阅读说明：本技术 过滤的细胞培养盖及细胞培养方法 (Filtered cell culture cover and cell culture method ) 是由 J·J·西贝克 于 2018-11-29 设计创作，主要内容包括：本文提供了一种生物反应器。所述生物反应器包括具有壁的容器,所述壁至少部分限定用于容纳流体的内部隔室；至少一个端口；以及被构造成与所述至少一个端口可移除地接合的至少一个盖,所述至少一个盖包含过滤材料。本文还提供了一种细胞培养方法,其包括：将细胞和细胞生长培养基加入到生物反应器的容器中,以及将微载体加入到所述容器中以在微载体上形成显著融合的细胞。所述细胞培养方法还包括：洗涤融合的细胞,收获融合的细胞以形成含有细胞的溶液,以及通过使溶液流过与生物反应器的至少一个端口可移除地接合的盖中的过滤材料,从所述容器移除含有细胞的溶液。(A bioreactor is provided herein. The bioreactor comprises a vessel having walls at least partially defining an interior compartment for containing a fluid; at least one port; and at least one cap configured to removably engage with the at least one port, the at least one cap comprising a filter material. Also provided herein is a cell culture method comprising: the method includes the steps of adding cells and cell growth medium to a vessel of a bioreactor, and adding microcarriers to the vessel to form substantially confluent cells on the microcarriers. The cell culture method further comprises: washing the fused cells, harvesting the fused cells to form a solution containing the cells, and removing the solution containing the cells from the container by flowing the solution through a filter material in a lid removably engaged with the at least one port of the bioreactor.)

过滤的细胞培养盖及细胞培养方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年11月29日提交的美国临时申请系列第62/592,011号的优先权权益，本文以该申请的内容为基础并将其全文纳入本文，如同在下文完整阐述。

技术领域

本公开一般涉及细胞培养系统，更具体地，涉及包括过滤盖并且所述过滤盖用于使细胞与微载体分离的细胞培养系统。

背景技术

微载体细胞培养通常在生物反应器中进行。在培养期间，细胞在微载体的表面上生长。一旦细胞培养过程完成，经培养的细胞从微载体剥离，接着使含有细胞的经培养的溶液与微载体分离以用于进一步处理。

从微载体剥离细胞的常规过程包括使微载体在生物反应器中沉降。使微载体沉降一般包括在生物反应器中停止搅拌。然后可以移除生物反应器中的细胞培养基。接着可以进行至少一个洗涤步骤，其中，将含有例如达氏(Dulbecco)磷酸盐缓冲盐水的洗涤溶液加入到生物反应器中并接着搅拌生物反应器的内容物，持续短的时间。在短时间的搅拌后，使微载体再次沉降，并且从生物反应器移除洗涤溶液。然后将包含细胞剥离剂(例如胰蛋白酶)的收获溶液加入到生物反应器中并继续搅拌。配合着搅拌，收获溶液从微载体剥离大量细胞。

在常规分离过程期间使微载体沉降可能耗时，并且例如完成常规分离过程的时间可增加几乎50％。另外，细胞和微载体在生物反应器中的沉降可造成聚集，其中细胞和微载体在生物反应器的底部变得紧凑。由于变得紧凑，细胞可能经历以营养物和氧气耗尽，细胞废产物浓度高和极端pH为特征的环境。这样的环境对细胞生长、细胞健康和/或细胞功能可具有直接不利影响。

在从微载体剥离细胞后，常规地使微载体与包含剥离细胞的经培养的溶液分离。进行这种分离的一种常规技术包括使溶液通过容器中的刚性网筛。该筛允许经培养的流体通过，但阻止微载体通过。然而，随着微载体在筛上积累，它们开始堵塞筛并且阻止流体从中通过。堵塞的微载体还可困住细胞并阻止细胞通过网筛。一旦筛被堵塞，则过程停止直到筛畅通。这些过程步骤可能昂贵且耗时，并且还被认为在微载体细胞培养中导致细胞收率降低。另外，由于网筛是单独的系统部件，因此需要从进行细胞培养过程的容器转移经培养的溶液以使其通过网筛。由于该转移，这些网筛可能增加污染细胞或者细胞培养溶液的风险。

用于使微载体与包含剥离细胞的经培养的溶液分离的几种其他技术例如包括差异化梯度离心、声共振、切向流过滤、旋转过滤器以及使用锥形或倾斜板的沉降。大多数的这些技术要求昂贵的资本设备或者操作复杂。

发明内容

根据本公开的实施方式，提供了一种生物反应器。所述生物反应器包括具有壁的容器，所述壁至少部分限定用于容纳流体的内部隔室；至少一个端口；以及被构造成与所述至少一个端口可移除地接合的至少一个盖，所述至少一个盖包含过滤材料。

根据本公开的实施方式，提供了一种细胞培养方法。所述细胞培养方法包括：将细胞和细胞生长培养基加入到生物反应器的容器中，以及将微载体加入到所述容器中以在微载体上形成显著融合的细胞。所述细胞培养方法还包括：洗涤融合的细胞，收获融合的细胞以形成含有细胞的溶液，以及通过使溶液流过与生物反应器的至少一个端口可移除地接合的盖中的过滤材料，从所述容器移除含有细胞的溶液。

在以下的

具体实施方式

中给出了其他特征和优点，其中的部分特征和优点对本领域的技术人员而言，根据所作描述就容易看出，或者通过实施包括以下具体实施方式、权利要求书以及附图在内的本文所述的各个实施方式而被认识。

应理解，前面的一般性描述和以下的具体实施方式都仅仅是示例性的，并且旨在提供用于理解权利要求的性质和特性的总体评述或框架。所附附图提供了进一步理解，附图被结合在本说明书中并构成说明书的一部分。附图说明了一个或多个实施方式，并与说明书一起用来解释各种实施方式的原理和操作。

附图说明

通过以下的说明和附图能够更加清晰地理解本公开，以下附图仅作为非限制性的实例给出，其中：

图1示出了根据本公开的实施方式所述的一种示例性生物反应器；

图2A是根据本公开的实施方式所述的具有过滤器的被局部切除的盖的透视图；

图2B是根据本公开的实施方式所述的具有过滤器的盖的透视图；

图3是根据本公开的实施方式所述的具有过滤器的盖的顶视图；

图4是根据本公开的实施方式所述的生物反应器的剖视透视图；

图5是根据本公开实施方式所述的生物反应器的分解图；以及

图6例示了根据本公开实施方式所述的一种细胞培养方法。

具体实施方式

下面对本公开的实施方式作详细说明，这些实施方式的实例在附图中示出。只要可能，在附图中使用相同的附图标记表示相同或相似的部分。

除非上下文明确有其他的说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数的指代物。阐述相同特征的所有范围的端点可独立地组合并包含所述端点。所有参考文献都以参考的方式纳入本文中。

如在本文中所使用的，“具有”、“具备”、“含有”、“包括”、“包含”、“含”等以其开放含义使用，通常表示“包括但不限于”。

除非另外说明，本文中使用的所有科技术语的含义具有本领域通用的含义。本文提供的定义是用来帮助理解本文经常用到的某些术语，不对本公开的范围构成限制。

下文首先概括地描述本公开，然后在几个示例性实施方式的基础上详细描述本公开。在各个示例性实施方式中彼此组合示出的各特征并非都必须实现。特别地，各个特征也可以省略或与相同的示例性实施方式或其他示例性实施方式所示的其他特征以其他方式组合。

本公开的实施方式涉及包括密封盖并且在所述盖中具有过滤器的生物反应器。本文所述的盖允许从微载体分离细胞且无需留出时间使微载体在生物反应器中沉降，这进而减少了完成细胞与微载体分离的过程所需的时间量，并且还减少了与进行所述过程相关的成本。使细胞与微载体分离并且无需留出时间使微载体在生物反应器中沉降还防止了微载体在生物反应器中变得紧凑的状态，这进而减少或消除了与微载体变得紧凑有关的对细胞生长、细胞健康和/或细胞功能的不利影响。

本公开的实施方式还允许在单个容器中进行细胞与微载体分离的过程。通过促进本文所述的在单个容器盖中进行分离过程，还降低了与从初始系统或容器移除细胞并将细胞转移到后续系统或容器相关的污染风险以及细胞收率损失。降低的污染风险的实例包括细胞潜在地暴露于污染物，例如，来自各种系统或容器的材料的可提取物和可浸出物和/或可能来自各种系统或容器的材料的微粒，或在将细胞或细胞产物从一个系统或容器转移到另一系统或容器期间可能源自环境的微粒。暴露于这些污染物可能导致昂贵的下游产物受污染，由于污染，最终需要弃去这些下游产物。

如本文中所使用的，术语“流体”用于指能够流动的任何物质，例如但不限于液体、液态悬浮物、气体、气态悬浮物等。在本公开的全文中使用术语“流体和/或其他组分”来表示可包含以下组分的流体：具有用于细胞生长的营养物质的细胞培养基，，细胞，细胞培养过程的副产物以及可以常规添加到生物处理系统中或在生物处理系统中形成的任何其他生物材料或组分。本文所述的容器可以包含一种或多种细胞或试剂。所述容器还可以包含缓冲液。另外，所述容器可以包含细胞培养基。细胞培养基可以例如但不限于糖、盐、氨基酸、血清(例如胎牛血清)、抗生素、生长因子、分化因子、着色剂或其他所需因子。可以在所述容器中提供的常见培养基包括达氏修正依氏培养基(DMEM)、汉氏F12营养混合物、最低必需培养基(MEM)、RPMI培养基等。在所述容器中可以包含任何类型的培养细胞，包括但不限于永生化细胞、原代培养细胞、癌细胞、干细胞(例如胚胎干细胞或诱导多能干细胞)等。所述细胞可以是哺乳动物细胞、禽细胞、鱼细胞等。所述细胞可以属于任何组织类型，包括但不限于肾、成纤维细胞、乳房、皮肤、脑、卵巢、肺、骨、神经、肌肉、心脏、结直肠、胰腺、免疫(例如，B细胞)、血液等组织类型。在所述容器中，所述细胞可以为任何培养形式，包括分散(例如刚接种的)、融合、二维、三维、球体等。在一些实施方式中，细胞在没有培养基的情况下存在(例如，冻干的、具防腐剂的、冷冻的细胞等)。

参考图1，其示出了根据本公开实施方式所述的生物反应器。生物反应器10包括容器11，其具有容器主体12，所述容器主体12具有顶部14和底部16。容器11还包括颈状可及端口18以及设置在容器11的内部隔室13中的搅拌器20。虽然图中示出了两个可及端口18，但应理解，根据本公开的实施方式所述的容器可以包括任何数目的可及端口18。每个颈状可及端口18可以由密封盖44a、44b闭合。盖44a、44b可以是被构造成与容器11的颈状可及端口18上的外螺纹配合的内螺纹拧盖。另外，盖44a、44b中的至少一者可以包括过滤器210。

顶部14可以包括环状侧壁，其限定了与容器11的内部隔室13连通的开口。所述环状侧壁可以具有被构造成与拧盖的内螺纹配合的外螺纹，或者所述环状侧壁可以具有被构造成与弹扣盖配合的环状突出弹扣盖接合特征。或者，顶部14可以与底部16整体形成，或如图4和5所示，可以沿着焊接线周向密封于底部16，所述焊接线是将围绕两个部分14、16的周界的互连唇缘结合起来所得到。

根据本公开实施方式所述的生物反应器可以包括由注塑聚合物或本领域普通技术人员认同的任何其他聚合物形成的容器10，所述注塑聚合物例如聚苯乙烯、聚碳酸酯、高密度聚丙烯(HDPE)、超高分子量(UHMW)聚乙烯、聚丙烯、EVA、LDPE和LLDPE。任选地，容器11可以由玻璃、金属或另一种刚性材料形成。

容器11可以包括在容器11的内部隔室13中的搅拌器20。搅拌器20可以包括从容器11的顶部14延伸的轴杆，所述轴杆具有至少一个叶轮，其沿着轴杆的长度并且连接到顶上方的电动机，所述电动机被构造用于使容器11的内部隔室13中的所述至少一个叶轮旋转。替代性地，搅拌器20可以包括从容器11的顶部延伸的轴杆并且所述轴杆在轴杆的端部处具有桨叶。所述轴杆连接到顶上方的电动机，所述电动机被构造用于使桨叶以相对于容器11的中心垂直轴线成非零角度旋转通过基本上圆形的路径。这种基于桨叶的搅拌器的一个实例示于第9,168,497B2号美国专利。作为另一种替代方案，如图4和5所示，搅拌器20可以包括从容器11的顶部延伸的轴杆，并且所述轴杆具有四个桨叶片，其从轴杆延伸并且与轴杆相连，并且每个桨叶片相对于彼此成90度设置。该四桨叶片式搅拌器还包括接收部，其被构造用于容纳磁力搅拌子，所述磁力搅拌子允许该四桨叶片式搅拌器通过磁感应旋转。这种四桨叶片式搅拌器的一个实例示于第8,057,092B2号美国专利。作为另一种替代方案，搅拌器20可以包括设置在内部隔室13的底部中的可旋转叶轮。可旋转叶轮至少部分具有磁性或铁磁性，并且可以与外部动力装置磁性耦合，所述外部动力装置包括用于与流体搅拌元件形成磁性耦合的旋转驱动磁体结构，用于旋转和悬浮流体搅拌元件的电磁结构，或用于悬浮和旋转流体搅拌元件的超导元件。这种可旋转叶轮的一个实例示于第7,481,572B2号美国专利。

现在参考图2A、2B和3，显示盖44a具有过滤器210。图2A示出了盖44a的局部剖视图，并且图3示出了盖44a的顶视图。过滤器210包括多孔材料，其允许某些物质从容器11离开，同时将其他物质保留在容器11内。一般而言，小到足以通过过滤器210的物质可以是被视为细胞或细胞产物的那些，它们可以被收集在设置在容器11外部的容器中以用于下游处理或使用。过滤器210的平均孔径足够地大，以允许细胞、细胞培养基或细胞产物(例如，重组蛋白、抗体、病毒颗粒、DNA、RNA、糖、脂质、生物柴油、无机颗粒、丁醇、代谢副产物)通过过滤器210，但是足够地小，以防止微载体通过膜并且将微载体保留在容器11的内部隔室13中。一般地，盖44a可以包括平均孔径在约1μm至约100μm之间的过滤器210。

如图2A所示，盖44a包括顶部214和底部216以及在顶部214与底部216之间延伸的大致圆柱形侧壁218。所述大致圆柱形侧壁218具有外表面，其可以具有在其上形成的各种表面特征，以向盖44a提供稳固抓握表面。所述表面特征例如可以是从侧壁218的外表面突出的至少一个脊。或者，表面特征可以呈现为沿着侧壁218的外表面形成的一系列凹陷。

如图2A的局部切除部分所示，侧壁218的内表面还包括下支承板222，其稳固过滤器210。下支承板222可以部分或完全围绕侧壁218的内表面的周长，连续地或在离散的部分中延伸。下支承板222防止过滤器210向下滑动到盖44a的内部中。在盖44a的顶部214处，过滤器210由上支承板220稳固，所述上支承板220与下支承板222一起形成过滤器210的支承结构。图2和3进一步示出了在盖44a的顶部214中形成的开口212，其允许过滤器210被暴露于外部环境。在操作时，可使容器11的内部隔室13中的流体接触过滤器210的内侧并且通过过滤器210，以及经由盖44a的开口212离开过滤器。

现在参考图2B，如图2A所示的具有过滤器210的盖44a显示还包括倾倒口244。倾倒口244可以固定于盖44a的顶部214，或者可以与盖44a整体形成。倾倒口244具有漏斗状形状，其引导通过过滤器210的任何流体和/或其他组分离开盖44a。

现参考图4-5，其示出了用于细胞培养的容器11。与图1的生物反应器10一样，容器11包括具有顶部14和底部16的容器主体12、颈状可及端口18和搅拌器20。顶部14和底部16沿着焊接线22周向密封，所述焊接线22是将限制顶部和底部周界的互连唇缘24、26结合所得到。容器11具有基本上圆柱的形状，并且具有顶表面58、侧壁55和底表面51，所述底表面51具有中心凸起凸块54。

如图5所示，容器主体12包括挡件50，其在与中心轴平行的垂直方向上，沿着容器主体12的内壁延伸。每个挡件50大致具有半圆柱或等腰三角形的截面形状。每个挡件50起始自底表面51并向上垂直延伸，以椭圆形终止。挡件50突出到容器11的内部隔室中，并与搅拌器20一起产生并实现容器11的内部隔室中的湍流。虽然图4和5所示的容器11包括围绕中心轴，沿着内壁对称设置的三个挡件50，但是挡件50的数目和密度可以不同。

搅拌器20包括沿着容器11的中心轴延伸的挠性轴杆28。挠性轴杆28在顶部14上具有单个安装点，其允许轴杆28自由旋转。从轴杆28延伸并与轴杆28相连的是四个桨叶片30、32，每个相对于彼此呈约90度设置。在这四个桨叶片30、32中有两个主叶片30和两个副叶片32。主叶片30相对于彼此呈约180度设置，同样地，所述两个副叶片32相对于彼此呈约180度设置。围绕中心轴杆的叶片的布置形成了副-主叶片取向的交替效果。应理解，其他叶片构造、形状和布置也是可行的，包括使用比四个叶片更少或更多的那些。搅拌器20的尺寸可以被调整成使主叶片30几乎延伸容器11的整个直径。或者，其中的至少一个主叶片30可以延伸容器11的半径的约50％至约95％，或约75％至约95％，所述半径从中心轴线到侧壁测得。

所述两个主叶片30包括用于容纳磁力搅拌子40的磁体接收部38。副叶片32和轴杆区域中的孔使磁体接收部38完整。圆柱形塞或磁力搅拌子40沿着所述两个主叶片30的下边缘被安装在磁体接收部38中并与副叶片32正交。或者，磁体自身被模制到搅拌器20中。为此，将磁体插入到模具中并在磁体自身周围重叠模制(over-mold)搅拌器。

可及端口18从容器11的顶部14向外延伸。可及端口18可以被构造成以与水平线成某角度从容器主体12延伸，从而允许将仪器插入到容器11中并且不被搅拌器20限制。可以对可及端口18的尺寸以及可及端口18从容器主体12延伸的角度进行选择，以优化仪器对容器11内的各个区域的可及性。

内螺纹密封盖44a、44b可以与可及端口18的外螺纹可移除地接合，并且可被移除以允许将仪器(例如移液管)插入到容器11中。至少一个盖44a可以包括过滤器210，例如，如图2和3所示的盖44a。另一个盖44b可以包括疏水膜插入物46，其由允许气体运输到容器内部中但防止液体从容器逸出以及防止其他污染物进入容器的材料制成。这种膜材料的实例包括聚四氟乙烯和聚偏二氟乙烯(PVDF)。任选地，包括本文所述的膜的盖44还可以包括通气口48，其允许容器11的内部与外部环境之间气体连通。

本公开的实施方式还涉及细胞培养方法。图6例示了根据本公开实施方式所述的一种示例性细胞培养方法。这样的细胞培养方法可以在如本文所述以及如图1-5例示的生物反应器中进行。应理解，图6仅是本文所述方法的实施方式的例示，并且不是必需进行所有的步骤，除了规定了顺序之外，本文所述方法的实施方式的步骤无需以任何特定的顺序进行。

本文所述的细胞培养方法600可以包括602：将细胞和细胞生长培养基加入到生物反应器10的容器11中。本文所述的细胞培养方法600可以进一步包括604：将微载体加入到容器11中以在微载体的表面上形成显著融合的细胞。本文所述的微载体可以由任何材料形成，并且常规由玻璃材料、塑料材料或水凝胶材料形成。本文所述的微载体的平均直径可以在约100微米至约500微米之间。通常，微载体的平均直径在约200微米至约300微米之间。可以将任何数目的微载体加入到容器11中，只要加入足够的微载体以促进生物反应器10中的显著融合即可。如本文所用，术语“融合的”和“融合”用于指当细胞在细胞培养基材的表面(即，微载体的表面)上形成了连贯的单细胞层以使得几乎所有可用表面均得到了利用时的状况。例如，“融合”被定义为所有细胞在其整个周围上都与其他细胞接触并且不留有未覆盖的可用基材的情况。出于本公开的目的，术语“显著融合”用于指即使可能保留有间隙，但是细胞与微载体的表面在总体上是接触时的状况，从而使得大于约70％，或大于约80％，或者甚至大于约90％的可用表面得到了利用。术语“可用表面”用于意指容纳细胞的足够的表面区域。因此，不能容纳另外的细胞的相邻细胞之间的小间隙不构成“可用表面”。

在将细胞、培养基和微载体加入到生物反应器10中后，在容器11中发生细胞的生长，并且继续生长直到细胞占据微载体表面(即，直到细胞在微载体上显著融合)，或者直到细胞超过了培养基容量而不支持进一步生长为止。超过培养基的容量是由于细胞消耗培养基中的营养物质并产生废产物所致，所述废产物对细胞生长、细胞健康和/或细胞功能具有直接的不利影响。在细胞的生长时期，至少某部分的时期包括用搅拌器20混合或搅拌生物反应器10中的流体和/或其他组分，这造成微载体悬浮在生物反应器10的内部隔室13中。

根据本公开的实施方式，本文所述的细胞培养方法600可以进一步包括606：通过经由盖44a的过滤器210从容器11倾倒培养基，从容器11移除废培养基。过滤器210允许具有细胞产物(包括细胞废产物)的废培养基通过过滤器210，同时将微载体和融合细胞保留在容器11中。不同于常规方法，过滤器210允许移除废培养基并且无需留有时间使微载体向着容器11的底表面51沉降。换言之，可在维持微载体处于悬浮状态的同时完成废培养基的移除。为了避免引起怀疑，术语“维持微载体处于悬浮状态”用于指微载体不聚集地沉降在生物反应器10中的状况。用搅拌器20搅拌或混合可以用于维持微载体处于悬浮状态；但应理解，用搅拌器20搅拌或混合可被中断，并且在搅拌或混合中断后，微载体维持处于悬浮状态一段时间。因此，不需要用搅拌器20搅拌或混合来维持微载体处于悬浮状态。在606的从容器11移除废培养基之后，本文所述的细胞培养方法600可以进一步包括608：将新鲜培养基加入到容器11中。可以通过从相应的颈状可及端口18移除盖44a、44b，并使新鲜培养基流过可及端口18中的开口来加入新鲜培养基。加入到容器11中的新鲜培养基的体积可以大致等于通过过滤器210移除的废培养基的体积。

606的从容器11移除废培养基以及随后的608的将新鲜培养基加入到容器11中可以进行任何次数直到细胞将要与微载体分离并得到回收。本文所述的细胞培养方法600可以包括610：洗涤融合的细胞。在610的洗涤融合的细胞之前，所述方法包括606：从容器11移除废培养基而随后不进行608：将新鲜培养基加入到容器11中。610的洗涤融合的细胞可以包括加入洗涤溶液，其含有例如磷酸盐缓冲溶液，例如达氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)。可以通过从相应的颈状可及端口18移除盖44a、44b，并使洗涤溶液流过可及端口18中的开口来加入洗涤溶液。随着洗涤溶液在容器11的内部隔室13中，可以用搅拌器18混合或搅拌生物反应器10中的流体和/或其他组分。610的洗涤融合的细胞还可以包括：从容器11移除洗涤溶液并且加入后续的洗涤溶液。从容器11移除洗涤溶液包括：通过盖44a的过滤器210从容器11倾倒洗涤溶液。过滤器210允许洗涤溶液通过过滤器210，同时将微载体和融合的细胞保留在容器11中。不同于常规方法，过滤器210允许移除洗涤溶液并且无需留有时间使微载体向着容器11中的底表面51沉降。换言之，可在维持微载体处于悬浮状态的同时完成洗涤溶液的移除。

从容器11移除洗涤溶液以及将后续的洗涤溶液加入到容器11中可以进行任何次数直到细胞将要与微载体分离。本文所述的细胞培养方法600还可以包括612：收获融合的细胞以形成含有细胞的溶液。在612的收获细胞之前，610的洗涤融合的细胞包括：从容器11移除洗涤溶液并且不将后续的洗涤溶液加入到容器11中。612的收获细胞包括：加入可以包含剥离剂(例如胰蛋白酶)的收获溶液，以使细胞与微载体剥离。随着收获溶液在容器11的内部隔室13中，可以用搅拌器18混合或搅拌生物反应器10中的流体和/或其他组分。

当从微载体中移除细胞时，在生物反应器10的容器11中形成了含有细胞的溶液。任选地，612的收获细胞还可以包括：在容器11中形成含有细胞的溶液。例如，形成含有细胞的溶液可以包括：加入缓冲液，例如收获缓冲液，其对细胞维持一定的环境(例如，pH条件)以保持对下游处理步骤(包括过滤、捕获和色谱操作)的可行性。又例如，所述缓冲液可以是制剂缓冲液，或者在从容器11移除细胞之后，允许细胞用于治疗应用的组合物。形成含有细胞的溶液还可以包括：将冷冻保护剂(cryprotectant)或用于保护细胞或细胞产物不受冷冻损伤的组合物加入到容器11中，以使得在从容器11移除细胞后，细胞可得到冷冻保护。

在612的收获细胞后，本文所述的细胞培养方法600可以进一步包括614：从容器11移除含有细胞的溶液。614的移除含有细胞的溶液包括：使所述溶液从容器11流动通过盖44a的过滤器210。过滤器210允许含有细胞的溶液通过过滤器210，同时将微载体保留在容器11中。如之前关于废培养基的移除和洗涤溶液的移除所述，可在维持微载体处于悬浮状态的同时，完成614的从容器11移除含有细胞的溶液。

根据本公开的方面(1)，提供了一种生物反应器。所述生物反应器包括具有壁的容器，所述壁至少部分限定用于容纳流体的内部隔室；至少一个端口；以及被构造成与所述至少一个端口可移除地接合的至少一个盖，所述至少一个盖包含过滤材料。

根据本公开的另一个方面(2)，提供了如方面(1)所述的生物反应器，其还包括设置在容器的内部隔室中的搅拌器。

根据本公开的另一个方面(3)，提供了如方面(1)-(2)中任一个方面所述的生物反应器，其中，所述至少一个端口包括外螺纹，其中，所述至少一个盖包括内螺纹，并且其中，所述至少一个盖的内螺纹被构造成与所述至少一个端口的外螺纹配合。

根据本公开的另一个方面(4)，提供了如方面(1)-(3)中任一个方面所述的生物反应器，其包括注塑聚合物。

根据本公开的另一个方面(5)，提供了如方面(1)-(4)中任一个方面所述的生物反应器，其中，所述过滤材料包括多孔材料，所述多孔材料的平均孔径在约1μm至约100μm之间。

根据本公开的另一个方面(6)，提供了如方面(1)-(5)中任一个方面所述的生物反应器，其中，所述至少一个盖包括在所述至少一个盖的顶部中的开口，其将过滤材料暴露于容器外部的环境。

根据本公开的另一个方面(7)，提供了如方面(1)-(6)中任一个方面所述的生物反应器，其中，所述至少一个盖包括设置在过滤材料上方的上支承板和设置在过滤材料下方的下支承板。

根据本公开的另一个方面(8)，提供了如方面(1)-(7)中任一个方面所述的生物反应器，其至少包括第一端口和第二端口。

根据本公开的另一个方面(9)，提供了如方面(8)所述的生物反应器，其至少还包括第一盖和第二盖，所述第一盖被构造成与第一端口可移除地接合，并且所述第二盖被构造成与第二端口可移除地接合。

根据本公开的另一个方面(10)，提供了如方面(9)所述的生物反应器，其中，第一盖包括过滤材料而第二盖不包括过滤材料。

根据本公开的另一个方面(11)，提供了如方面(8)-(9)中任一个方面所述的生物反应器，其中，所述第二盖包括通气口。

根据本公开的方面(12)，提供了一种细胞培养方法。所述细胞培养方法包括：将细胞和细胞生长培养基加入到生物反应器的容器中；将微载体加入到容器中以在微载体上形成显著融合的细胞；洗涤融合的细胞；收获融合的细胞以形成含有细胞的溶液；以及通过使溶液流过与生物反应器的至少一个端口可移除地接合的盖中的过滤材料，从所述容器移除含有细胞的溶液。

根据本公开的另一个方面(13)，提供了如方面(12)所述的细胞培养方法，其中，从容器移除含有细胞的溶液包括：维持微载体处于悬浮状态。

根据本公开的另一个方面(14)，提供了如方面(12)-(13)中任一个方面所述的细胞培养方法，其还包括：通过使培养基从容器通过盖的过滤材料，从容器移除废培养基。

根据本公开的另一个方面(15)，提供了如方面(14)所述的细胞培养方法，其还包括：将新鲜培养基加入到容器中。

根据本公开的另一个方面(16)，提供了如方面(12)-(15)中任一个方面所述的细胞培养方法，其中，洗涤融合的细胞包括：将包含磷酸盐缓冲液的洗涤溶液加入到容器中。

根据本公开的另一个方面(17)，提供了如方面(12)-(16)中任一个方面所述的细胞培养方法，其中，洗涤融合的细胞包括：搅拌容器的内容物。

根据本公开的另一个方面(18)，提供了如方面(12)-(17)中任一个方面所述的细胞培养方法，其中，收获融合的细胞包括：加入包含剥离剂的收获溶液。

根据本公开的另一个方面(19)，提供了如方面(18)所述的细胞培养方法，其中，所述剥离剂包括胰蛋白酶。

根据本公开的另一个方面(20)，提供了如方面(12)-(19)中任一个方面所述的细胞培养方法，其中，收获融合的细胞包括：搅拌容器的内容物。

根据本公开的另一个方面(21)，提供了如方面(12)-(20)中任一个方面所述的细胞培养方法，其中，所述微载体包括选自玻璃、塑料和水凝胶的材料。

根据本公开的另一个方面(22)，提供了如方面(12)-(21)中任一个方面所述的细胞培养方法，其中，所述微载体包括约100微米至约500微米的平均直径。

根据本公开的方面(23)，提供了如方面(12)-(22)中任一个方面所述的细胞培养方法，其中，所述过滤材料包括多孔材料，所述多孔材料的平均孔径在约1μm至约100μm之间。

尽管本公开包括有限数量的实施方式，但是本领域技术人员得益于本公开，会理解能设计出其他的实施方式而不偏离本公开的范围。