

所述式1所示化合物的制备方法包括以下步骤：

将式5所示化合物溶于二氯甲烷中，加入三乙胺和4-二甲氨基吡啶，搅拌均匀；将N,N-二(2-氯乙基)氨基甲酰氯溶于二氯甲烷中，并滴加到上述反应液中，搅拌反应0.4～0.6小时，然后将反应液移至38～42℃的水浴保温反应至反应完全，停止反应，冷却反应液至室温，加入蒸馏水，搅拌下用盐酸溶液调节反应液pH 在5～6之间，萃取得有机相，减压蒸馏除去溶剂得到式1所示化合物；其中，式5所示化合物、三乙胺、4-二甲氨基吡啶和N,N-二(2-氯乙基)氨基甲酰氯的摩尔比为：1:(1.8～2.2):(0.08～0.12):(1.2～1.8)；

所述式2所示化合物的制备方法包括以下步骤：

(1)将三氯氧磷滴加到4～6℃的吡啶中，搅拌均匀，得三氯氧磷的吡啶溶液；将式1所示化合物溶于吡啶中，滴加至三氯氧磷的吡啶溶液中，反应完全后，将反应液倒入冰水混合物中，加入盐酸溶液调节pH值为2-3，过滤，取滤渣，干燥后溶于乙酸乙酯中，加入乙醇，滴加蒸馏水至产生的浑浊不再消失为止，加入少量的乙酸乙酯复溶，继续搅拌，过滤，取滤渣，干燥，得式6所示化合物；其中，式1所示化合物和三氯氧磷的摩尔比为：1:4～6

(2)在式6所示化合物加入无水甲醇，溶解，降温至0～5℃，得式6所示化合物的甲醇溶液；将金属钠溶于无水甲醇中，冷却至5～8℃，得甲醇钠的甲醇溶液；将甲醇钠的甲醇溶液滴加至式6所示化合物的甲醇溶液中，在0～5℃搅拌反应8～15分钟，加入0～5℃的无水乙醚，过滤，取滤渣，滤渣用无水乙醚洗涤，干燥，得式2所示化合物；其中，式6所示化合物和金属钠的摩尔比为：1:1.1～1.3；

式3所示化合物的合成路线如下：

所述式3所示化合物的制备方法包括以下步骤：

将式1所示化合物溶于二氯甲烷中，加入三乙胺，搅拌均匀，缓慢加入甘氨酰氯盐酸盐，搅拌至反应完全，加入蒸馏水，取有机相，用包合氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去部分溶剂，滴加HY的1,4-二氧六环溶液，搅拌，过滤，取滤渣，即得所述式3所示化合物；其中，所述式1所示化合物、三乙胺、甘氨酰氯盐酸盐和HY的摩尔比为：1:(2.5～3.5)：(1.2～1.8)：3～5；

式4所示化合物的合成路线如下：

所述式4所示化合物的制备方法包括以下步骤：

将式1所示化合物溶于二氯甲烷中，加入三乙胺和4-二甲氨基吡啶，搅拌均匀；将丁二酸酐或戊二酸酐溶于二氯甲烷中，滴加至上述反应液中，搅拌至反应完全，停止反应，冷却反应液至室温，加入蒸馏水，搅拌下用盐酸溶液调节反应液pH在5～6之间，萃取得有机相，洗涤，去除溶剂，得固体，固体用甲醇和水溶解，加入碳酸氢钠搅拌，减压蒸馏除去溶剂得固体，乙醇和乙醚重结晶，得式4所示化合物；其中，式1所示化合物、三乙胺、4-二甲氨基吡啶和丁二酸酐或戊二酸酐的摩尔比为：1：(1.8～2.2)：(0.08～0.12)：(1～1.2)。

本发明的目的还在于提供所述2-甲氧基雌莫司汀及其衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

优选地，所述肿瘤为前列腺癌、乳腺癌或结肠癌。

本发明的目的还在于提供所述2-甲氧基雌莫司汀及其衍生物在制备治疗多发性骨髓瘤药物的应用。

本发明的有益效果在于：本发明提供了新化合物2-甲氧基雌莫司汀及其衍生物。发明人通过研究发现，本发明所述2-甲氧基雌莫司汀(式1所示化合物) 以2-甲氧基雌二醇为载体，将烷化剂(氮芥)通过氨基甲酸酯连接组成双功能药物分子化合物，整个分子作为有丝分裂抑制剂，既可以发挥氮芥对肿瘤的细胞毒作用又可以发挥代谢物介导释放的2-甲氧基雌二醇的抗肿瘤作用。由于2-甲氧基雌二醇为内源性物质，与雌莫司汀的代谢产物雌二醇相比，其不良副作用会更少。2-甲氧基雌莫司汀的衍生物(式2～4所示化合物)可以作为2-甲氧基雌二醇的前药，旨在改善化合物的水溶性，从而提高生物利用度。前药在体内经各种活性酯酶或磷酸酯酶代谢水解后释放出具有活性的2-甲氧基雌莫司汀(式1 所示化合物)，进入人体的血液循环系统到达靶细胞，从而发挥与2-甲氧基雌莫司汀相同的抗肿瘤作用。本发明还提供了2-甲氧基雌莫司汀及其衍生物的制备方法，该制备方法可以制得2-甲氧基雌莫司汀及其衍生物，且收率较高。本发明还提供了2-甲氧基雌莫司汀及其衍生物在治疗肿瘤或多发性骨髓瘤药物中的应用。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例

式1和式2所示化合物的合成路线如下：

所述式1所示化合物的制备方法包括以下步骤：

将0.906g(3.0mmol)2-甲氧基-1,3,5(10)-三烯-3,17β-雌二醇(5)溶于30.0mL 二氯甲烷中，加入0.606g(6.0mmol)三乙胺，及0.037g(0.3mmol)4-二甲氨基吡啶/DMAP，室温搅拌10分钟；将0.918g(4.5mmol)N,N-二(2-氯乙基)氨基甲酰氯溶于5.0mL二氯甲烷中，缓慢滴加到上述反应液中，10分钟内滴加完毕，继续搅拌反应0.5小时，然后将反应液移至40℃的水浴保温反应2小时，TLC检测反应显示反应完全，停止反应，冷却反应液至室温，加入50.0mL蒸馏水，搅拌下用10％的盐酸溶液调节反应液pH在5-6之间，静置分层，分出有机层，水层用二氯甲烷萃取(20.0mL×3)，合并有机相，减压蒸馏除去溶剂得到灰白色固体粗品，热乙醇重结晶得到1.19g白色晶体化合物(式1所示化合物)，收率 84.4％；Ms(m/z):471.3；NMR(400MHz,DMSO):6.86(s,1H)，6.62(s,1H), 4.64-4.58(m,1H),3.83(s,4H),3.80(s,3H),3.74(s,4H),2.85-2.75(m,2H), 2.44-2.32(m，1H),2.20-2.06(m,2H),1.86-1.64(m,3H),1.58-1.24(m,7H)，0.79(s, 3H)。

所述式2所示化合物的制备方法包括以下步骤：

(1)量取20.0mL吡啶冷却至5℃，将0.92mL(10.0mmol)三氯氧磷缓慢滴加到反应液中，5分钟内滴加完毕，继续搅拌30分钟；将0.940g(2.0mmol) 化合物(1)溶于5.0mL吡啶中，然后缓慢滴加到上述反应液中，5分钟滴加完毕，然后继续保温反应0.5小时，TLC监测反应显示反应完全，停止反应。在搅拌下缓慢将反应液倒入到100.0mL的碎冰中，然后用36％浓盐酸溶液调节反应液pH值在2-3之间，随着盐酸溶液的加入，反应液中有大量的沉淀析出，继续搅拌10分钟，抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤至中性，干燥后得到化合物(式14所示化合物)的粗品，将粗品溶于9.0mL的乙酸乙酯，加入3.0mL乙醇，向反应液中滴加蒸馏水至有少量浑浊不再消失为止，加入少量的乙酸乙酯复溶，继续搅拌，逐渐有大量的沉淀析出，抽滤，滤饼真空干燥后得到0.683g化合物(式 6所示化合物)的纯品，收率62.1％；Ms(m/z):551.1；NMR(400MHz,DMSO): 6.86(s,1H)，6.62(s,1H),4.69-4.62(m,1H),3.83(s,4H),3.80(s,3H),3.74(s,4H), 2.85-2.75(m,2H),2.44-2.32(m，1H),2.20-2.06(m,2H),1.86-1.64(m,3H),1.58-1.24(m,7H)，0.79(s,3H)；

(2)称取0.55g(1.0mmol)化合物(式6所示化合物)，加入10.0mL无水甲醇，室温搅拌完全溶解，反应液移至冰浴中冷却至0-5℃，得式6所示化合物的甲醇溶液；将0.0276g(1.20mmol)金属钠加入到2.0mL无水甲醇中，金属钠完全溶解在甲醇中，冷却至5-8℃，得甲醇钠的甲醇溶液；将甲醇钠的甲醇溶液缓慢滴加到式6所示化合物的甲醇溶液中，1分钟内滴加完毕，反应液继续在 0-5℃搅拌10分钟。向反应液中滴加20.0mL0-5℃的无水乙醚，反应液中有大量的沉淀析出，抽滤，滤饼用无水乙醚洗涤，真空干燥后得到0.42g化合物(式2所示化合物)，收率70.6％。Ms(m/z):595.2；NMR(400MHz,DMSO):6.86(s,1H)， 6.62(s,1H),4.69-4.62(m,1H),3.83(s,4H),3.80(s,3H),3.74(s,4H),2.85-2.75(m, 2H),2.44-2.32(m，1H),2.20-2.06(m,2H),1.86-1.64(m,3H),1.58-1.24(m,7H)， 0.79(s,3H)。

式3所示化合物的合成路线如下：

所述式3所示化合物的制备方法包括以下步骤：

将0.470g(1.0mmol)2-甲氧雌莫司汀(式1所示化合物)溶于20.0mL二氯甲烷中，加入0.303g(3.0mmol)三乙胺，室温搅拌10分钟；将0.195g(1.5mmol) 甘氨酰氯盐酸盐分批小量多次缓慢加入到上述反应液中，10分钟内完毕，继续搅拌反应2小时，TLC检测反应显示反应完全，停止反应，加入50.0mL蒸馏水，分层后取有机层，饱和氯化钠溶液洗涤(20.0mL×3)，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去一半溶剂，滴加4M的HCl 1,4-二氧六环溶液1.0mL，搅拌下反应 30分钟后有大量的白色沉淀析出，停止反应后抽滤，滤饼用二氯甲烷洗涤 (5.0mL×3)，真空干燥后得到0.49g白色晶体化合物(式3所示化合物)，收率80.0％。Ms(m/z):564.3；NMR(400MHz,DMSO):6.86(s,1H)，6.62(s,1H), 4.74-4.70(m,1H),3.83(s,4H),3.80(s,3H),3.74(s,4H),3.64(s,2H),2.85-2.75(m, 2H),2.44-2.32(m，1H),2.20-2.06(m,2H),1.86-1.64(m,3H),1.58-1.24(m,7H)， 0.79(s,3H)。

式4所示化合物的合成路线如下：

将0.470g(1.0mmol)2-甲氧基雌莫司汀(式1所示化合物)溶于20.0mL二氯甲烷中，加入0.202g(2.0mmol)三乙胺，及0.012g(0.1mmol)4-二甲氨基吡啶 /DMAP，室温搅拌10分钟；将0.110g(1.1mmol)丁二酸酐溶于5.0mL二氯甲烷中，缓慢滴加到上述反应液中，3分钟内滴加完毕，继续搅拌反应5小时，TLC 检测反应显示反应完全，停止反应，冷却反应液至室温，加入50.0mL蒸馏水，搅拌下用10％的盐酸溶液调节反应液pH在5-6之间，静置分层，分出有机层，水层用二氯甲烷萃取(10.0mL×3)，合并有机相并用饱和食盐水洗涤(20.0mL ×3)，减压蒸馏除去溶剂得到固体，固体用10.0mL甲醇和2.0mL水溶解，然后加入0.84g(1.0mmol)碳酸氢钠搅拌30分钟，减压蒸馏除去溶剂得到固体，乙醇和乙醚重结晶得到0.51g化合物(式4所示化合物)，收率86.0％。Ms(m/z): 593.2；NMR(400MHz,DMSO):6.86(s,1H)，6.62(s,1H),4.72-4.69(m,1H),3.83(s, 4H),3.80(s,3H),3.74(s,4H),2.85-2.75(m,2H),2.65(t,J＝8.4Hz，2H),2.61(t, J＝8.4Hz，2H),2.44-2.32(m，1H),2.20-2.06(m,2H),1.86-1.64(m,3H),1.58-1.24(m, 7H)，0.79(s,3H)。

对照化合物雌莫司汀的合成

合成路线如下所示：

将4.00g(14.7mmol)1,3,5(10)-三烯-3,17β-雌二醇(式14所示化合物)溶于150.0mL二氯甲烷中，加入2.97g(29.4mmol)三乙胺，及0.19g(1.5mmol)4-二甲氨基吡啶/DMAP，室温搅拌10分钟；将4.51g(22.1mmol)N,N-二(2-氯乙基) 氨基甲酰氯溶于50.0mL二氯甲烷中，缓慢滴加到上述反应液中，30分钟内滴加完毕，继续搅拌反应1小时，然后将反应液移至40℃的水浴保温反应3小时。 TLC检测反应显示反应完全，停止反应，冷却反应液至常温，加入50.0mL蒸馏水，搅拌下用10％的盐酸溶液调节反应液pH在5-6之间，静置分层，分出有机层，水层用二氯甲烷萃取(50.0mL×3)，合并有机相，减压蒸馏除去溶剂得到灰白色固体粗品，热乙醇重结晶得到6.09g白色晶体化合物(式15所示化合物)，收率94.1％。Ms(m/z):441.2；NMR(400MHz,DMSO):7.32-7.26(d,1H,J＝8.4 Hz)，6.84-6.82(d,1H，J＝8.4Hz),6.79(s,1H)，3.83(s,4H),3.74(s,4H),3.73-3.68 (m,1H),2.85-2.75(m,2H),2.34-2.26(m，1H),1.88-1.64(m,4H),1.56-1.44(m,2H), 1.42-1.26(m,6H)，0.83(s,3H)。

测试式1、5、15所示化合物的抗肿瘤活性，其中式1、5、15所示化合物的结构式如下，式5所示化合物购自市场。多发性骨髓瘤细胞系(LP1、RPMI8226、 OCI-MCY5)、乳腺癌细胞系(MDA-MB-435)、结肠癌细胞系(HCT-116)和前列腺癌细胞系(LNCaP)均购自市场。式1、5、15所示化合物的抗肿瘤活性是使用MTS kit(CellTiter 96 AQ_ueous One Solutionreagent；Promega Corporation, Madison,WI,USA)测试获得的结果。

实验步骤：50.0微升细胞按2×10⁴个/孔接种于在96孔板中，每个浓度设2 个复孔。将50.0微升含有不同浓度的被测试化合物(DMSO浓度小于0.1％)加入孔中，在37℃下孵育72小时；加入15微升含有MTS(0.5mg/mL)的培养基，在培养箱中放置4小时。使用多孔板酶标仪检测570nm或490nm的吸光值。以样品和对照物的吸收值的比值来计算细胞生长的抑制。每个化合物的实验至少重复5次，最后计算IC₅₀值，如表1和2所示。

1、对多发性骨髓瘤细胞系抑制活性实验数据见表1：

表1

2、对乳腺癌、结肠癌和前列腺癌细胞系抑制活性实验数据见表2：

表2

EPI为美国Pharmacia公司产品。分子量：579.98

从表1和表2可以看出，2-甲氧基雌莫司汀(式1所示化合物)对多发性骨髓瘤、乳腺癌、结肠癌和前列腺癌细胞系均有较高的抑制活性。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。