具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

一、构建电化学发光生物传感电极，并用于COX III基因的检测，结合图1所示。

1、材料与方法

1.1材料

Lba Cas12a(Cpf1)和10×NEBuffer 2.1(0.5M NaCl,0.1M Tris-HCl,0.1MMgCl2,1mg/mL BSA,pH 7.9)购于New England Biolabs(伊普斯维奇，美国)，HPLC纯化的CRISPR RNA(crRNA)、RNase抑制剂、RNase-free水和DNA Marker购自Takara Biotech(大连，中国)。GoldView I购自Solarbio Tech(北京，中国)。6-巯基-1-己醇(MCH)、三(2-羧基)-磷酸盐酸盐(TCEP)和聚乙二醇山梨糖单月金酸酯(Tween-20)购自Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，美国)。所有HPLC纯化的DNA寡核苷酸均由生工生物技术有限公司(中国上海)合成。所有寡核苷酸序列列于表1。二十八烷基二甲基氯化铵(DODAC,96％)购自Alfa Aesar(希舍姆，英国)。次亚磷酸(NaH₂PO₂·H₂O,98％)，盐酸多巴胺(99.9％)，氯化钯(II)(PdCl2,99.9％)和无水氯化铜(CuCl₂,99％)从Adamas-beta(上海，中国)购买。硼烷二甲胺(DMAB,97％)配合物购自Acros Organics(赫尔，比利时)。氟化铵(NH₄F,98％)和硼酸(H₃BO₃,99.5％)均购自Greagent(中国上海)。无水乙醇、盐酸(HCl)和氨水(NH₃·H₂O)购自川东化工有限公司(重庆，中国)。磷酸盐缓冲液(PBS,0.01M)(NaCl-Na₂HPO₄-KH₂PO₄-KCl)作为ECL工作缓冲液，pH为7.4。所有试剂都是分析级的，没有任何进一步的净化过程，并且在整个工作中使用Milliq超纯水(≥18MΩcm^-1,Millipore)。

表1.本工作中使用的核酸序列

1.2检测仪器

ECL和电化学测量使用MPI-E多功能分析仪(西安，中国)和CHI 660E电化学工作站(上海，中国)进行。三电极系统由金电极(直径3毫米，GE，工作电极)、铂丝(对电极)和Ag/AgCl电极(浸没在饱和KCl溶液中，参比电极)组成。透射电子显微镜(TEM)和高分辨率透射电子显微镜(HRTEM)使用JEM-2100F在200kV下工作。元素映射分析图在Oxford X-MAX能量色散谱仪上采集。采用Micromeritics TriStar II 3020仪器对粉末样品进行Brunauer-Emmett-Teller(BET)分析。在ESCALAB 250Xi光谱仪上采集X射线光电子能谱(XPS)图。

1.3PdCuBP介孔纳米酶的合成

称取180mg DODAC，在超声溶解于60mL超纯水中。然后依次加入NH4F溶液(6ml,0.337M)、H₃BO₃溶液(6ml,0.101M)、H₂PdCl₄溶液(3.84mL,10mM)和CuCl₂溶液(0.96mL,10mM)。随后，在35℃温和搅拌加热6分钟，迅速加入NH₃·H₂O(2.4mL,10wt.％)，进一步搅拌至无色。将NaH₂PO₂·H₂O(6mL,0.034M)滴入上述溶液中，逐渐加热至35℃至95℃，用油浴在95℃恒温20min。最后，将新制备的DMAB(6ml,0.1M)注入溶液中，充分搅拌，在95℃下保持30分钟。在DMAB还原后，颜色由白色变为深褐色，表明合成了PdCuBP介孔纳米酶。离心后，用乙醇水洗涤3次，悬浮在6ml去离子水中。

[email protected]纳米球的合成

首先将2mL合成的PdCuBP介孔纳米酶溶液与2mL luminol分散液(溶质为水，5mM)混合。然后在室温避光搅拌12h。离心去除未负载的luminol后，收集[email protected]纳米球并均匀分散在1ml超纯水中。

1.5hpDNA-DA探针的制备

首先将500μL的hpDNA(1μM)溶于48mg EDC和7mg NHS中，4℃静置1h活化hpDNA的羧基。在上述混合物中滴入DA溶液(500μL,2μM)，在4℃下轻轻搅拌12h即可得到hpDNA-DA。

1.6电化学发光生物传感电极的构建

采用氧化铝微粉和抛光垫抛光裸金电极(裸GE)。在超纯水超声浴冲洗后，用食人鱼溶液(H₂SO₄/H₂O₂＝3:1)蚀刻10分钟，然后用去离子水清洗，并在氮气下干燥进行改性。然后将[email protected]纳米微球悬浮液滴在清洁的金电极表面，在37℃干燥成膜。然后，将10μL hpDNA-DA滴在处理后的金电极表面，4℃孵育8h，然后滴涂MCH(10μL,0.5mM)阻断金电极表面的非特异性位点。最后，将构建的电化学发光生物传感电极用洗涤液(0.01M PBS，含0.05％(w/v)Tween-20,pH 7.4)冲洗，4℃保存备用。

1.7电化学发光检测步骤

在测量之前，使用50nM crRNA,50nM Cas12a在包含1U RNase抑制剂，1×NEBuffer2.1的缓冲液中制备Cas12a/crRNA复合体。随后，4μL靶标DNA添加到6μL反应缓冲中，孵育37℃ 10分钟。然后，取10μL上述溶液滴在制备的电极表面，在37℃孵育1h。轻轻冲洗修饰电极表面，在-0.2～0.6V电位扫描，扫描速率在0.1～0.15V/s范围，优选0.15V/s，脉冲宽度在50～100ms范围内，优选50ms，光电倍增管为800V，在PBS(0.01M,pH 7.4)中进行电化学发光检测。

二、表征PdCuBP介孔纳米酶和[email protected]介孔纳米球

为了对PdCuBP介孔纳米酶进行表征，使用了如TEM、HRTEM和BET等技术。如图2A和B所示，制备的PdCuBP介孔纳米酶是直径约100nm的高单分散性纳米微球。如图1C所示，PdCuBP介孔纳米酶是一种类似于树枝分散球形结构(图2C)。如图3所示，氮吸附-洗脱等温线展示PdCuBP介孔纳米酶为多孔结构，通过计算得出，其表面面积约为41.17m²/g和平均孔径为5.02nm。

为了进一步探索[email protected]纳米球的纳米结构和元素，我们进行了高角度环形暗场(HAADF)-STEM和STEM-EDS元素映射分析。从图2D可以看出，PdCuBP介孔纳米酶在加载鲁米诺后，仍然保持了本体的介孔纳米团簇结构。图2(E-J)中，介孔纳米酶中的Pd、Cu、B和P元素均匀分布在纳米团簇中，鲁米诺的N均匀分布在纳米颗粒上。这些结果表明，鲁米诺成功地负载到PdCuBP介孔纳米酶形成[email protected]介孔纳米球。

通过XPS进一步研究[email protected]介孔纳米球的表面电子态和化学键构型。[email protected]介孔纳米球中N1s、Pd 3d、Cu 2p、B 1s和P 2p的XPS谱图如图4所示。如图4A所示，N 1s主峰出现在399.3eV处，可能是luminol的-NH₂，402eV处的N1s峰可能是由N-氧化物引起的。此外，如图4B所示，PdCuBP介孔纳米酶中存在Pd 3d(Pd⁰和Pd²⁺)。Pd的化合价变化表明PdCuBP与luminol之间存在Pd-N键相互作用。

三、[email protected]介孔纳米球的电化学发光性能

为了评价[email protected]介孔纳米球在中性无H₂O₂工作溶液中的电化学发光性能，进行了不同修饰电极的对比实验。如图5A所示，PdCuBP介孔纳米酶修饰电极后，没有观察到电化学发光信号(曲线a)。此外，luminol修饰电极发射很低的电化学发光信号(曲线b)。而[email protected]修饰电极后，获得了极高的电化学发光信号(曲线c)，这表明PdCuBP介孔纳米酶具有高的可接触比表面积，可以吸附大量的luminol，并展现了良好的生物催化活性，在无H₂O₂的工作溶液中触发luminol发射电化学发光信号。此外，如图5B所示，[email protected]介孔纳米球在碱性和中性工作溶液中的电化学发光信号没有显著差异(曲线a和b)。这些结果表明[email protected]介孔纳米球可以在中性无H₂O₂工作体系中实现高强度电化学发光信号输出。

四、[email protected]介孔纳米球的电化学发光机制

为了深入了解[email protected]介孔纳米球潜在的电化学发光机制，我们在不同的溶液中检测了ECL信号，所有实验都在pH 7.4的PBS中进行。如图6A所示，[email protected]纳米球在N₂饱和的PBS中几乎没有电化学发光信号(曲线a)。相应的，[email protected]纳米球修饰电极在空气饱和的PBS中展现了明显的电化学发光信号(曲线b)。结果表明，PdCuBP介孔纳米酶能明显提高luminol在溶解O₂中的发光效率。

众所周知，溶解的O₂可以作为内源性的核反应物生成ROSs(如O₂ ^·-和OH^·)，并与氧化luminol的活性中间体反应。因此，为了进一步探索PdCuBP介孔纳米酶与溶解O₂相互作用致发光鲁米诺ECL的机制，我们设计并进行了以下实验。如图6所示B，在添加二甲亚砜(DMSO)清除罗斯OH^·后，我们观察到的一个微小的信号变化(曲线a)。另外，在添加对苯醌以清除O2^·-后，我们观察到电化学发光信号明显减少到1266a.u(曲线b)。上述结果表明，PdCuBP介孔纳米酶促进溶解氧气产生O₂ ^·-，而不是OH^·，导致luminol的电化学发光。[email protected]/O₂系统可能的ECL机制可以描述如下：

luminol-2e^--2H⁺→luminol^·- (2)

luminol^·-+O₂ ^·-→3-AP^2-*+N₂ (3)

luminol^·-+O₂→O₂ ^·-+luminol (4)

3-AP^2-*→3-AP^2-+hv (5)

五、该生物传感器的可行性分析

为了确认Cas12a的反式裂解活性，将反应产物进行PAGE电泳分析，如图7A所示。标记Cas12a/crRNA/target复合体各组分和单链DNA(ssDNA)的电泳位置(Lane 1-4)。Lane 5-7显示，由于Cas12a/crRNA/target复合体结构的不完善，Cas12a的核酸酶能力无法被激活。Lane 8提示Cas12a/crRNA复合体能够特异性识别和降解靶DNA。正如预期的那样，Cas12a、crRNA和target DNA可以形成一个三重复合体(Cas12a/crRNA/target复合体)来降解ssDNA(Lane 9)，这表明通过整合Cas12a/crRNA/target复合体可以充分激活Cas12a的核酸酶活性。

为了验证基于Cas12a的电化学发光平台用于COX III DNA检测的可行性，我们还进行了电化学发光测量，以进一步研究修饰电极(hpDNA-DA/[email protected]纳米球/GE)上的核酸切割性能。同样，如图7B所示，Cas12a/crRNA/target复合体的三重结构不完整，不能激活Cas12a核酸酶活性，从而提高hpDNA-DA淬灭[email protected]的电化学信号(曲线a-d)。只有含有Cas12a、crRNA和target(50nM)的混合物才能组装成Cas12a/crRNA/target的三重结构，导致hpDNA-DA的切割和[email protected]发射的ECL信号恢复(曲线e)。PAGE和ECL检测结果均表明，基于Cas12a的ECL生物传感器可用于核酸检测。

六、电化学生物传感器的表征

采用电化学阻抗谱和循环伏安法对ECL生物传感器的制备过程进行了表征，制备过程在含0.1M KCl的5mM Fe(CN)₆ ^3-/4-中进行。在电阻抗谱中，半圆直径等于电子转移电阻(Ret)。如图8A所示，裸GE的阻抗值较小(曲线a)。之后，随着在GE上修饰[email protected]纳米球，阻抗值略有降低(曲线b)，说明[email protected]具有一定的导电性。随后，当hpDNA-DA被修饰后，阻抗显著增加(曲线c)，这归因于hpDNA和DA阻碍了电极与电解质溶液之间的电子转移。如预期的那样，在Cas12a切割hpDNA-DA后，可以得到明显降低的阻抗强度(曲线d)。电化学阻抗谱结果表明，所设计的ECL生物传感器制备成功。

为了进一步验证电化学发光生物传感器的成功组装，记录了每个制备过程的电化学发光值。如图8B所示，由于没有发光体，裸GE没有观测到电化学发光信号(曲线a)。随后，由于[email protected]纳米球的优异的电化学发光性能，获得了极高的信号(曲线b)。当用hpDNA-DA固定电极时，电化学发光信号显著下降(曲线c)，证明了hpDNA中的DA可以极大地猝灭鲁米诺的电化学发光发射。与Cas12a/crRNA/target复合体孵育后，可以恢复[email protected]纳米球的电化学发光发射信号(曲线d)，因为hpDNA被裂解以释放DA猝灭剂。这些结果进一步表明，所制造的生物传感器的逐步制备如预期的成功实施。

七、优化生物传感器的制备和反应条件

为了获得最佳的分析性能，系统地优化了几种实验条件。初步研究了能提高电化学发光效率并降低研制成本的[email protected]纳米球的稀释倍数。如图9A所示，在[email protected]纳米球稀释倍数为5倍时，电化学发光生物传感器表现出最高的电化学发光强度。因此，我们选择五倍稀释[email protected]纳米球作为修饰电极的最佳稀释倍数。接着，hpDNA-DA的浓度，作为熄灭[email protected]纳米球的电化学发光效率的一个因素，也被优化。如图9B所示，3μM hpDNA-DA在修饰电极上孵育后，电化学发光信号接近最低。因此，我们在接下来的实验中选择了3μM的中位浓度作为最优浓度。此外，由于特异性识别和反式切割能力，工作缓冲液中Cas12a/crRNA复合体的浓度是构建生物传感器的基础条件。随后，我们对一系列20-60nM的Cas12a/crRNA复合体进行了优化。如图9C所示，随着Cas12a/crRNA复合体浓度从20nM到50nM的变化，生物传感器的电化学发光信号增加，然后随着Cas12a/crRNA复合体浓度的进一步增加，电化学发光信号保持不变。一般情况下，Cas12a/crRNA/target复合体在修饰电极上的孵育时间会影响检测系统的性能。图9D显示了不同孵育时间下的ECL值，Cas12a/crRNA/target复合体的最佳切割时间为60min。

八、电化学发光生物传感器的分析性能

在优化的条件下，利用所开发的电化学发光生物传感器对不同浓度的COX III基因进行定量检测。图9A显示浓度范围从1pM(曲线a)—200nM(曲线i)电化学发光的信号COXIII基因的定量检测DNA。图10B显示了良好的线性关系的回归方程为：I＝2556lg C_COXIII+33490(R²＝0.9904)。计算出的检测限(LOD)为0.44pM(S/N＝3)。这主要是由于[email protected]纳米球的高ECL发射效率和激活的CRISPR/Cas12a对hpDNA-DA的高效切割活性。

为了证明所提出的电化学发光生物传感器的特异性，我们对几种干扰物质进行了交叉反应实验，包括COX I、COX II、COX III和含有COX III的混合物。与空白相比，当非特异性干扰物质存在时，电化学发光值的变化可以忽略不计(图9C)。同时，与各干扰物质相比，在靶物质存在的情况下获得了明显的电化学发光响应。结果表明，由于Cas12a/crRNA复合体具有典型的良好的识别能力，所开发的生物传感器具有极好的特异性。

电化学发光生物传感器的稳定性是需要考虑的关键参数。以相对标准偏差(RSD)评价方法的稳定性。在最佳条件下，对该生物传感器进行连续扫描10次。从图9D可以看出，在连续扫描下，电化学发光强度相对稳定，RSD为2.27％，说明该生物传感器的稳定性是令人满意的。

图10(A)设计的生物传感器在不同靶浓度下的电化学发光值(a-i:1pM,5pM,50pM,100pM,1nM,10nM,50nM,100nM,200nM)。(B)电化学发光值与COX III浓度对数的线性图。(C)设计的生物传感器的电化学发光响应:空白(无目标DNA)、5nM COX I、5nM COX II、1nM COXIII和混合(1nM COX III+5nM每个干扰物质)。误差棒：SD,n＝3。(D)在100pM COX III存在下连续循环电位扫描10个周期生物传感器的电化学发光响应。

九、电化学发光生物传感器的回收试验

为了评估构建的电化学发光生物传感器的潜在临床应用价值，我们对人尿液样本中添加的目标DNA(5pm、500pm和1000pm)进行了定量分析，并进行了回收试验。如表2所示，加样回收率为97.81％～103.73％，RSD<5％(n＝3)。结果表明，所提出的生物传感器在临床分析中的可靠和潜在的应用。

表2所研制的电化学发光生物传感器测定正常尿液中COXⅢ的含量

^*回收率(％)表示为计算/加标COXⅢ的比值。

序列表

<110> 遵义医科大学附属医院

<120> 一种电化学发光生物传感电极及其构建和用于检测基因的方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aauuucuacu aaguguagau acuuccacuc cauaacgcuc 40

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctagccatgt gatttcactt ccactccata acgctcctca tactaggc 48

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcctagtatg aggagcgtta tggagtggaa gtgaaatcac atggctag 48

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acagcccatg catttgtaat aatcttcttc atagtaatac ccatcata 48

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tatgatgggt attactatga agaagattat tacaaatgca tgggctgt 48

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccctacgcat cctttacata acagacgagg tcaacgatcc ctccctta 48

<210> 7

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

taagggaggg atcgttgacc tcgtctgtta tgtaaaggat gcgtaggg 48

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttttttttta ccattttttt aacttatttg gttcagcgtt ccttt 45

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agtcagtgtg gaaaatctct agcagtcagt gt 32