阅读说明：本技术 一种抗cdk5纳米抗体及其应用 (CDK5 resistant nano antibody and application thereof ) 是由 范瑞文 董常生 齐淑慧 于 2020-04-15 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种抗CDK5纳米抗体及其应用,属于生物工程技术领域,所述抗CDK5纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供的抗CDK5纳米抗体具有抑制黑素瘤细胞生长、迁移和抑制小鼠黑素瘤实体瘤生长的作用,可能适合用于治疗或控制黑素瘤生长的理想药物。(The invention provides an anti-CDK 5 nano antibody and application thereof, belonging to the technical field of biological engineering, wherein the amino acid sequence of the anti-CDK 5 nano antibody is shown as SEQ ID No. 1. The anti-CDK 5 nano antibody provided by the invention has the effects of inhibiting growth and migration of melanoma cells and inhibiting growth of solid tumors of mice melanoma, and is possibly suitable for ideal medicines for treating or controlling growth of melanoma.)

一种抗CDK5纳米抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种抗CDK5纳米抗体及其应用。

背景技术

黑色素瘤是由黑色素细胞癌化形成的一种最具侵袭性的发生于皮肤部位的恶性癌症，细胞周期素依赖性激酶5(cyclindependentkinase 5；简称Cdk5)，属于丝氨酸/苏氨酸激酶家属成员之一。Cdk5的作用与神经细胞的成熟和移动、中枢神经系统的正常发育有关，同时与感觉通路，例如痛觉信号机制有关。一旦Cdk5异常，将导致各种神经退行性疾病，例如阿兹罕默综合症。现有技术研究表明，CDK5在小鼠黑色素瘤(B16)细胞中异常性高表达，Cdk5可以促进黑色素瘤细胞的生长和增殖，制备Cdk5纳米抗体，一方面可以成为利用分子成像技术研究Cdk5作用机制的示踪工具，另一方面可以作为抑制黑素瘤生长的小分子药物。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗CDK5纳米抗体及其应用，本发明提供的抗CDK5纳米抗体能够抑制黑色素瘤的生长。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种抗CDK5纳米抗体，所述抗CDK5纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。

本发明还提供了上述技术方案所述的抗CDK5纳米抗体在制备抑制黑色素瘤细胞增殖的药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的抗CDK5纳米抗体在制备抑制黑色素瘤细胞迁移的药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的抗CDK5纳米抗体在制备抑制黑色素瘤细胞黑色素产生的药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的抗CDK5纳米抗体在制备抑制小鼠黑色素瘤实体瘤生长的药物中的应用。

本发明提供了一种抗CDK5纳米抗体及其应用，本发明提供的抗CDK5纳米抗体具有抑制黑素瘤细胞生长、迁移和抑制小鼠黑素瘤实体瘤生长的作用，可能适合用于治疗或控制黑素瘤生长的理想药物。

附图说明

图1表达产物纯化后的SDS-PAGE电泳；

图2用抗His标签的二抗检测纯化产物抗CDK5纳米抗体的特异性；

图3抗CDK5纳米抗体抑制B16-F10细胞的增殖；

图4抗CDK5纳米抗体抑制B16-F10细胞中黑色素的产生；

图5抗CDK5纳米抗体抑制B16-F10细胞的迁移(100ng/ml的剂量作用明显)；

图6抗CDK5纳米抗体抑制小鼠黑素瘤实体瘤的生长；

具体实施方式

本发明提供了一种抗CDK5纳米抗体，所述抗CDK5纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示，具体如下：

ESGGGLVQPGESLRLSCKVSGGSTLDYYAIGWFRQAPGKEREAVSCISGSGEVTSWAESVEGRFTISRDNSKNMVYLQMNSLKSEDTGVYYCAGRLYGSHWCDQDFGLWGQGTQVTVSS。

在本发明中，所述抗CDK5纳米抗体优选从中国专利CN201910057953.4中公开的黑素瘤纳米抗体库中，采用常规筛选方法筛选得到。

本发明还提供了上述技术方案所述的抗CDK5纳米抗体在制备抑制黑色素瘤细胞增殖的药物中的应用。在本发明中，所述药物以抗CDK5纳米抗体为唯一活性物质。本发明对所述药物的剂型没有特殊限定，采用抗CDK5纳米抗体在医学上可接收的药物的剂型即可。本发明对所述药物中抗CDK5纳米抗体的含量没有特殊限定，采用常规剂型中活性物质的含量即可。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限定，采用对应的剂型的常规制备方法制备即可。

本发明还提供了上述技术方案所述的抗CDK5纳米抗体在制备抑制黑色素瘤细胞迁移的药物中的应用。在本发明中，所述药物以抗CDK5纳米抗体为唯一活性物质。本发明对所述药物的剂型没有特殊限定，采用抗CDK5纳米抗体在医学上可接收的药物的剂型即可。本发明对所述药物中抗CDK5纳米抗体的含量没有特殊限定，采用常规剂型中活性物质的含量即可。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限定，采用对应的剂型的常规制备方法制备即可。

本发明还提供了上述技术方案所述的抗CDK5纳米抗体在制备抑制黑色素瘤细胞黑色素产生的药物中的应用。在本发明中，所述药物以抗CDK5纳米抗体为唯一活性物质。本发明对所述药物的剂型没有特殊限定，采用抗CDK5纳米抗体在医学上可接收的药物的剂型即可。本发明对所述药物中抗CDK5纳米抗体的含量没有特殊限定，采用常规剂型中活性物质的含量即可。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限定，采用对应的剂型的常规制备方法制备即可。

本发明还提供了上述技术方案所述的抗CDK5纳米抗体在制备抑制小鼠黑色素瘤实体瘤生长的药物中的应用。在本发明中，所述药物以抗CDK5纳米抗体为唯一活性物质。本发明对所述药物的剂型没有特殊限定，采用抗CDK5纳米抗体在医学上可接收的药物的剂型即可。本发明对所述药物中抗CDK5纳米抗体的含量没有特殊限定，采用常规剂型中活性物质的含量即可。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限定，采用对应的剂型的常规制备方法制备即可。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例中用到的主要试剂如下：

TG1菌株、KM13辅助噬菌体、pCANTAN5e载体、脱脂奶粉、SfiI、DreamTaqGreenPCRMix、HisTrap HP 5ml、1640培养基、DMEM培养基、Lipofectamine 2000转染试剂、进口胎牛血清、荧光素酶底物、细胞裂解液、BSA、ELISA包被液、ELISA终止液、TMB单组分显色液、pMD19-T Simple Vector、PCR Master Mix、HRP-His鼠/兔单克隆抗体、质粒小量提取试剂盒、反转录试剂盒、DH5α感受态细胞、DNA提取试剂盒、DNA产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒、无内毒素质粒提取试剂盒。

实施例1

表达载体构建：

根据中国专利CN201910057953.4中公开的黑素瘤纳米抗体库中筛到的阳性克隆序列设计引物，并在引物5’端和3’端分别添加BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点。将阳性表达菌的甘油菌接种于5ml 2×YTAG培养基培养，并利用质粒小量提取试剂盒提取质粒作为原核表达的模板质粒。利用设计好的引物用PCR法扩增阳性克隆的VHH序列，并且通过上述酶切位点将其连接入pColdⅠ原核表达载体，构建纳米抗体原核表达重组质粒(产物名称为pColdⅠ-CDK5-VHH)以进行纳米抗体的CDK5特异性鉴定。

引物如下(5’-3’)：

SEQ ID No.2：F：gtgaggatccgagtctggaggrrgcttggtgca(下划线为BamHⅠ)；

SEQ ID No.3：R：tctgagtcgactgaggagacgrtgacstsggtc(下划线为HindⅢ)。

大肠杆菌表达抗CDK5纳米抗体：

原核诱导表达：将构建好的pColdⅠ-CDK5-VHH质粒通过热激法(42℃，40S)转化进入DH5α大肠杆菌中，进行克隆，并利用质粒小量提取试剂盒提取质粒，将提取到的质粒继续通过热激法转化进入BL21(DE3)大肠杆菌中，并涂板，第二天挑取单克隆于LB培养基中37℃200rpm过夜振荡培养，次日，将菌液以1:100的比例转接入新的LB培养基中，37℃摇至OD值为0.4，加入终浓度为0.6mM的IPTG，15℃80rpm进行过夜诱导。以不加IPTG诱导的同一单克隆菌液为阴性对照，以BL21(DE3)空菌为空白对照。SDS-PAGE和WB检测大肠杆菌(DH5α)表达抗CDK5纳米抗体产物，结果见图1。

通过SDS-PAGE电泳，可以发现DH5α表达产物经纯化后，可在总蛋白中发现分子量约为15KD的蛋白质，在纳米抗体的分子量范围内。

表达产物纯化和鉴定：

表达产物的纯化：将超声离心后得到的上清通过AKTApure蛋白纯化仪进入镍柱并与之结合，随后通过200mM浓度的咪唑进行洗脱，得到抗CDK5抗体单一条带的目的蛋白，将纯化后的蛋白通过透析袋进行透析，除去多余的盐分，即可得到抗CDK5纳米抗体(SEQ IDNo.1)的纯蛋白。

纯化后的鉴定：将透析后的蛋白进行SDS-PAGE和Western Blotting方法，进行检测。结果见图2。

由于pColdI载体上带有His标签，因此用含用抗His标签的二抗检测纯化产物的特异性，结果发现纯化产物中具有与抗His二抗特异结合的免疫阳性物，即为抗CDK5纳米抗体。

实施例2

实施例1制备的纯化的抗CDK5纳米抗体抑制黑素瘤细胞B16-F10细胞的生长

细胞添加试验：取冻存于液氮罐中的黑色素瘤B16细胞进行复苏，并于37℃，5％CO₂细胞培养箱中进行培养传代，当细胞生长至密度为90％时进行细胞添加，抗CDK5纳米抗体的添加浓度为100ng/ml，使用不含FBS的DMEM培养基进行培养，对照组试验为加入同等体积PBS于不含FBS的培养基。在12h后终止，将含有抗CDK5纳米抗体的培养基抽出，重新加入不含FBS的培养基。

CCK8增殖试验：在终止细胞添加后使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖，具体实验步骤如下：

(1)用0.25％胰蛋白酶消化液消化细胞，终止消化后离心并用培养基重悬细胞，对细胞进行计数；

(2)将细胞悬液加入96孔酶标板，每孔加入含2000个/ml细胞的细胞悬液100μl，每个组设3个重复，将96孔酶标板放入CO₂细胞培养箱孵育24小时；

(3)向96孔酶标板中两组中每孔加入10ul CCK-8工作液，CO2细胞培养箱孵育4个小时

(4)使用酶标仪在450nm波长检测各组的吸光值；

(5)根据细胞数计算每孔细胞细胞的增殖情况。

结果见图3。

从图3中可以得出，将抗CDK5纳米抗体添加到B16-F10细胞中后，通过CCK8检测发现，该抗体可以有效抑制B16-F10细胞的增殖。

实施例3

纯化的抗CDK5纳米抗体抑制黑素瘤细胞中黑色素的合成

如同实施案例2实施细胞添加实验后，进行如下实验：

总黑素含量的测定：在细胞终止添加后48h，弃去旧的培养基，分别用PBS清洗细胞3次，用0.25％的胰蛋白酶进行消化，终止消化后，分别抽取10μl进行细胞计数，剩余细胞于4℃，1000rpm离心10min；弃上清，配制0.2mol/L的NaOH溶液，于每管内加入400μl重悬，置于80℃加热裂解10min；将细胞裂解液每组分为三孔，以每孔100μl的量加入96孔酶标板内，在475nm的波长下测定其吸光值，并根据细胞数计算每组细胞的总黑色素含量。

真黑素含量的测定：在细胞终止添加后48h，弃去旧的培养基，分别用PBS清洗细胞3次，用0.25％的胰蛋白酶进行消化，终止消化后，分别抽取10μl进行细胞计数，剩余细胞于4℃，1000rpm离心10min；弃上清，每组加入750μl的30％HI，于金属浴中80℃反应2h，冷却至室温后，加入等量的50％乙醇，混匀后2234xg离心10min；弃上清，每组加入500μl的0.2mol/L的NaOH，于金属浴中80℃反应4h，10700xg离心10min；取上清，每组做3孔重复，以每孔100μl加入96孔酶标板中，于350nm的波长下测定其吸光值，并根据细胞数计算每组细胞的真黑素含量。

褐黑素含量的测定：在细胞终止添加后48h，弃去旧的培养基，分别用PBS清洗细胞3次，用0.25％的胰蛋白酶进行消化，终止消化后，分别抽取10μl进行细胞计数，剩余细胞于4℃，1000rpm离心10min；弃上清，每孔加入500μl的pH＝10.5的PBS(0.1mol/L)，剧烈混匀，10000rpm离心10min；取上清，加入350μl氯仿，混匀后4000rpm离心10min；取上清，以每孔100μl加入96酶标板内，每组做3个重复，于400nm的波长下测定其吸光值，并根据细胞数计算每组细胞的褐黑素含量。

结果见图4。

从图4中可以得出，将抗CDK5纳米抗体添加到B16-F10细胞中后，通过紫外分光光度法检测发现，该抗体可以有效抑制B16-F10细胞中的总黑色素和真黑素的含量，但对褐黑素含量的影响不明显。

实施例4

纯化的抗CDK5纳米抗体抑制黑素瘤细胞的迁移

如同实施案例2实施细胞添加实验后，进行如下实验：在细胞终止添加后用高压灭菌后的小枪头在细胞表面进行划痕，并用PBS清洗3次，加入不含FBS的培养基在显微镜下对划痕进行拍照，记为0h。在12h后弃去旧的培养基并用PBS清洗3次后加入不含FBS的培养基在显微镜下对划痕变化进行拍照，记为12h。结果见图5。

从图5中可以看出，将抗CDK5纳米抗体添加到B16-F10细胞中后，通过划痕实验发现，该抗体可以在12h出现对B16-F10细胞迁移产生有效的抑制作用，尤其是100ng/ml的剂量作用明显。

实施例5

纯化的抗CDK5纳米抗体抑制黑素瘤小鼠模型中黑素瘤的生长

B16细胞准备：取冻于液氮罐的B16细胞，复苏后铺于25t柯氏瓶中进行培养并进行传代，当细胞长到密度为90％左右时抽去培养基，并用PBS清洗3次，用PBS将B16吹打下来，并且进行细胞计数，使细胞密度为1x10⁶个/ml，即可进行注射。

构建黑色素瘤小鼠模型：取20只健康的6-8周龄的昆明鼠，作为实验组，在小鼠腋下进行皮下注射200μl/只，浓度为1x10⁶个/ml的B16细胞，注射后1-2周后，小鼠腋下出现直径为1cm的黑色素瘤即造瘤成功。另取20只健康的6-8周龄的昆明鼠，在小鼠腋下进行皮下注射PBS，200μl/只作为对照组。

纯化后的抗CDK5抗体对黑色素瘤生长的作用：黑色素瘤小鼠造瘤成功后，在实验组和对照组中各取10只小鼠将纯化后的抗CDK5纳米抗体进行小鼠尾静脉注射，按100μg/g/天进行给药，给药后观察小鼠的体重，黑色素瘤的大小和小鼠的精神状态。同样在实验组和对照组中各取10只小鼠注射同等体积的PBS缓冲液作为对照组。同样在给药后观察小鼠的体重，黑色素瘤的大小和小鼠的精神状态。结果见图6。

从图6中可以看出，将抗CDK5纳米抗体每隔三天注射一次，连续注射7次到黑素瘤实体后，与对照组相比，出现明显的抑制生长作用。

由以上实施例可以得出，本发明提供的抗CDK5纳米抗体具有抑制黑素瘤细胞生长、迁移和抑制小鼠黑素瘤实体瘤生长的作用，可能适合用于治疗或控制黑素瘤生长的理想药物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 山西农业大学

<120> 一种抗CDK5纳米抗体及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser

1 5 10 15

Cys Lys Val Ser Gly Gly Ser Thr Leu Asp Tyr Tyr Ala Ile Gly Trp

20 25 30

Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val Ser Cys Ile Ser

35 40 45

Gly Ser Gly Glu Val Thr Ser Trp Ala Glu Ser Val Glu Gly Arg Phe

50 55 60

Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln Met Asn

65 70 75 80

Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gly Arg Leu

85 90 95

Tyr Gly Ser His Trp Cys Asp Gln Asp Phe Gly Leu Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgaggatcc gagtctggag grrgcttggt gca 33

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tctgagtcga ctgaggagac grtgacstsg gtc 33