阅读说明：本技术 一种利用发酵乳杆菌和纤维素酶制备青贮苜蓿的方法 (Method for preparing ensiled alfalfa by using lactobacillus fermentum and cellulase ) 是由 钟瑾 苏日娜 骆爱群 杨小盼 刘亚勇 王天威 陶勇 张�杰 于 2019-01-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用发酵乳杆菌和纤维素酶制备青贮苜蓿的方法。本发明公开的制备青贮苜蓿的方法包括：向苜蓿鲜草中添加纤维素酶和发酵乳杆菌,得到混合物,将混合物进行贮存,实现苜蓿的青贮；纤维素酶的添加量为10<Sup>4</Sup>U/kg苜蓿鲜重；发酵乳杆菌的添加量为(10<Sup>5</Sup>-10<Sup>6</Sup>)cfu/g苜蓿鲜重。本发明的苜蓿的青贮方法能促进苜蓿青贮饲料中乳酸的积累,减少丁酸的生成,并且有效避免了干物质的损失,同时抑制了有害好氧微生物的增长,改善了青贮苜蓿的适口性,具有发酵效率高、操作简便、成本低廉的优点,可长期保存和延长青饲季节,充分合理利用苜蓿资源,促进苜蓿产业化发展,可广泛应用于优质苜蓿青贮饲料的制备生产中。(The invention discloses a method for preparing silage alfalfa by using lactobacillus fermentum and cellulase. The method for preparing the ensiled alfalfa, disclosed by the invention, comprises the following steps of: adding cellulase and lactobacillus fermentum into fresh alfalfa to obtain a mixture, and storing the mixture to realize ensiling of the alfalfa; the addition amount of cellulase is 10 4 U/kg fresh weight of alfalfa; the amount of Lactobacillus fermentum added was (10) 5 ‑10 6 ) cfu/g fresh weight of alfalfa. The alfalfa ensiling method can promote the accumulation of lactic acid in alfalfa ensiling feed, reduce the generation of butyric acid, effectively avoid the loss of dry matters, inhibit the growth of harmful aerobic microorganisms, improve the palatability of the alfalfa ensiling, have the advantages of high fermentation efficiency, simple and convenient operation and low cost, can preserve and prolong the ensiling season for a long time, fully and reasonably utilize alfalfa resources, promote the industrialized development of the alfalfa, and can be widely applied to the preparation and production of high-quality alfalfa ensiling feed.)

一种利用发酵乳杆菌和纤维素酶制备青贮苜蓿的方法

技术领域

本发明属于青贮饲料加工制备领域，一种利用发酵乳杆菌和纤维素酶制备青贮苜蓿的方法。

背景技术

苜蓿素有“牧草之王”的美誉，我国大部分地区均有栽培,属于多年生豆科牧草，富含粗蛋白质、矿物质、维生素等多种营养物质，饲用价值极高，常作为一种优质的粗饲料用于动物饲喂。目前，苜蓿饲草的主要利用形式是调制干草和半干草，但由于苜蓿收获季节多为降雨时期，苜蓿晾晒过程中发生雨淋、霉烂而养分损失较多，难以调制成优质的干草，这使苜蓿产业化发展遇到了瓶颈。青贮则不受天气恶劣等因素的制约，且可有效避免营养成分的损失，同时还可提高家畜的消化利用率，但由于苜蓿碳水化合物含量低、缓冲能值高，自然青贮难以调制优质青贮饲料。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何青贮苜蓿。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了苜蓿的青贮方法，所述方法包括：向苜蓿鲜草中添加纤维素酶和/或发酵乳杆菌，得到混合物，将所述混合物进行贮存，实现苜蓿的青贮。

上述方法中，所述纤维素酶的添加量可为10⁴U/kg苜蓿鲜重。

所述纤维素酶具体可为上海麦克林生化科技有限公司产品，酶活为10000U/g。

上述方法中，所述发酵乳杆菌的添加量可为(10⁵-10⁶)cfu/g苜蓿鲜重。

上述方法中，所述发酵乳杆菌可为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)17SD-2，所述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)17SD-2在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.15448。

上述方法还可包括在添加所述纤维素酶和/或所述发酵乳杆菌前切割所述苜蓿鲜草。

切割所述苜蓿鲜草可将所述苜蓿鲜草切成长度为2-3cm的草段。

上述方法中，所述苜蓿鲜草的含量水可为65-70％。

上述方法中，所述贮存可在密封条件下进行。

所述贮存可在真空条件下进行。

所述贮存具体可将所述混合物装入密封袋中然后对密封袋抽真空后实现。所述密封袋可为聚乙烯袋。

所述贮存可在15-30℃下进行。所述贮存具体可在23-27℃下进行，如25±2℃。

所述贮存的时间可为60天。

所述苜蓿可为紫花苜蓿(Medicago sativa.)。

所述苜蓿具体可为开花期的苜蓿。在本发明的一个实施例中，所述苜蓿为第二茬开花期的苜蓿。

利用所述苜蓿的青贮方法制备的青贮苜蓿，也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种成套试剂，所述成套试剂由所述纤维素酶和所述发酵乳杆菌组成。

所述成套试剂可用于苜蓿青贮，也可用于制备苜蓿饲料。

所述成套试剂中所述纤维素酶和所述发酵乳杆菌的配比可为10⁴U：(10⁸-10⁹)cfu。

本发明还提供了下述任一应用：

X1、所述苜蓿的青贮方法在制备苜蓿饲料中的应用；

X2、利用所述苜蓿的青贮方法制备的青贮苜蓿在制备苜蓿饲料中的应用；

X3、所述成套试剂在制备苜蓿饲料中的应用；

X4、所述成套试剂在苜蓿青贮中的应用。

本发明中，所述苜蓿饲料可为苜蓿青贮饲料。

本发明单独或组合利用发酵乳杆菌和纤维素酶实现高质量的苜蓿青贮，本发明中涉及的苜蓿青贮方法能促进苜蓿青贮饲料中乳酸的积累，减少丁酸的生成，并且有效避免了干物质的损失，同时抑制了酵母菌等有害好氧微生物的增长，改善了青贮苜蓿的适口性。本发明的苜蓿的青贮方法具有发酵效率高、操作简便、成本低廉的优点。本发明的苜蓿的青贮方法可长期保存和延长青饲季节，充分合理利用苜蓿资源，促进苜蓿产业化发展，可广泛应用于优质苜蓿青贮饲料的制备生产中。

生物材料保藏说明

生物材料的分类命名：发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)

生物材料的菌株编号：17SD-2

生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

生物材料的保藏单位简称：CGMCC

生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101

生物材料的保藏日期：2018年3月12日

生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.15448

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中纤维素酶为上海麦克林生化科技有限公司产品，酶活为10000U/g。

下述实施例中的发酵乳杆菌为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)17SD-2，该菌株于2018年3月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15448。

实施例1、苜蓿的青贮

一、苜蓿青贮

1、切割：将水分约为65-70％(质量百分比含量)，处于第二茬开花期的紫花苜蓿(Medicago sativa.)鲜草地上部分用鲜草用切割机切至2-3cm的长度，得到切割后的苜蓿；将切割后的苜蓿随机分为四组，即对照组、纤维素酶组、发酵乳杆菌组和纤维素酶+发酵乳杆菌组；

2、添加添加剂：向步骤1的各组切割后的苜蓿中按照如下方式添加添加剂：

对照组(CK组)：加入与处理组添加剂等体积的无菌水，水的添加量为1mL/kg。

纤维素酶组(CE组)：纤维素酶溶于水后添加至苜蓿中，纤维素酶的添加量为10⁴U/kg苜蓿鲜重。

发酵乳杆菌组(LF组)：利用水悬浮发酵乳杆菌后添加至苜蓿中，发酵乳杆菌的添加量为10⁵cfu/g苜蓿鲜重。

纤维素酶+发酵乳杆菌组(CE+LF组)：向水中添加纤维素酶和发酵乳杆菌，得到混合液，将得到的混合液添加至苜蓿中，纤维素酶的添加量为10⁴U/kg苜蓿鲜重，发酵乳杆菌的添加量为10⁵cfu/g苜蓿鲜重。

各组中水的添加量均相等。

3、贮存：步骤2完成后，将各组中苜蓿和添加剂充分混匀后得到混合物，将混合物装入聚乙烯袋，每袋装混合物500g，每组设置三个重复，用真空封口机抽真空并密封，室温(25±2℃)贮存60天，得到青贮苜蓿。

二、青贮苜蓿发酵品质及干物质(DM)变化分析

步骤一完成后，将各组青贮苜蓿用无菌的镊子随机取10g作为待测样品，每组取三个样品，按照如下方法检测有机酸含量：

向10g待测样品中加入90ml无菌生理盐水，浸泡30min，每隔10min充分震荡混匀，浸泡过后，将用四层纱布过滤，收集滤液，用pH酸度计测滤液的pH值。将以上滤液于4℃，10000rpm离心15min，收集上清液，取上述上清液过0.22μM微膜过滤孔过滤，收集滤液，采用HPLC分析检测滤液中有机酸的构成比例及含量。所用仪器为Agilent 1260型高效色谱仪，检测条件为：Bio-RAD HPX-87H柱，0.5mM H₂SO₄水溶液为流动相,0.6mL/min流速,柱温40℃,检测器RID，检测波长为210nm。标准品为乳酸及丁酸，均为上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品)。检测结束后，计算得到待测样品中各有机酸的含量，结果如表1所示。

干物质含量则通过称取待测样品置于恒温鼓风干燥机中，65℃烘干48小时后，称量其重量，即为干物质重量。

待测样品的干物质含量、pH及有机酸含量见表1。

表1苜蓿青贮60天后发酵品质和干物质变化比较

注：表1中，FW，待测样品鲜重；g·kg^-1DM表示每千克干物质中有机酸的克数；每列中标相同小写字母的数据间无显著差异，标不同小写字母的数据间有显著差异。

结果显示，与苜蓿单独青贮(对照组)相比，LF组、CE组和CE+LF组中，pH值均急剧下降、乳酸含量显著上升且有效降低了丁酸的产生，从而改善了苜蓿青贮的发酵品质，提高了适口性。另外LF组、CE组和CE+LF组的干物质含量均显著高于对照组。表明，单独或组合添加发酵乳杆菌和纤维素酶，能够显著改善苜蓿青贮发酵品质，避免了干物质的损失且有效提高了苜蓿青贮适口性。

三、青贮苜蓿可培养微生物分析

步骤一完成后，将各组青贮苜蓿用无菌的镊子随机取25g作为待测样品，每组取三个样品，按照如下方法分析可培养微生物：

取待测样品25g与225ml无菌生理盐水混合震荡后，另无菌生理盐水10倍梯度法进行稀释，分别得到稀释10、10²、10³、10⁴、10⁵和10⁶倍的稀释液，将各稀释液分别涂布于MRS(deMan Rogosa Sharpe,OXOID CM1175)琼脂培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PotatoDextrose Agar,OXOID CM1139)上，每种培养基均涂布100μl。涂菌后，在无菌条件下，将MRS琼脂培养基置于37℃下厌氧培养3d，将马铃薯葡萄糖琼脂培养基于30℃下恒温培养2d。培养结束后，MRS琼脂培养基中的微生物为乳酸菌，马铃薯葡萄糖琼脂培养基中的微生物为酵母菌和霉菌，统计可培养微生物数量，结果如表2所示。

表2苜蓿青贮60天后可培养微生物数量比较

注：表2中，log cfu/g FM^-1表示每克待测物质中检测到的活性微生物数量的Lg值，底数为10；LAB表示乳酸菌；Yeast表示酵母菌；Mold表示霉菌；ND表示未检测到相应微生物；每列中标相同小写字母的数据间无显著差异，标不同小写字母的数据间有显著差异。

结果显示，与苜蓿单独青贮(对照组)相比，添加发酵乳杆菌、纤维素酶或发酵乳杆菌和纤维素酶组合后青贮能够使苜蓿青贮乳酸菌数量显著增加，有利于保持青贮酸性环境，并抑制了酵母菌等有害好氧微生物的增长，有利于提高青贮有氧稳定性。

实施例2、苜蓿的青贮

一、苜蓿青贮

1、切割：按照实施例1中步骤一的1的方法进行。

2、添加添加剂：向步骤1的各组切割后的苜蓿中按照如下方式添加添加剂：

对照组：加入与处理组添加剂等体积的无菌水，水的添加量为1mL/kg。

纤维素酶组：纤维素酶溶于水后添加至苜蓿中，纤维素酶的添加量为10⁴U/kg苜蓿鲜重。

发酵乳杆菌组：利用水悬浮发酵乳杆菌后添加至苜蓿中，发酵乳杆菌的添加量为10⁶cfu/g苜蓿鲜重。

纤维素酶+发酵乳杆菌组：向水中添加纤维素酶和发酵乳杆菌，得到混合液，将得到的混合液添加至苜蓿中，纤维素酶的添加量为10⁴U/kg苜蓿鲜重，发酵乳杆菌的添加量为10⁶cfu/g苜蓿鲜重。

各组中水的添加量均相等。

3、贮存：按照实施例1中步骤一的3的方法进行。

二、青贮苜蓿发酵品质及干物质(DM)变化分析

按照实施例1中步骤二的方法进行。

结果显示，与苜蓿单独青贮(对照组)相比，单独或组合添加发酵乳杆菌和纤维素酶后青贮能够使苜蓿青贮pH值急剧下降，乳酸含量显著上升，有效降低了丁酸的产生，且这三组的干物质显著高于对照组，表明单独或组合添加发酵乳杆菌和纤维素酶能够显著改善苜蓿青贮发酵品质，避免了干物质的损失。

三、青贮苜蓿可培养微生物分析

按照实施例1中步骤三的方法进行。

结果显示，与苜蓿单独青贮(对照组)相比，添加发酵乳杆菌、纤维素酶或发酵乳杆菌和纤维素酶组合青贮能够使苜蓿青贮乳酸菌数量增加，有利于保持青贮酸性环境，并抑制了酵母菌和霉菌等有害好氧微生物的增长。