阅读说明：本技术 一种冻害芦苇草青贮方法及制备的青贮饲料 (Method for ensiling reed grass in freezing damage and ensiling feed prepared by method ) 是由 李平 陈良寅 白史且 苟文龙 肖冰雪 游明鸿 张玉 李达旭 于 2019-11-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种冻害芦苇草青贮方法,包括采摘芦苇草得到霜冻损坏的原料草料、分别切段混合均匀得到青贮材料及分份装袋抽真空继而青贮三个步骤。本发明还提供了一种该方法制备的青贮饲料,还提供了一种检测RCG鲜样及青贮饲料的方法,最后还提供了一种描述RCG鲜样及青贮饲料细菌生态学的下一代测序技术。本发明描述了在青藏高原上无外源条件下制备的霜冻RCG青贮饲料的青贮特征和细菌群落,从而进一步改善和控制青贮发酵工艺,实现较好的、稳定的青贮发酵过程,提高了青藏高原霜冻损坏芦苇草的利用率。(The invention discloses a method for ensiling freezing injury reed grass, which comprises the three steps of picking reed grass to obtain frost damaged raw material forage, respectively cutting and uniformly mixing to obtain ensiling material, bagging in parts, vacuumizing and then ensiling. The invention also provides the silage prepared by the method, a method for detecting the RCG fresh sample and the silage, and finally a next generation sequencing technology for describing the ecology of the RCG fresh sample and the silage bacteria. The invention describes the ensiling characteristics and bacterial community of the frost RCG ensilage prepared on the Qinghai-Tibet plateau without external sources, thereby further improving and controlling the ensilage fermentation process, realizing a better and stable ensilage fermentation process and improving the utilization rate of the frost damage to the reed grass on the Qinghai-Tibet plateau.)

一种冻害芦苇草青贮方法及制备的青贮饲料

技术领域

本发明属于青贮技术领域，特别涉及一种冻害芦苇草青贮方法，本发明还提供了一种该方法制备的青贮饲料。

背景技术

青藏高原，大约70％是高海拔、寒冷的牧场，由于天然、极端、不稳定的气候和自然环境，很少有农作物适合种植。其中一种替代作物是芦苇草，例如虉草(Phalarisarundinacea L.)，这是一种高产的冷季草种，比该地区的燕麦和其他当地草更具生产力。由于恶劣的天气条件和放牧的管理不善，当环境温度低于0℃，并且持续4到5个小时，芦苇草的茎和叶就会发生冻害，导致其营养物质迅速减少。霜冻损坏的芦苇草(Reed CanaryGrass，RCG)通常可用作当地动物饲料成分，尤其适用于冬季和早春的牦牛。目前对芦苇草的研究是在夏季其最佳生长季节进行的，很少有关于霜冻后收获的RCG的青贮发酵的研究。

此外，在过去的几十年中，青贮饲料的微生物群主要通过基于培养的技术和基于PCR的Sanger测序技术检测。目前几乎没有对冻害后收获的RCG青贮前后菌群的研究。

发明内容

本发明的主要目的是针对上述现有技术的空白，研究在青藏高原上无外源条件下制备的霜冻RCG青贮饲料的青贮特征和细菌群落，从而进一步改善青贮发酵工艺，提高芦苇草利用率，本发明所述冻害芦苇草青贮方法，分析了各因素对其青贮效果的影响，从而更好控制各参数，实现较好的青贮发酵过程。同时，本发明还提供了一种该方法制备的青贮饲料，其品质稳定，各种有益成分含量较高。本发明还提供了一种检测RCG鲜样及青贮饲料的方法。本发明还提供了一种描述RCG鲜样及青贮饲料细菌生态学的下一代测序技术。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种冻害芦苇草青贮方法，包括以下步骤：

(1)9月份连续三个夜晚环境温度低于0℃时，在第四天早上立即手工采摘芦苇草，得到霜冻损坏的原料草料；

(2)将原料草料分成叶片和叶鞘L、茎S及整株作物W，将L、S和W分别切段，混合均匀，得到青贮材料；

(3)将青贮材料按约1.0kg/份分份，放入聚酯袋中，抽真空，然后在环境温度低于20℃的环境下青贮160-200天。

进一步的，所述步骤(1)所述环境为青藏高原，所述芦苇草是在8月已收获种子的无种子芦苇草。

RCG在8月种子收获后持续绿化，种子由于其特殊结构和成分，如不采摘分离，将会影响青贮发酵。

所述步骤(2)中切断为切成0.5-1.0cm的段。

实验证实，0.5-1.0cm的段将最有利于青贮发酵。太长将引起太多的空隙，不利于厌氧反应，太短将引起青贮材料过于致密，发酵不完全或部分腐烂。

所述步骤(3)是在环境温度低于20℃的9月至次年3月青贮180天。

一般在青藏高原地区，9月至次年3月环境温度会较低，青贮180较适宜。

本发明充分利用我国西部地区高原、寒冷的自然环境，可在当地进行大规模生产。主要应用当地自然的微生物菌落发酵。植物乳杆菌被广泛地应用在青贮饲料中，它可以迅速增加乳酸的含量以降低青贮饲料的pH值。但在实际生产中，用于加快青贮饲料发酵的外源细菌菌种含有一种或多种乳酸菌，有可能导致在青贮过程中外源菌抑制了原有菌而占主导地位，改变微生物群落结构，增加发酵的不稳定因素。本发明所述技术关注本地环境原有菌种对寒冷地区特殊作物品种及特殊条件下青贮饲料的发酵特性和有氧稳定性的影响。

本发明还提供了：

一种所述冻害芦苇草青贮方法制备的青贮饲料。

对于原料的检测显示，冻害前后芦苇草的化学成分变化不大，茎干具有最高的水溶性碳水化合物(WSC)和总生物碱(TA)含量，而叶子表现出相反的趋势，其干物质(DM)，中性洗涤纤维(NDF)含量最低。发酵过程要做一定监控，避免低含量的有益菌种数和高含量的不良微生物(包括好氧细菌，酵母和霉菌)分布在植物上。频繁的霜冻可以破坏植物细胞并释放可利用的底物以快速繁殖植物微生物组。

青贮后WSC含量降低，而青贮后叶的NDF含量增加，这是由于在厌氧条件下植物本身存在的和外源微生物将大量可利用的底物转化为代谢(主要是有机酸，如乳酸和乙酸)。单宁的存在被认为是有利的组分，因为它们通过抑制植物和微生物酶和/或通过与蛋白质形成复合物来保护饲料蛋白质免于降解。青贮后剩余的总单宁持续相对较高的水平。

本发明还提供了一种检测RCG鲜样及青贮饲料的方法，并且还提供了一种描述鲜样及制备的青贮饲料细菌生态学的下一代测序技术(NGS)。目的是研究在青海、青藏高原等地区无外源(或有外源)条件下芦苇草青贮的特征和细菌群落等指标。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供一种冻害芦苇草青贮方法，针对现有技术中存在的问题，实验并研究了在青藏高原上无外源条件下制备的霜冻RCG青贮饲料的青贮特征和细菌群落，从而进一步改善和控制青贮发酵工艺，实现较好的青贮发酵过程。本发明还提供了一种该方法制备的青贮饲料，其品质稳定，各种有益成分含量较高。本发明还提供了一种检测RCG鲜样及青贮饲料的方法。本发明还提供了一种描述RCG鲜样及青贮饲料细菌生态学的下一代测序技术。目前，本发明所述方法已在西部高原地区扩大规模生产，其发酵过程稳定，产率较高，在较自然的环境下，提高了青藏高原霜冻损坏的芦苇草的利用率。

附图说明

图1是本发明实施例1-3中青贮前后环境温度示意图；

图2是本发明检测例1中在属水平上的细菌相对丰富度图；

图3是本发明检测例1中鲜样和青贮过的RCG乳酸菌属图；

图4是本发明检测例1中鲜样和青贮过的RCG片球菌属图；

图5是本发明检测例1中鲜样和青贮过的RCG魏斯特菌属图；

图6是本发明检测例1中鲜样和青贮过的RCG丁酸菌图；

图7是本发明检测例1中鲜样和青贮过的RCG的群落组成分析图；

图8是本发明检测例1中鲜样和青贮过的RCG的pH和发酵产物影响下的细菌群落组成图；

图9是本发明检测例2中在属水平上的细菌相对丰富度图；

图10是本发明检测例2中鲜样和青贮过的RCG乳酸菌属图；

图11是本发明检测例2中鲜样和青贮过的RCG片球菌属图；

图12是本发明检测例2中鲜样和青贮过的RCG魏斯特菌属图；

图13是本发明检测例2中鲜样和青贮过的RCG丁酸菌图；

图14是本发明检测例2中鲜样和青贮过的RCG的群落组成分析图；

图15是本发明检测例2中鲜样和青贮过的RCG的pH和发酵产物影响下的细菌群落组成图；

图16是本发明检测例3中在属水平上的细菌相对丰富度图；

图17是本发明检测例3中鲜样和青贮过的RCG乳酸菌属图；

图18是本发明检测例3中鲜样和青贮过的RCG片球菌属图；

图19是本发明检测例3中鲜样和青贮过的RCG魏斯特菌属图；

图20是本发明检测例3中鲜样和青贮过的RCG丁酸菌图；

图21是本发明检测例3中鲜样和青贮过的RCG的群落组成分析图；

图22是本发明检测例3中鲜样和青贮过的RCG的pH和发酵产物影响下的细菌群落组成图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。

但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。

实施例1

本实施例为冻害芦苇草青贮方法实施例，原料品种为虉草。

一种冻害芦苇草青贮方法，包括以下步骤：

(1)9月份青藏高原连续三个夜晚环境温度低于0℃时，在第四天早上立即手工采摘在8月已收获种子的无种子芦苇草，得到霜冻损坏的原料草料；

(2)将原料草料分成叶片和叶鞘L、茎S及整个作物W，将L、S和W分别切成0.5-1.0cm的段，混合均匀，得到青贮材料；

(3)将青贮材料按约1.0kg/份分份，放入聚酯袋中，抽真空，然后在环境温度低于20℃的环境下青贮160天。

环境温度条件如图1所示。

得到以上冻害芦苇草青贮方法制备的青贮饲料A。

实施例2

本实施例为冻害芦苇草青贮方法实施例，原料品种为虉草。

一种冻害芦苇草青贮方法，包括以下步骤：

(1)9月份青藏高原连续三个夜晚环境温度低于0℃时，在第四天早上立即手工采摘在8月已收获种子的无种子芦苇草，得到霜冻损坏的原料草料；

(2)将原料草料分成叶片和叶鞘L、茎S及整个作物W，将L、S和W分别切成0.5-1.0cm的段，混合均匀，得到青贮材料；

(3)将青贮材料按约1.0kg/份分份，放入聚酯袋中，抽真空，然后在环境温度低于20℃的环境下青贮200天。

环境温度条件如图1所示。

得到以上冻害芦苇草青贮方法制备的青贮饲料B。

实施例3

本实施例为冻害芦苇草青贮方法实施例，原料品种为虉草。

一种冻害芦苇草青贮方法，包括以下步骤：

(1)9月份青藏高原连续三个夜晚环境温度低于0℃时，在第四天早上立即手工采摘在8月已收获种子的无种子芦苇草，得到霜冻损坏的原料草料；

(2)将原料草料分成叶片和叶鞘L、茎S及整个作物W，将L、S和W分别切成0.5-1.0cm的段，混合均匀，得到青贮材料；

(3)将青贮材料按约1.0kg/份分份，放入聚酯袋中，抽真空，然后在环境温度低于20℃的9月至次年3月青贮180天。

环境温度条件如图1所示。

得到以上冻害芦苇草青贮方法制备的青贮饲料C。

实施例4

一种检测RCG鲜样及青贮饲料的方法，对青贮之前的新鲜牧草(RCG)和青贮之后的青贮饲料进行取样，将每个叶鞘L、茎S及整个作物W样品再分别分成四个相等的子样品，分别用于分析化学组成、pH和氨-N(g/kg总氮)和发酵产物、微生物种群及细菌多样性，最后进行统计分析：

(1)化学分析

将样品在105℃下干燥至恒重，然后通过0.60mm筛研磨以进行化学组成分析。通过凯氏定氮法(AOAC，1990)测定粗蛋白，并通过Kjeldal N×6.25的公式计算。中性洗涤纤维(NDF)通过(Van Soest等，1991)的方法使用Ankom2000纤维分析仪(Ankom Technology，Fairport，NY)测定。WSC由McDonald&Henderson(1964)的方法决定。使用炸弹量热计(Parr630，Parr Instrument Co.，Moline，Illinois，USA)测量醚提取物(EE)。通过(Jones和Kinghorn，2006)的方法从乙醇提取物中提取总生物碱。

(2)pH、氨-N(g/kg总氮)和发酵产品的分析

在Stomacher搅拌器中将20g样品与180mL超纯水混合3分钟。通过pH计测定滤液的pH。将约10mL的滤液离心(4500×g，15分钟，4℃)，并使用高效液相色谱法和气相色谱法分析上清液中的乳酸，乙酸，丙酸，丁酸和乙醇。由(Li等人，2017)描述。氨氮(NH 3-N)通过(Broderick和Kang，1980)的方法测定。

(3)微生物种群分析

使用(Cai 8et al。，1999)的方法测定样品上的微生物群体。将10克每种样品放入无菌玻璃瓶中，悬浮在90mL无菌水中，并在实验室混合器(LB20ES，Shanghai PrimeScience Co.，Ltd，Shanghai，China)中均化2小时。进行10-3至10-5的系列稀释。外源菌种(如有)的数量计数MRS琼脂(GCM188，Land Bridge Technology Co.，Ltd，Beijing，China)在厌氧条件下于37℃温育48小时(厌氧箱；TEHER Hard Anaerobox，ANX-1；Hirosawa Ltd，Tokyo，日本)。在营养琼脂(CM107，Land Bridge Technology Co.，Ltd，Beijing，China)上计数需氧细菌，在30℃下孵育24小时。用1.5mg/L四环素(CM173，Land Bridge TechnologyCo.，Ltd，Beijing，China)在麦芽提取物琼脂上计数霉菌和酵母，在28℃下孵育48小时。通过菌落外观和细胞形态观察将酵母与霉菌区分开来。

(4)描述样品细菌生态学

使用下一代测序方法描述新鲜样品及制备的青贮饲料细菌生态学。

(5)统计分析

对于3(馏分)×3(空白)因子排列，对样品数据进行双向ANOVA。通过Tukey的学生化范围测试确定平均值之间的显著差异，其中P<0.05被指定为显著。使用SPSS 19.0程序(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)进行这些分析。

实施例5

本实施例为描述RCG新鲜样品及制备的青贮饲料细菌生态学的下一代测序方法。通过该方法测定从样品中提取的细菌DNA。

一种描述霜冻损坏的芦苇草(RCG)鲜样及青贮饲料细菌生态学的下一代测序方法：

使用

High-Fidelity PCR Master Mix(New England Biolabs)进行PCR反应，选择引物515F(5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3')和907R(5'2-TTACCGCGGCTGCTGGC-3')以扩增16S rRNA基因，通过Qiagen Gel Extraction Kit(Qiagen，Germany)纯化PCR产物，然后使用配对末端(250bp)测序，用Illumina HiMiSeq PE2500平台在Novogene Company测序；弃去它们的条形码和引物以获得高质量的序列；测序后，Trimmomatic用于处理原始序列，PE读数与FLASH(V 1.2.7)重叠以组装最终的V4-V5标签序列，V4-V5区域是最佳的测序区域，造成的基因组内异质性最小；有效标签由Uchime(版本4.2.40)方法制作；在Usearch软件平台(版本7.1)上采用向上方法将操作分类单元(OTU)分配给截止水平为3％的16SrRNA；基于OTU结果，使用QIIME(版本1.7.0)计算α和β多样性指数，并用R软件(版本2.15.3)显示，非度量多维缩放(NMDS)分析和典型对应分析(CCA)均由R软件(版本2.15.3)显示。

检测例1

本检测例为按照实施例4和5中所述方法检测实施例1中鲜样及青贮饲料A的检测例。

(1)化学分析

未处理过(鲜样)的RCG的化学和微生物组成：表1-1

青贮过的RCG的化学和微生物组成：表1-2

(2)pH、氨-N(g/kg总氮)和发酵产品的分析

见下表1-3

(3)微生物种群分析

见下表1-4

(4)下一代测序方法描述样品细菌生态学

(5)统计分析

结果见图2-图8。

检测例2

本检测例为按照实施例4和5中所述方法检测实施例2中鲜样及青贮饲料B的检测例。

(1)化学分析

未处理过(鲜样)的RCG的化学和微生物组成：表2-1

青贮过的RCG的化学和微生物组成：表2-2

(2)pH、氨-N(g/kg总氮)和发酵产品的分析

见下表2-3

(3)微生物种群分析

见下表2-4

(4)下一代测序方法描述样品细菌生态学

(5)统计分析

结果见图9-图15。

检测例3

本检测例为按照实施例4和5中所述方法检测实施例3中鲜样及青贮饲料C的检测例。

(1)化学分析

未处理过(鲜样)的RCG的化学和微生物组成：表3-1

青贮过的RCG的化学和微生物组成：表3-2

(2)pH、氨-N(g/kg总氮)和发酵产品的分析

见下表3-3

(3)微生物种群分析

见下表3-4

(4)下一代测序方法描述样品细菌生态学

(5)统计分析

结果见图16-图22。

综上，本发明提供了一种对霜冻损坏的芦苇草(冻害芦苇草，RCG)的青贮发酵工艺，并研究了在青藏高原上无外源条件下制备的霜冻RCG青贮饲料的青贮特征和细菌群落，从而进一步改善和控制青贮发酵工艺，在较自然的环境下，提高了青藏高原霜冻损坏的芦苇草的利用率，实现较好的青贮发酵过程。同时，本发明还提供了一种该方法制备的青贮饲料，其品质稳定，各种有益成分含量较高。此外，本发明还提供了一种检测RCG鲜样及青贮饲料的方法。最后，本发明还提供了一种描述RCG鲜样及青贮饲料细菌生态学的下一代测序技术。