阅读说明：本技术 一株赤红球菌及其用于烟酰胺生产的方法 (Rhodococcus ruber and method for producing nicotinamide by using same ) 是由 李自云 邵树强 于 2020-04-01 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物技术领域,具体地涉及一株赤红球菌及其用于烟酰胺生产的方法；包括赤红球菌催化剂的制备和水合反应等步骤,以赤红球菌发酵产生的腈水合酶为催化剂,以纯水为反应体系,通过流加或批次添加的方式,将3-氰基吡啶催化转化为烟酰胺；本发明提供的产腈水合酶的赤红球菌遗传稳定性好,培养成本低,产生的腈水合酶酶活力高,可直接利用该菌株将3-氰基吡啶转化为烟酰胺。催化反应时,以纯水为反应体系,反应液终反应浓度可达400g/L以上,避免引入外源杂质,同时有利于提取分离操作,工业应用具有优势。(The invention belongs to the technical field of biology, and particularly relates to Rhodococcus ruber and a method for producing nicotinamide by using the Rhodococcus ruber, which comprises the steps of preparation of a Rhodococcus ruber catalyst, hydration reaction and the like, wherein nitrile hydratase generated by fermentation of the Rhodococcus ruber is used as the catalyst, pure water is used as a reaction system, and 3-cyanopyridine is catalytically converted into nicotinamide by a fed-batch or batch adding mode.)

一株赤红球菌及其用于烟酰胺生产的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地涉及一株赤红球菌及其用于烟酰胺生产的方法。

背景技术

烟酰胺(nicotinamide；niacinamide)又称尼克酰胺、维生素B3、维生素PP，为白色的结晶性粉末；无臭或几乎无臭，味苦；略有引湿性。在水或乙醇中易溶，在甘油中溶解。临床药物为维生素B族，用于防治糙皮病及口炎、舌炎等病症的治疗。它是哺乳类动物必需的营养物，水溶性较烟酸好。烟酰胺和烟酸在大多数场合下可以通用，烟酸在动物体内也生成烟酰胺。烟酰胺在化妆品中可作为营养性添加剂。此外还用于食品及饲料添加剂。市场前景十分广阔。

烟酰胺的生产主要分化学法和生物法两种。化学合成法主要通过水解3-氰基吡啶生产烟酰胺和烟酸，反应选择性差，得到的烟酰胺产品中烟酸含量相对较高。微生物催化法生产烟酰胺与化学法相比具有高选择性、高效性、反应条件温和、杂质少、环境污染小等优点。以微生物催化反应往往需要在缓冲盐体系内进行，以维持酶活的稳定性。还有一些研究致力于以大肠杆菌或枯草芽孢杆菌为宿主，进行酶基因的表达，这种方式往往需要在微生物培养时添加诱导剂或抗生素来实现，培养成本高，菌种的遗传稳定性差。因此，对微生物法来说，选择一株培养成本底、酶活高、催化能力强，遗传稳定性好的菌株，对整个烟酰胺的生产起至关重要的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一株赤红球菌及其用于烟酰胺生产的方法，以解决上述问题。

本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：

一株赤红球菌用于烟酰胺生产的方法，包括以下工艺步骤：

(1)赤红球菌催化剂的制备：

种子培养：在种子罐中加入为种子罐容积40-90％的培养基，所述培养基包括以下质量百分数的组成：0.2-1％酵母浸膏、0.5-2％葡萄糖、0.1-2％氯化钠、0.02-1％七水硫酸镁、 0.02-1％磷酸二氢钾、0.02-1％磷酸氢二钾、0.01-0.5％消泡剂；用氢氧化钠调节pH至6.5-8.0； 118-125℃灭菌25-35分钟，待温度降至25-40℃时接入菌种，在该温度下不断通入无菌空气保持罐压，搅拌培养24小时；

菌种发酵：在发酵罐中加入为发酵罐容积40-90％的培养基，所述培养基包括以下质量百分数的组成：0.2-1％酵母浸膏、0.5-2％葡萄糖、0.1-5％玉米浆、0.1-2％硫酸铵、0.02-1％七水硫酸镁、0.02-1％磷酸二氢钾、0.02-1％磷酸氢二钾、0.01-0.5％消泡剂；用氢氧化钠调节pH至6.5-8.0；118-125℃灭菌25-35分钟，待温度降至20-40℃时，按1％-10％比例接入菌种，在该温度下不断通入无菌空气保持罐压，维持25-40℃搅拌培养40-70小时；

(2)水合反应：

将发酵培养结束的发酵液去除培养基组分后加入反应釜中，用纯水对菌体进行稀释，装液量为反应釜体积的60％，控制反应温度为20-60℃，缓慢流加3-氰基吡啶进行反应，当反应浓度达到400g/L以上，停止流加3-氰基吡啶，用液相色谱跟踪3-氰基吡啶的残留量<0.01时结束反应，制得烟酰胺。

本发明所述步骤(1)中使用的菌种为赤红球菌；所述赤红球菌分类命名拉丁文Rhodococcus ruber，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2019年10月28日，保藏编号：CGMCC No.18759。

本发明所述赤红球菌细胞形态为短杆状，菌落为圆形，橙黄色，革兰氏阳性，接触酶阳性，氧化酶阴性，能够利用葡萄糖、果糖、山梨醇、柠檬酸等。理化测试结果及16SrRNA基因序列测定结果来自中国科学院微生物研究所的检测鉴定报告，详细信息如下表：

1、细胞形态和理化实验结果

2、16S rRNA基因序列测定结果

本发明以赤红球菌发酵产生的腈水合酶为催化剂，以纯水为反应体系，通过流加或批次添加的方式，将3-氰基吡啶催化转化为烟酰胺。

本发明的技术效果：与现有技术相比，具有以下有益效果：本发明提供的产腈水合酶的赤红球菌遗传稳定性好，培养成本低，产生的腈水合酶酶活力高，可直接利用该菌株将3-氰基吡啶转化为烟酰胺。催化反应时，以纯水为反应体系，反应液终反应浓度可达400g/L以上，避免引入外源杂质，同时有利于提取分离操作，工业应用具有优势。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：赤红球菌菌种摇瓶培养及转化

配制摇瓶培养基，配方组成为：葡萄糖1.0％、酵母浸膏0.5％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸镁0.2％、磷酸二氢钾0.2％、味精0.5％、硫酸铵0.2％。用60℃的水溶解，冷却至室温后调节PH为7.0，然后量取50ml分装至250ml三角瓶中，121℃灭菌30min备用。用接种铲挖取适量菌泥接入备好的液体培养基中，置于35℃恒温摇床，200rpm培养60h。

取100ml发酵液用离心机分离，去掉培养基成分，用纯水将菌泥重新悬浮洗涤菌体，再次离心分离菌体，将菌体加纯水悬浮后恢复体积100mL,置于250ml三角瓶中，35℃水浴振荡，批次加入10g固体3-氰基吡啶反应30min后用液相检测3-氰基吡啶残留量及烟酰胺生成量，3-氰基吡啶添加量及产物生成情况如下表。

时间	加入3-氰基吡啶量(g)	烟酰胺含量(g/L)	3-氰基吡啶残留(g/L)
				0h	10.0
0.5h	10.0	106.8	0
				1h	10.0	194.7	0
1.5h	10.0	273.6	0.15
				2h	10.0	362.7	0.21
3h		443.5	0

反应结束产物浓度为443.5g/L,底物残留为零，3-氰基吡啶转化率100％。

实施例2：赤红球菌发酵培养及反应釜转化

在种子罐中加入为种子罐容积60％的培养基，所述培养基包括以下质量百分数的组成： 0.5％酵母浸膏、1.0％葡萄糖、0.3％氯化钠、0.1％七水硫酸镁、0.1％磷酸二氢钾、0.1％磷酸氢二钾、0.1％消泡剂；用氢氧化钠调节pH至7.0；121℃左右灭菌28分钟，待温度降至 35℃时接入菌种，在该温度下不断通入无菌空气保持罐压，搅拌培养24小时。

在发酵罐中加入为发酵罐容积60％的培养基，所述培养基包括以下质量百分数的组成： 0.7％酵母浸膏、1.0％葡萄糖、2％玉米浆、0.2％硫酸铵、0.1％七水硫酸镁、0.1％磷酸二氢钾、 0.1％磷酸氢二钾、0.1％消泡剂；用氢氧化钠调节pH至8.0；121℃左右灭菌30分钟，待温度降至35℃时，按1％比例接入菌种，在该温度下不断通入无菌空气保持罐压，维持35℃搅拌培养60小时。

将发酵培养结束的发酵液用陶瓷膜去除培养基组分，并用纯水洗涤3次以后加入反应釜中，对菌体进行稀释，装液量为反应釜体积的60％，控制反应温度为35℃，缓慢流加3- 氰基吡啶6小时，停止流加底物以后继续反应1小时，取样进行检测，此时反应液中烟酰胺浓度为462g/L，3-氰基吡啶残留量为零，3-氰基吡啶转化率100％。

上述具体实施方式仅是本发明的具体个案，本发明的专利保护范围包括但不限于上述具体实施方式的产品形态和式样，任何符合本发明权利要求书且任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应落入本发明的专利保护范围。