阅读说明：本技术 抗ck19蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用 (anti-CK 19 protein monoclonal antibody, cell line, preparation method and application thereof ) 是由 高惠然 杨清海 陈惠玲 周洪辉 王小亚 于 2020-04-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物检测领域,提供了一种抗CK19蛋白单克隆抗体,其重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。发明人还提供了抗CK19蛋白单克隆抗体的制备方法,选取人CK19氨基酸SEQ ID NO.1序列并与KLH偶联,在其羧基端添加了一个半胱氨酸后,作为免疫原。发明人还提供了一株分泌抗CK19蛋白的杂交瘤细胞系,所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系AbM58058-41A2-PU,保藏号为：CGMCC NO.17489。抗CK19蛋白单克隆抗体,具有高特异性、敏感性,可以特异性识别表达CK19蛋白的细胞,适用于免疫学检测,特别是免疫组化检测。(The invention relates to the field of biological detection, and provides an anti-CK 19 protein monoclonal antibody, wherein the amino acid sequences of heavy chain and light chain variable regions of the anti-CK 19 protein monoclonal antibody are respectively amino acid sequences shown in SEQ ID No.2 and SEQ ID No. 3. the inventor also provides a preparation method of the anti-CK 19 protein monoclonal antibody, selects a human CK19 amino acid SEQ ID No.1 sequence, is coupled with K L H, adds a cysteine at the carboxyl end of the human CK19 amino acid SEQ ID No.1 sequence and serves as an immunogen, and also provides a hybridoma cell line secreting anti-CK 19 protein, wherein the cell line is a mouse hybridoma cell line AbM58058-41A2-PU with the preservation number of CGMCC NO.17489 and the anti-CK 19 protein monoclonal antibody, has high specificity and sensitivity, can specifically identify cells expressing the CK19 protein, and is suitable for immunological detection, particularly immunohistochemical detection.)

抗CK19蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及抗CK19蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用。

背景技术

CK19分子量为40kDa，主要标记各种单层上皮包括腺上皮，主要用于腺癌的诊断。肝细胞不表达CK19，因此可用于肝癌和转移性腺癌的鉴别。CK19在诊断应用主要为1甲状腺滤泡性乳头状癌与滤泡癌的鉴别、2胆管细胞癌与肝细胞癌的鉴别、3脊索瘤与副脊索瘤的鉴别。

发明内容

发明人提供了一种抗CK19蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体重链和轻链可变区氨基酸序列分别是SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列所编码。

进一步地，所述单克隆抗体特异性识别CK19蛋白。

进一步地，所述单克隆抗体特异性识别中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.17489的杂交瘤细胞系产生。所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系AbM58058-41A2-PU，分类命名为：小鼠杂交瘤细胞系，该细胞系已于2019年04月3日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

进一步地，所述抗CK19蛋白为小鼠IgG2a亚型单克隆抗体。

发明人还提供了一种抗CK19蛋白单克隆抗体的制备方法，选取CK19蛋白中SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列,在其羧基端添加了一个半胱氨酸后，与载体蛋白KLH进行偶联作为免疫原。

发明人还提供了一株分泌抗CK19蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系AbM58058-41A2-PU，所述细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.17489。

发明人还提供上述任一所述的抗CK19蛋白单克隆抗体，在CK19蛋白免疫检测中的用途。

进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。

区别于现有技术，上述技术方案依据CK19蛋白与DNA结合的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择具有区别于其他类似蛋白、长度适宜且具有特殊抗原性的氨基酸序列KAALEDTLAETEARFGAQLAHIQA(SEQ ID No.1)区域作为抗原肽。在其羧基端添加了一个半胱氨酸，并偶联KLH，作为免疫源CK19-KLH。对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗CK19蛋白单克隆抗体的单克隆细胞系AbM58058-41A2-PU,以及由该细胞系所分泌的抗CK19蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达CK19蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

附图说明

图1为AbM58058-41A2-PU杂交瘤分泌抗体的免疫印迹检测结果。

图2为甲状腺乳头状癌样本免疫组化染色结果图(左为AbM58058-41A2-PU的CK19，右为市售CK19)。

图3为结肠癌样本免疫组化染色结果图(左为AbM58058-41A2-PU的CK19，右为市售CK19)。

图4为胃癌样本1免疫组化染色结果图(左为AbM58058-41A2-PU的CK19，右为市售CK19)。

图5为胃癌样本2免疫组化染色结果图(左为AbM58058-41A2-PU的CK19，右为市售CK19)。

具体实施方式

实施例1免疫原的制备

一、免疫原制备

一、抗原多肽选择

依据Uniprot中登录号为P08727的蛋白质序列进行序列和二级结构分析，全长为400个氨基酸长度的CK19蛋白分子量约为44kDa左右。依据通过在线服务器http://www.cbs.dtu.dk/services/NetSurfP/预测的蛋白的二级结构(secondary structure)和表面可及性(Surface Accessibility)参数，并通过对其抗原性指数(Jameson BA,WolfH.The antigenic index:a novel algorithm for predicting antigenicdeterminants.Comput Appl Biosci.1988,4(1):181-6.)的分析结果，选择靠近C末端的氨基酸序列KAALEDTLAETEARFGAQLAHIQA作为抗原进行化学合成，为便于偶联，在该多肽的羧基端添加了一个半胱氨酸用于提供巯基偶联。

二、多肽的偶联及纯化

选择Thermo Scientific(货号：77653)的马来酰胺活化的匙孔嘁血蓝蛋白试剂盒，按照试剂盒提供的流程操作。对于待偶联的多肽，首先以Ellman试剂(ThermoScientific，货号：22582)检测多肽中自由巯基：在96孔板中加入100μL Ellman试剂储备液，再加入10μL多肽溶液，用Nano Drop分光光度计在λ＝412nm下测其紫外吸收值，如果OD值>0.15做下一步；OD值<0.15并>0.05补加多肽，直至达到要求；OD值<0.05返回多肽合成步骤重质控。开始偶联时，在每个mcKLH包装中加入200μL去离子水，配制成10mg/mL的KLH溶液，在500μL的Imject EDC偶联缓冲液中溶解2mg半抗原，将500μL多肽溶液加入到200μL的载体蛋白溶液中，将1mL去离子水加入到一个包装的EDC(10mg)中，缓慢振摇至完全溶解，取50μL加入到mcKLH多肽溶液中，反应2小时后，经脱盐柱处理除去未偶联的交联剂和盐类，得到CK19-KLH。

实施例2 AbM58058-41A2-PU杂交瘤细胞系的建立

一、免疫

将实施例1中CK19-KLH用弗氏完全佐剂(Sigma公司，F5881)乳化，免疫4-6周龄雌性Balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为60μg/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(Sigma公司，F5506)乳化，剂量为30μg/只。第3次加强免疫后7天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，免疫原用生理盐水混匀，剂量为50μg/只。

二、细胞融合：

无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(ATCCNumberCRL-8287)以5:1比例混合，离心1500rpm，5min。弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG1500(Roche公司)，并搅动细胞。在温水中静置1min后，加入10ml无血清的IMDM(Sigma公司)，混匀，离心1000rpm，5min。弃上清后，加入10ml血清(PAA公司)小心的将细胞吹打起来，并加入5ml混合10xHAT(Sigma公司)的胸腺细胞，混匀。再加入25ml含有2.1％硝基纤维素(Sigma公司)的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃5％CO₂培养箱中培养。

三、克隆化及ELISA筛选阳性杂交瘤细胞：

融合后11天，克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团(10板×93个)打入事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37℃5％CO₂培养箱中培养。

3天后，细胞量大约占底面积2/3，取100μL上清用CK19-BSA进行ELISA筛选。阳性克隆完全换液，加入200μL含饲养细胞和1％HT(Sigma公司)的完全培养基。两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基(含饲养细胞和HT)的24孔板培养。五天后取100μl上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。筛选出分泌特定单克隆抗体的杂交瘤细胞株AbM58058-41A2-PU。将此细胞株转入T-75培养瓶中扩增至对数生长期保种或进行后续实验。

实施例3腹水诱生法制备单克隆抗体

一、腹水制备

对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数～5×10⁵，1ml。悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4℃离心4000rpm，10min。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4℃或-20℃保存。

二、单克隆抗体的纯化

用HiTrap rProtein A FF(GE公司)亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于-20℃。

实施例4单克隆抗体特性鉴定

一、亚型鉴定

用100mM PBS(pH7.4)稀释包被羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)至0.5μg/ml,每孔加100μl，4℃，过夜。倾空液体，用含0.05％Tween的PBS(PBS-T)洗3次，每孔加入200μl封闭液(含2％BSA和3％蔗糖的PBS)，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入0.1ml杂交瘤上清，37℃孵育1h。倾空液体用PBS-T清洗3次。用封闭液1：1000稀释HRP标记的羊抗鼠(κ,λ)抗体或1：2000稀释HRP标记的羊抗鼠(IgM，IgG1，IgG2a，IgG2a，IgG3，IgA)抗体(Southern Biotech公司)0.1ml每孔分别加入适当的孔中，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50μL含0.15％ABTS(Southern Biotech公司)和0.03％H₂O₂的柠檬酸缓冲液(PH4.0)进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下的OD值。结果显示，本发明单克隆抗体为IgG2a型鼠源单克隆抗体。

二、亲和常数测定

包被CK19多肽，包被浓度为2μg/ml,100μL/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭2h，PBS-T洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，从1：200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：20000稀释，每孔100μL，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μl含0.1％TMB(Sigma公司)和0.03％H2O2的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50μL 0.5M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出≥1/2“平台OD值”对应的稀释倍数A。利用下列公式计算出亲和常数为7.68X10⁹。

三、单抗反应特异性和应用效果

免疫印迹的方法检测本发明单克隆抗体的识别特异性，免疫印迹实验过程如下：每种蛋白上样约5-10ng，进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上(Millipore公司)。将膜置于含5％脱脂奶粉的TBS-T封闭液中4℃过夜。加入单克隆抗体CK19(1：1000稀释)4℃孵育过夜。用TBS-T洗膜后，加入1：5000稀释的羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温孵育1小时。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液(北京普利莱基因技术有限公司)，以ChemiDoc MP多色荧光成像系统(Bio-Rad)进行化学发光图像数据的采集，结果可见图1AbM58058-41A2-PU杂交瘤分泌抗体的免疫印迹检测结果。

实施例5组织芯片染色和鉴定

一、芯片制备过程

对各样本先进行HE切片染色，以确定肿瘤部位。对肿瘤靶位点画圈，预备打孔。制作空白受体蜡块时，将塑料架置于模具上，将融化的石蜡(熔点在55～58℃)倒入模具，冷却至室温后将模具放入-20℃冰箱6min，将蜡块从模具中取出。在组织样品机上选择1mm直径的样品针在受体蜡块上打孔，孔深3～4mm，用另一直径1mm的打孔针在蜡块的标记部位打孔采集组织芯，其长度比受体蜡块的孔深浅0.1mm左右。将采集到的组织芯直接插入或用镊子小心夹取插入受体蜡块的空孔内。如此反复直至完成全部样品点的制备。最后用载玻片将所有组织芯按平，使组织芯片蜡块平坦光滑。将制成的组织芯片蜡块再放入蜡块制作模具，放入60℃烤箱内15min，使组织芯与受体腊块的蜡融为一体，然后轻轻从烤箱中取出模具，让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30min，再放入-20℃冰箱冷冻6min后将组织芯片蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为3μm，将连续切片漂在凉水中,让其自然展开，再将分开的切片转移到45℃的温水中展片30秒，用经多聚赖氨酸处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入65℃烤箱内烤片2小时，取出室温冷却，放入-4℃冰箱保存。

二、IHC染色及分析

常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100％、100％、95％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟。滴加3％H₂O₂孵育10分钟，PBS冲洗3×3分钟。甩去PBS，滴加过氧化物酶阻断剂室温孵育10分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例)室温(25℃)孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育30分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。苏木素复染20秒，PBS返蓝。按照85％(3分钟)、95％(3分钟)、95％(3分钟)、100％(3分钟)、100％(3分钟)的酒精梯度依次脱水，最后两次二甲苯透明10分钟，中性树胶封片。

免疫组化染色结果分为：阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。在组织染色分布清晰及细胞定位准确的情况下，染色结果可根据染色强度的差异进行进一步划分，具体如下：

1、样本为弱阳性；标记为“+”；

2、样本为中度阳性；标记为“++”；

3、样本为高度阳性；标记为“+++”。

4、样本为阴性，标记为“-”。

三、样本检测结果：

用本技术方案制备的抗CK19蛋白单克隆抗体和市售抗CK19蛋白单克隆抗体(鼠单抗A53-B/A2.26)在39例甲状腺乳头状癌、42例结肠癌,36例胃癌、42例肝癌上进行同步检测，结果如下表所示。

图2为甲状腺乳头状癌样本免疫组化染色结果图(左为AbM58058-41A2-PU的CK19，右为市售CK19)。其中，AbM58058-41A2-PU的CK19的染色结果为“+++”阳性，市售为阴性。

图3为结肠癌样本免疫组化染色结果图(左为AbM58058-41A2-PU的CK19，右为市售CK19)。其中，AbM58058-41A2-PU的CK19的染色结果为“++”阳性，市售为阴性。

图4为胃癌样本1免疫组化染色结果图(左为AbM58058-41A2-PU的CK19，右为市售CK19)。其中，AbM58058-41A2-PU的CK19的染色结果为“+++”阳性，市售为阴性。

图5为胃癌样本2免疫组化染色结果图(左为AbM58058-41A2-PU的CK19，右为市售CK19)。其中，AbM58058-41A2-PU的CK19的染色结果为“+++”阳性，市售为“++”阳性。

结果显示:AbM58058-41A2-PU细胞株所分泌的抗CK19蛋白单克隆抗体的染色定位准确，染色清晰且无非特异性染色，背景干净。在阳性组织的检测中，阳性率明显高于市售的CK19(A53-B/A2.26)，说明本发明所制备的抗CK19蛋白单克隆抗体的敏感度和亲和力高于市售抗体。而在阴性肿瘤组织肝癌的检测中，本抗体检测结果和市售抗体一致，说明抗体的特异性和市售抗体没有区别。

在30种正常组织芯片上进行同步检测，样本阳性和阴性结果一致，说明本抗体在正常组织的特异性同市售抗体相当。30种正常组织包括：大脑、心脏、小脑、食管、肾上腺、胃、卵巢、小肠、胰腺、结直肠、甲状旁腺、肝脏、垂体、唾液腺、睾丸、肾、甲状腺、前列腺、乳腺、子宫、脾、膀胱、扁桃体、骨骼肌、胸腺(幼儿)、皮肤、骨髓、外周神经、肺、间皮细胞。

序列表

<110> 福州迈新生物技术开发有限公司

<120> 抗CK19蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用

<130> 2020

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Lys Ala Ala Leu Glu Asp Thr Leu Ala Glu Thr Glu Ala Arg Phe Gly

1 5 10 15

Ala Gln Leu Ala His Ile Gln Ala

20

<210> 2

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Asn Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Glu Arg Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Asp Asp Asn Gly Asp Arg Ala Tyr Tyr Pro Asp Thr Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys His Tyr Ser Ser Ser Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala Ala

115

<210> 3

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ile Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Thr Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Phe Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 4

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

gaggtgaagc tgcaggagtc agggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatc cactttcaat aactatgcca tgtcttggat tcgccagact 120

ccagagagga ggcttgaatg ggtcgcatcc attgatgata atggtgatag agcctactat 180

ccagacactg tgaaggaccg attcaccatc tccagagaca atgccaggaa caccctgtac 240

cttcaattga gcagtctgag gtctgaggac acagccttct attactgtgc aaaacattac 300

agttcctcct ttgctttctg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc agcc 354

<210> 5

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

gatatcgtga tgacccaaac tccatcctcc ctggctgtgt cagtaggaga gaaggtcact 60

atgagctgca aatccagtca gattctgctc aacagtacaa cccgaaagaa ctacttgact 120

tggtaccagc agaaaacagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180

gaatctgggg ttcctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240

atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcatgcaatt ttataatctg 300

tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336