阅读说明：本技术 一种利用artp与紫外复合诱变的绿僵菌菌株制备方法 (Preparation method of metarhizium strain by utilizing ARTP and ultraviolet composite mutagenesis ) 是由 张国强 尼玛扎西 黄玉 于 2020-04-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用ARTP与紫外复合诱变的绿僵菌菌株制备方法,涉及真菌技术领域,具体为一种利用ARTP与紫外复合诱变的绿僵菌菌株制备方法,包括制备孢悬液、ARTP诱变、ARTP诱变培养、紫外诱变、紫外诱变培养、ARTP结合紫外复合诱变、ARTP结合紫外复合诱变培养、初筛、复筛、测定突变菌株稳定性。该利用ARTP与紫外复合诱变的绿僵菌菌株制备方法,通过结合常压室温等离子体和紫外复合诱变,成功筛选到生长饱满,产孢快,抗紫外线能力强,毒力强的优良菌株AU34,其产孢量比原始菌株提高了1.6倍,在检测传代六次的产孢量后,该诱变菌株具有良好的遗传稳定性,该方法为获取高性能绿僵菌菌株提供了一种新型研究方法,提高了绿僵菌的应用能力。(The invention discloses a preparation method of a Metarrhizium anisopliae strain by utilizing ARTP and ultraviolet composite mutagenesis, which relates to the technical field of fungi, in particular to a preparation method of a Metarrhizium anisopliae strain by utilizing ARTP and ultraviolet composite mutagenesis. According to the preparation method of the Metarrhizium anisopliae strain by utilizing ARTP and ultraviolet composite mutagenesis, normal-pressure room-temperature plasma and ultraviolet composite mutagenesis are combined, a good strain AU34 which is full in growth, fast in spore production, strong in ultraviolet resistance and strong in toxicity is successfully screened, the spore production amount of the good strain AU34 is increased by 1.6 times compared with that of an original strain, after the spore production amount of six times of passage is detected, the mutagenized strain has good genetic stability, a novel research method is provided for obtaining a high-performance Metarrhizium anisopliae strain, and the application capability of the Metarrhizium anisopliae is improved.)

一种利用ARTP与紫外复合诱变的绿僵菌菌株制备方法

技术领域

本发明涉及真菌技术领域，具体为一种利用ARTP与紫外复合诱变的绿僵菌菌株制备方法。

背景技术

金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)是一种广谱的昆虫病原真菌，具有不污染环境、无残留、害虫不会产生抗药性，对人畜无害等优点，被认为是一种环境友好型杀虫剂。金龟子绿僵菌致病机理是由其分生孢子粘附在昆虫体表，利用氨基酸、蛋白质等营养物质萌发，分泌蛋白酶，几丁质酶等穿透昆虫表皮，在昆虫体内大量繁殖，产生毒素，最后导致昆虫死亡。但是不利的环境条件会影响微生物制剂的发挥，紫外线、湿度和温度都是影响绿僵菌分生孢子萌发和生长的因素。在田间试验中，紫外线和高温降低了孢子的存活率，毒力大大降低，阻碍了绿僵菌分生孢子的作用。若是能够提高绿僵菌的产孢量，紫外抗性等性能，将有助于保持分生孢子的活力，萌发能力和毒力，提高绿僵菌的应用能力。

常压室温等离子体诱变系统(ARTP)，一种新兴的诱变技术，它能够产生具有高活性粒子浓度的等离子体射流，引起生物体的死亡或突变，从而引起基因的随机突变。ARTP诱变技术已成功应用于细菌、真菌等百余种微生物，具有操作简便、安全无毒、低成本，突变谱广，突变率高的优点。

紫外诱变，一种使用最早、使用时间最长、使用最广泛、使用效果相当显著的方法。紫外线通过作用于DNA分子，使DNA链的相邻嘧啶之间形成嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常相互配对，从而引起微生物的突变或死亡。

近年来，为了获得绿僵菌优良菌株，大部分是通过紫外诱变来获取。比如利用紫外线和亚硝酸复合诱变，选育出孢子海藻糖含量显著提高的耐储藏诱变株M105-32；通过紫外诱变筛选一株生长更快，紫外耐受性和耐热性更强的突变株。但是尚未见利用ARTP诱变技术的报道，并且也没有将ARTP诱变技术和紫外诱变技术相结合使用与绿僵菌菌株的选育上，限制了高性能绿僵菌菌株的制备方法，同时也限制了使用绿僵菌制作的杀虫剂的发展。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种利用ARTP与紫外复合诱变的绿僵菌菌株制备方法，解决了上述背景技术中提出的问题。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种利用ARTP与紫外复合诱变的绿僵菌菌株制备方法，包括以下步骤：

S1、制备孢悬液：取Tween80溶液5mL打在新鲜的培养基平板上，将原始绿僵菌菌株的孢子冲洗下来放入到10mL含有玻璃珠的离心管中，并振荡均匀，用四层的灭菌擦镜纸过滤后稀释相应的倍数；

S2、ARTP诱变：将载片放于酒精灯外焰灼烧30s，放到已灭过菌的平板中，待冷却后，取10μL菌液均匀涂于载片上，打开ARTP诱变育种仪，开启紫外灯灭菌30min，将盛有990μL无菌水的1.5mL EP管固定在ARTP诱变仪卡槽里，把装有载片的灭菌培养皿转移到ARTP操作室内，用无菌镊子依次将载片放到对应卡槽，设置ARTP诱变时间；

S3、ARTP诱变培养：在经过步骤S2的ARTP诱变后，将装有载片的EP管振荡洗脱，稀释相应地倍数并吸取100μL涂布于培养基平板中，避光培养，计算ARTP诱变致死率；

S4、紫外诱变：将磁力搅拌器放入超净工作台中，用酒精清洗超净工作台和磁力搅拌器，固定距离30cm，打开紫外灯灭菌20min，吸取5mL孢悬液加入于已灭菌的带有转子的平板中，打开磁力搅拌器和培养皿盖，在黑暗条件下用紫外灯照射，设置紫外诱变时间，照射结束后，关闭紫外灯；

S5、紫外诱变培养：将步骤S4中不同照射时间的菌液稀释合适的倍数，吸取100μL涂布于培养基平板中，避光培养，计算紫外诱变致死率；

S6、ARTP结合紫外复合诱变：将孢悬液依次经过步骤S2的ARTP诱变和S4的紫外诱变；

S7、ARTP结合紫外复合诱变培养：将经过步骤S6后的孢悬液稀释并涂布于培养基平板上，重复3次，避光培养，计算ARTP结合紫外复合诱变致死率；

S8、对于S7中的诱变株，观察其在不同时间的培养基平板的生长情况，计数培养基平板上的菌落，对诱变株进行初筛，将培养基平板上长出来的菌落点种于新的培养基平板上，于第6天时测量并记录菌落生长直径，筛选诱变后能产孢、菌落生长速度快、生长直径大的诱变株；

S9、复筛：包括抗紫外线能力筛选和毒力筛选，

所述抗紫外线能力筛选方法为：将初筛得到的菌株在紫外灯下照射5min，选择萌发率高的，抗紫外能力较强的菌株；

所述毒力筛选方法为：把原始菌株和通过抗紫外线能力筛选后得到的诱变株一起进行小菜蛾毒力试验，选择对小菜蛾毒力强的菌株；

S10、测定突变菌株稳定性：获得的诱变优良菌株在培养基平板上连续传代点种，用4mm的打孔器挖取菌块，测定菌株连续六代的产孢量，检测其稳定性。

可选的，所述原始菌株采用金龟子绿僵菌421为材料。

可选的，所述培养基平板的制作材料为包括200g土豆，20g葡萄糖，20g琼脂，1000ml水。

可选的，所述毒力筛选的具体步骤为：

a、用浸泡法将供试1×10⁷个/mL的绿僵菌孢子接种于小菜蛾2龄幼虫；

b、采用Tween80溶液作对照，每天定时观察小菜蛾的症状并记录，统计小菜蛾的死亡数，并求出校正死亡率；

c、在幼虫死亡后，将虫尸保湿培养，5天后检查虫体是否有菌丝及分生孢子长出，确认是否因感染绿僵菌致死。

可选的，所述ARTP诱变时间设定为0s，10s，20s，30s，40s，50s，60s，所述ARTP诱变仪的诱变条件设置为放电功率为100W，气流量为10SLM。

可选的，所述紫外诱变照射时间设定为0s，30s，60s，90s，120s，150s，180s，210s，240s，270s，所述紫外灯功率设置30W。

可选的，所述Tween80溶液的浓度为0.05％，所述0.05％的Tween80溶液制备方法为：取50μL Tween80溶于100ml水中。

可选的，所述孢悬液的稀释倍数为10⁷左右。

可选的，所述避光培养的温度为28℃，所述避光培养的时间为3天。

本发明提供了一种利用ARTP与紫外复合诱变的绿僵菌菌株制备方法，具备以下有益效果：

1、该利用ARTP与紫外复合诱变的绿僵菌菌株制备方法，通过结合常压室温等离子体和紫外复合诱变，成功筛选到一株生长饱满，产孢快，抗紫外线能力强，毒力强的优良菌株AU34，其产孢量比原始菌株提高了1.6倍，在检测传代六次的产孢量后，该诱变菌株具有良好的遗传稳定性，该方法为获取高性能绿僵菌菌株提供了一种新型研究方法，提高了绿僵菌的应用能力。

2、该利用ARTP与紫外复合诱变的绿僵菌菌株制备方法，通过利用ARTP诱变技术易得到稳定的突变菌株的特点，与传统的紫外诱变相结合，大大提高了菌株的突变率，同时也丰富了菌株突变的多样性，有利于获取产孢量高、耐紫外线强以及毒力强的优良诱变株。

3、该利用ARTP与紫外复合诱变的绿僵菌菌株制备方法，通过常压室温等离子体结合紫外复合诱变所获取的高性能绿僵菌菌株，为制备无污染、无残留的环境友好型杀虫剂提供了新的材料，有利于提高现有杀虫剂的使用效果，契合我国的生态文明建设以及绿色农业发展的要求。

附图说明

图1为本发明原始菌株和ARTP-紫外复合诱变菌株同一时间菌株产孢对照图；

图2为本发明原始菌株和ARTP-紫外复合诱变菌株菌落大小对照图；

图3为本发明ARTP诱变致死曲线图；

图4为本发明紫外诱变致死曲线图；

图5为本发明ARTP-紫外复合诱变致死曲线图；

图6为本发明原始菌株紫外照射后的存活率；

图7为本发明AU3紫外照射后的存活率；

图8为本发明AU34紫外照射后的存活率。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

请参阅图1至图8，本发明提供一种技术方案：一种利用ARTP与紫外复合诱变的绿僵菌菌株制备方法，包括以下步骤：

S1、制备孢悬液：取Tween80溶液5mL打在新鲜的培养基平板上，培养基平板的制作材料为包括200g土豆，20g葡萄糖，20g琼脂，1000ml水原始菌株采用金龟子绿僵菌421为材料，将原始绿僵菌菌株的孢子冲洗下来放入到10mL含有玻璃珠的离心管中，并振荡均匀，用四层的灭菌擦镜纸过滤后稀释相应的倍数，孢悬液的稀释倍数为10⁷左右，即在稀释时，用血球计数板在光学显微镜下计数，将孢悬液的浓度调整至10⁷左右；

S2、ARTP诱变：将载片放于酒精灯外焰灼烧30s，放到已灭过菌的平板中，待冷却后，取10μL菌液均匀涂于载片上，打开ARTP诱变育种仪，开启紫外灯灭菌30min，将盛有990μL无菌水的1.5mL EP管固定在ARTP诱变仪卡槽里，把装有载片的灭菌培养皿转移到ARTP操作室内，用无菌镊子依次将载片放到对应卡槽，设置ARTP诱变时间，ARTP诱变时间设定为0s，10s，20s，30s，40s，50s，60s，ARTP诱变仪的诱变条件设置为放电功率为100W，气流量为10SLM；

S3、ARTP诱变培养：在经过步骤S2的ARTP诱变后，将装有载片的EP管振荡洗脱，稀释相应地倍数并吸取100μL涂布于培养基平板中，避光培养，避光培养的温度为28℃，避光培养的时间为3天，计算ARTP诱变致死率；

S4、紫外诱变：将磁力搅拌器放入超净工作台中，用酒精清洗超净工作台和磁力搅拌器，固定距离30cm，打开紫外灯灭菌20min，吸取5mL孢悬液加入于已灭菌的带有转子的平板中，打开磁力搅拌器和培养皿盖，在黑暗条件下用紫外灯照射，设置紫外诱变时间，紫外诱变照射时间设定为0s，30s，60s，90s，120s，150s，180s，210s，240s，270s，紫外灯功率设置30W，照射结束后，关闭紫外灯；

S5、紫外诱变培养：将步骤S4中不同照射时间的菌液稀释合适的倍数，吸取100μL涂布于培养基平板中，28℃避光培养3天，以上均在红外光下操作，计算紫外诱变致死率；

S6、ARTP结合紫外复合诱变：将孢悬液依次经过步骤S2的ARTP诱变和S4的紫外诱变；

S7、ARTP结合紫外复合诱变培养：将经过步骤S6后的孢悬液稀释并涂布于培养基平板上，重复3次，避光培养，计算ARTP结合紫外复合诱变致死率；

S8、对于S7中的诱变株，观察其在不同时间的培养基平板的生长情况，计数培养基平板上的菌落，对诱变株进行初筛，将培养基平板上长出来的菌落点种于新的培养基平板上，于第6天时测量并记录菌落生长直径，筛选诱变后能产孢、菌落生长速度快、生长直径大的诱变株；

S9、复筛：包括抗紫外线能力筛选和毒力筛选，

抗紫外线能力筛选方法为：将初筛得到的菌株在紫外灯下照射5min，选择萌发率高的，抗紫外能力较强的菌株；

毒力筛选方法为：把原始菌株和通过抗紫外线能力筛选后得到的诱变株一起进行小菜蛾毒力试验，选择对小菜蛾毒力强的菌株，

毒力筛选的具体步骤为：

a、用浸泡法将供试1×10⁷个/mL的绿僵菌孢子接种于小菜蛾2龄幼虫；

b、采用Tween80溶液作对照，每天定时观察小菜蛾的症状并记录，统计小菜蛾的死亡数，并求出校正死亡率；同时通过每天的死亡率做相关性分析，求出LT₅₀和毒力回归方程，用SPSS软件做数据统计分析，

c、在幼虫死亡后，将虫尸保湿培养，5天后检查虫体是否有菌丝及分生孢子长出，确认是否因感染绿僵菌致死，从而筛选具高侵染能力的绿僵菌菌株，毒力筛选分为原始原始菌株和通过抗紫外线能力筛选出的较强的诱变菌株，将上述两种菌株各重复三组毒力筛选实验，每组实验各接种20只小菜蛾。

S10、测定突变菌株稳定性：获得的诱变优良菌株在培养基平板上连续传代点种，用4mm的打孔器挖取菌块，测定菌株连续六代的产孢量，检测其稳定性。

该制备方法中所采用的仪器包括恒温恒湿培养箱、ARTP-Ⅱ型诱变育种仪、HVE-50高压灭菌锅、SZ-97自动三重纯水蒸馏器、Mixer 4K微型旋涡混合仪、SJ-CJ-2FD超净工作台、85-2恒温磁力搅拌器，该制备方法中所使用培养基平板的制作材料为包括200g土豆，20g葡萄糖，20g琼脂，1000ml水，该制备方法中所使用的试剂为Tween80溶液，Tween80溶液的浓度为0.05％，0.05％的Tween80溶液制备方法为：取50μL Tween80溶于100ml水中。

经过步骤S1至S9三种诱变方法的结果分析如下：

根据附图3所示：以金龟子绿僵菌421孢悬液为出发菌株，随着ARTP诱变时间的增加，致死率逐渐上升。经ARTP诱变，发现在60s时致死率接近100％。当照射时间为40s时，致死率为80.06％。为获得生长快，产量高的优良菌株，一般把80％至90％的致死率选定为诱变时间，因此本方法ARTP诱变处理时间选定40s。

根据附图4所示：在30W紫外灯下照射处理不同时间后，发现随着时间延长致死率逐渐升高，紫外诱变时间在照射270s时，致死率达到100％，因此将紫外诱变的时间选定为270s。

根据附图5所示：ARTP结合紫外复合诱变，在120，150s，180s时，致死率分别为70.38％，94.81％，97.97％，考虑到本方法是结合ARTP和紫外复合诱变，为保证有足够的菌株，因此将120s作为诱变时间。

初筛结果如下：

在经过ARTP结合紫外复合诱变后，将诱变后长出的菌落和原始菌株点种到新的培养基平板上，通过比较原始菌株和ARTP结合紫外复合诱变菌株的生长直径大小及产孢快慢，共筛得了28株生长直径比原始菌株大的诱变菌株，结果见表1。

表1原始菌株与诱变株生长直径大小

其中有5株诱变株AU6，AU23，AU34，AU43，AU48产孢较快，产孢特征见附图1所示，这5株诱变株在48h后开始产孢，而原始菌株则是在60h后开始产孢。其余诱变菌株产孢表现与初始菌株一致，但菌落大小较初始菌株大，结果如附图2所示。

复筛结果如下：

一、抗紫外线能力筛选：将初筛得到的28株诱变菌株在紫外灯下照射5min后，发现原始菌株，AU3，AU34在照射5min后的存活率分别为0.40％，2.36％，3.18％，诱变菌株AU3，AU34两株菌株比原始菌株更抗紫外线照射，其中菌株AU34耐紫外线能力更强，原始菌株、诱变菌株AU3、诱变菌株AU34的紫外照射存活率曲线图分别如附图6、附图7和附图8所示。

二、毒力筛选：将原始菌株，AU3，AU34的孢悬液作用于小菜蛾，每天定时观察小菜蛾的死亡数，做数据统计分析。结果见表2。

表2金龟子绿僵菌对小菜蛾的毒力

通过表2，可以看出原始菌株，诱变菌株AU3，诱变AU34的校正死亡率分别是80.36％，82.14％，85.71％，其中菌株AU34的死亡率较高，从半数致死时间看，菌株AU34所用的LT50最短，为6.12d。因此，菌株AU34对小菜蛾的毒力最好。

测定突变菌株稳定性结果如下：

通过测量生长6d的产孢量，原始菌株的产孢量为0.995±0.316(10⁸孢子/cm²)，菌株AU34的产孢量比原始菌株提高了1.6倍。对菌株AU34进行遗传稳定性试验，结果见表3，经过连续六代产孢量检测，菌株AU34具有良好的遗传稳定性。

表3菌株AU34的遗传稳定性

综上，该利用ARTP与紫外复合诱变的绿僵菌菌株制备方法，通过将利用ARTP诱变、紫外诱变以及ARTP结合紫外诱变三种诱变方法，根据ARTP诱变、紫外诱变和ARTP紫外复合诱变的菌株的致死率统计，选取合适的ARTP结合紫外诱变的诱变时间，从而获取ARTP结合紫外诱变的菌株，将上述通过ARTP结合紫外诱变获取的菌株经过初筛，选取能产孢、菌落生长速度快、生长直径大的高性能诱变株，再将高性能诱变株分别通过抗紫外线能力筛选和毒力筛选，获取抗紫外线能力强以及毒力强的高性能诱变株，最后，再对上述高性能诱变株进行菌株遗传稳定型测定，即可。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。