阅读说明：本技术 一种阿基瑞林的纯化方法 (Purification method of achirelin ) 是由 徐红岩 秦敬国 李阳 王国军 于 2020-03-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及到一种阿基瑞林的纯化方法。该方法可以有效解决多肽上样量小、成本高、效率低等问题,技术方案如下：一种阿基瑞林的纯化方法,包括如下步骤：1)将多肽产品进行预处理,溶解过滤后为待纯化样品；2)将上述样品进行第一次纯化,所述第一次纯化方法为中压色谱法,其中以多糖凝胶、聚合物微球或者硅胶中的一种为固定相,粒径为10-40μm,在流动相A和流动相B中,梯度洗脱收集目标馏分纯度90%以上备用；3)上述目标馏分进行第二次纯化,所述第二次纯化方法为反相高效液相色谱法,其中以C18或者C8键合硅胶为固定相,粒径为7-10μm,在流动相A和流动相B中,梯度洗脱收集合格的馏分；4)用旋转蒸发仪在32-38℃下旋蒸,冻干后得到合格得产品粉末。(The invention relates to a purification method of archipellin. The method can effectively solve the problems of small loading amount of polypeptide, high cost, low efficiency and the like, and the technical scheme is as follows: a purification method of the achirelin comprises the following steps: 1) pretreating a polypeptide product, dissolving and filtering to obtain a sample to be purified; 2) performing primary purification on the sample, wherein the primary purification method is medium-pressure chromatography, one of polysaccharide gel, polymer microspheres or silica gel is used as a stationary phase, the particle size is 10-40 mu m, and in a mobile phase A and a mobile phase B, gradient elution is performed to collect target fractions with purity of more than 90% for later use; 3) performing secondary purification on the target fraction, wherein the secondary purification method is reverse-phase high performance liquid chromatography, wherein C18 or C8 bonded silica gel is used as a stationary phase, the particle size is 7-10 mu m, and qualified fractions are collected in a mobile phase A and a mobile phase B by gradient elution; 4) rotary evaporating at 32-38 deg.C with rotary evaporator, and lyophilizing to obtain qualified product powder.)

一种阿基瑞林的纯化方法

技术领域

本发明涉及多肽纯化方法，特别涉及到一种阿基瑞林的纯化方法。

背景技术

阿基瑞林(Argireline)，又被称为类肉毒杆菌素，是模仿SNAP-25蛋白N端6个氨基酸的寡肽一。多肽序列为Ac-Glu-Glu-Met-Glu-Arg-Arg-NH2，分子式C46H56N12O6,分子量为888.99，结构式如下:

阿基瑞林为高端化妆品常用的原料之一，功效主要是减少由面部表情肌收缩造成的皱纹，对额头或眼睛周围的皱纹有理想的祛除效果。另外，它还能促进胶原蛋白的生成，有助于肌肤组织重建。

阿基瑞林是一种更安全、更廉价、温和的肉毒杆菌毒素替代品。阿基瑞林参与竞争SNAP-25在融泡复合体的位点，从而影响融泡复合体的形成，导致囊泡不能有效释放神经递质，使肌肉收缩减弱，进而可以放松肌肉、舒缓细纹使肌肤呈现清透无暇，也可以促使细胞再生使肌肤恢复柔软弹性，因此被广泛应用于制备化妆品和保健品。

近几年随着人们保健意识的增强，化妆品和保健品市场越来越广阔，阿基瑞林的市场需求也越来越大。

中国专利201310755456.公开了“一种阿基瑞林的制备方法”，该方法通过固相合成法制备阿基瑞林，制备步骤较为繁琐，纯化存在多肽上样量小、成本高等技术问题。

发明内容

本发明的目的是提供到一种阿基瑞林的纯化方法，该方法可以有效解决多肽上样量小、成本高、效率低等技术问题，同时还可以保证收率和产品质量。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种阿基瑞林的纯化方法，包括如下步骤：

1）将多肽阿基瑞林产品进行预处理，溶解过滤后为待纯化样品；

2) 将上述样品进行第一次纯化，所述第一次纯化方法为中压色谱法，其中以多糖凝胶、聚合物微球或者硅胶中的一种为固定相，粒径为10-40μm，在流动相A和流动相B中，梯度洗脱收集目标馏分纯度90%以上备用；

3）上述目标馏分进行第二次纯化，所述第二次纯化方法为反相高效液相色谱法，其中以C18或者C8键合硅胶为固定相，粒径为7-10μm，在流动相A和流动相B中，梯度洗脱收集合格的馏分；

4）用旋转蒸发仪在32-38℃下旋蒸，冻干后得到合格得产品粉末。

所述步骤1）样品的预处理方法为将阿基瑞林样品溶解于甲醇水溶液，过滤后待纯化。

优选的方案是：所述步骤2）中粒径为15-25μm。

优选的方案是：所述步骤2）流动相A为三氟乙酸、甲酸铵、甲酸吡啶或乙酸铵中的一种。

优选的方案是：所述步骤2）流动相B为甲醇、乙腈、乙醇或二氯甲烷中的一种。

优选的方案是：流动相A为体积百分比0.1%乙酸铵水溶液；所述步骤3）流动相B为甲醇、乙腈或乙醇中的一种。

本发明的有益效果是：本发明涉及到一种阿基瑞林的纯化方法，采用中压色谱法和反相高效液相色谱法相结合，可以增加上样量、节省成本、提高效率。中压色谱填料价格低、上样量大，用于第一次纯化既可以满足分离需求，又可以提高效率。粗纯之后第二次纯化用反相高效液相色谱可以在原有基础上增加上样量，提高工作效率，收率由75%提高至80%以上。

附图说明

图1为实例1一次纯化馏分高效液相色谱检测图。

图2为实例1二次纯化馏分高效液相色谱检测图。

图3为实例2一次纯化馏分高效液相色谱检测图。

图4为实例2二次纯化馏分高效液相色谱检测图。

图5为实例3一次纯化馏分高效液相色谱检测图。

图6为实例3二次纯化馏分高效液相色谱检测图。

图7为冻干后产品质谱图。

具体实施方式

实施例1

1）称量50g多肽产品溶于甲醇水溶液中，超声溶解过滤后得到阿基瑞林待纯化样品；

2) 样品进行第一次纯化，采用中压色谱。其中以聚合物微球为固定相，粒径为20μm；流动相A为体积百分比0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B为100%甲醇；洗脱梯度为0-80min，流动相B：5-30%，收集馏分检测90%纯度以上备用；高效液相色谱见图1；

3）上述方法多次收集目标馏分进行第二次纯化，采用反相高效液相色谱法。其中以C18键合硅胶为固定相，粒径为8μm；流动相A为体积百分比0.1%乙酸铵水溶液，流动相B为100%乙腈；洗脱梯度为0-80min，流动相B：5-25%，收集馏分检测合格合并待处理；高效液相色谱见图2；

4）收集馏分用旋转蒸发仪在32-38℃下旋蒸，冻干后得到合格得产品粉末，收率为85%。产品质谱见图7。

实施例2

1）称量50g多肽产品溶于甲醇水溶液中，超声溶解过滤后得到阿基瑞林待纯化样品；

2) 样品进行第一次纯化，采用中压色谱。其中以硅胶为固定相，粒径为15μm；流动相A为体积百分比0.1%甲酸铵水溶液，流动相B为100%乙腈；洗脱梯度为0-80min，流动相B：5-30%，收集馏分检测90%纯度以上备用；高效液相色谱见图3；

3）上述方法多次收集目标馏分进行第二次纯化，采用反相高效液相色谱法。其中以C18键合硅胶为固定相，粒径为10μm；流动相A为体积百分比0.1%乙酸铵水溶液，流动相B为100%乙醇；洗脱梯度为0-80min，流动相B：5-25%，收集馏分检测合格合并待处理；高效液相色谱见图4；

4）收集馏分用旋转蒸发仪在32-38℃下旋蒸，冻干后得到合格得产品粉末，收率为82%。

实施例3

1）称量50g多肽产品溶于甲醇水溶液中，超声溶解过滤后得到阿基瑞林待纯化样品；

2) 样品进行第一次纯化，采用中压色谱。其中以多糖凝胶为固定相，粒径为25μm；流动相A为体积百分比0.1%乙酸铵水溶液，流动相B为100%乙醇；洗脱梯度为0-80min，流动相B：5-30%，收集馏分检测90%纯度以上备用；高效液相色谱见图5；

3）上述方法多次收集目标馏分进行第二次纯化，采用反相高效液相色谱法。其中以C18键合硅胶为固定相，粒径为7μm；流动相A为体积百分比0.1%乙酸铵水溶液，流动相B为100%甲醇；洗脱梯度为0-80min，流动相B：5-25%，收集馏分检测合格合并待处理；高效液相色谱见图6；

4）收集馏分用旋转蒸发仪在32-38℃下旋蒸，冻干后得到合格得产品粉末，收率为80%。