一种人AD7c-NTP单克隆抗体及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种人AD7c-NTP单克隆抗体及其制备方法和应用 (Human AD7c-NTP monoclonal antibody and preparation method and application thereof ) 是由 赵风强 董兵 杨春 吴妤 邬晓东 于 2020-02-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种人AD7c-NTP单克隆抗体及其制备方法和应用,通过以下步骤制备：以AD7c-NTP重组蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,再进行小鼠脾细胞和鼠骨髓瘤细胞融合及亚克隆,筛选特异性、效价高的单克隆抗体,最后腹水制备及纯化,获得抗人AD7c-NTP蛋白的单克隆抗体。本发明与现有的技术相比的优点在于：本发明提供了可产生抗人AD7c-NTP单克隆抗体的杂交瘤细胞株I1B10和杂交瘤细胞株X1C11,以及抗人AD7c-NTP单克隆抗体I1B10和X1C11,该抗体对可通过双抗体夹心法对人体液中AD7c-NTP浓度进行检测,具有重要的应用前景。(The invention discloses a human AD7C-NTP monoclonal antibody and a preparation method and application thereof, and the monoclonal antibody is prepared by the following steps of immunizing a BA L B/C mouse by taking AD7C-NTP recombinant protein as immunogen, then carrying out fusion and subcloning of mouse spleen cells and mouse myeloma cells, screening the monoclonal antibody with high specificity and potency, and finally preparing and purifying ascites to obtain the monoclonal antibody resisting human AD7C-NTP protein.)
技术领域
本发明涉及单克隆抗体制备领域，具体是一种人AD7c-NTP单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种神经退行性疾病，以智力功能受损和失忆的慢性 恶化过程为特征。2001年，全世界有1100万人患有阿尔茨海默病(Gadit,2001)。到2005年，全世界有 2420万人患有老年痴呆[Reitz C,2011]；2010年，这一数字增至3600万，到2030年将增至6600万， 到2050年将增至1.15～1.35亿[The Global Impactof Dementia 2013–2050]。目前，阿尔茨海默病成 为第六主要死因(AA,2012)。阿尔茨海默病在所有痴呆症患者中约占70％。最新的诊断指南将阿尔茨海默 病分为三个阶段：痴呆阶段；有症状，痴呆前期(又称轻度认知障碍)和无症状，临床前阶段[Jack CR, 2011]。目前仍没有有效的治疗方法来预防、制止或逆转阿尔茨海默病；AD的唯一有效的治疗方法是延缓或减轻症状[Huang Y,2012]。因此，AD的早期诊断至关重要。
神经元丝状蛋白(Neuronal thread protein,NTP)是一类跨膜磷酸化蛋白，可诱导神经元凋亡和线粒 体功能障碍[De la Monte SM,2001]；NTP在神经元细胞增殖、分化、脑发育和AD神经元退变过程中表达 增加[De la Monte SM,1997]。
AD7c-NTP是NTP家族中的一个成员，是由Suzanne M.de la Monte等首次从AD晚期患者的颞叶中分 离出一个新的包含Alu序列cDNA，被命名为AD7c-NTP，其序列全长为1442bp，含有1125个核苷酸组成的 ORF，可编码含375个氨基酸的成熟蛋白，分子质量约为41kD，等电点为9.89[Monet SM,et al.1997]。 2004,桂俊豪等利用生物信息学方法发现AD7c-NTP基因定位于lp36.11的负链上，无内含子序列，编码 产物可能存在3个跨膜区。
Ghanbari H等采用免疫学方法对AD疑似患者脑脊液(CSF)或尿液中的AD7c-NTP蛋白含量进行检测 有助于AD的早期诊断和鉴别诊断。De la Monte SM等研究发现AD7c-NTP基因的异常表达与AD型痴呆的 典型细胞表型密切相关。AD7c-NTP可能是一种新的、具有重要临床应用价值的AD早期诊断的生物标记物 [De la Monte SM,2002&Neugroschl J,2002]。因此，开发用于临床诊断的AD7c-NTP抗原检测试剂盒 具有重要的意义。
2007年，盛树立等通过设计、合成AD7c-NTP抗原决定簇多肽片段，制备多克隆抗体，用于开发AD7c-NTP 体外诊断试剂盒；杨永芳(2015)等同样通过设计、合成AD7c-NTP抗原表位多肽，制备鼠单克隆抗体， 并用于开发AD7c-NTP体外诊断试剂盒。然而，市面上AD7c-NTP体外诊断试剂盒在临床应用时反馈率较高， 且与临床症状符合率不高，且临床操作不便、反应时间较长。因而，急需开发特异性更好、与临床符合率 更高、操作方便、快捷的AD7c-NTP体外诊断试剂盒。
AD7c-NTP体外诊断试剂盒中最核心的组分是抗AD7c-NTP抗体原料。由于AD7c-NTP在人体脑脊液及尿 液中含量甚微，很难获得天然蛋白。国内AD7c-NTP体外诊断试剂盒多数是基于AD7c-NTP多肽抗原开发的、 其灵敏度及特异性不足，因而获得高亲和力、高特异性抗AD7c-NTP抗体是成功研制AD7c-NTP体外诊断试 剂盒的关键。AD7c-NTP是一种膜蛋白，结构比较复杂，目前还未见报道通过DNA重组技术获得大量AD7c-NTP 蛋白抗原，制备抗AD7c-NTP单克隆抗体，研制AD7c-NTP体外诊断试剂盒。
所以，本发明利用DNA重组技术，合成AD7c-NTP全长基因，构建至原核表达载体，通过优化发酵、 纯化及复性工艺，体外获得了大量AD7c-NTP蛋白；并成功研制了高亲和力、高特异性抗AD7c-NTP单克隆 抗体；并以此为基础开发便捷、快速的AD7c-NTP蛋白诊断方法及其诊断试剂，通过检测脑脊液和尿液、 血清中AD7c-NTP含量可作为AD患者的早期筛查，以达到AD患者的早期诊断。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是克服以上的技术缺陷，提供一种与人AD7c-NTP蛋白特异性结合的抗体， 该抗体为单克隆抗体。
为了解决上述问题，本发明的技术方案为：一种抗人AD7c-NTP蛋白的单克隆抗体的制备方法，通过 以下步骤制备：以AD7c-NTP重组蛋白为免疫原，免疫BALB/c小鼠，再进行小鼠脾细胞和鼠骨髓瘤细胞融 合及亚克隆，筛选特异性、效价高的单克隆抗体，最后腹水制备及纯化，获得抗人AD7c-NTP蛋白的单克 隆抗体。
作为改进，所述AD7c-NTP重组蛋白具有SEQ ID NO.1序列，其制备方法如下：将人AD7c-NTP基因(SEQ ID NO.2)插入表达载体pET30a，构建pET30a-AD7c-NTP融合表达质粒，转化大肠杆菌，然后用IPTG诱导， 纯化、复性得到人AD7c-NTP重组蛋白。
作为改进，BALB/c小鼠为8-12周龄雌性小鼠。
作为改进，抗人AD7c-NTP单克隆抗体是采用ELISA法(酶联免疫吸附试验)高通量筛选获得的。
作为改进，纯化方法为Protein A亲和纯化。
一种抗人AD7c-NTP蛋白的单克隆抗体，所述抗人AD7c-NTP蛋白的单克隆抗体如上述制备方法制备得 到。
一种AD7c-NTP抗体对筛选方法，采用棋盘滴定法进行AD7c-NTP抗原检测，选择灵敏度及特异性较好 的配对抗体。
一种AD7c-NTP浓度的检测方法，通过鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体I1B10和鼠抗人AD7c-NTP单克隆 抗体X1C11可基于免疫方法对人体组织、细胞或体液中AD7c-NTP浓度进行检测，优选对尿液样本中的人 AD7c-NTP进行检测。
作为改进，所述体液包括尿液、脑脊液、血清或血液。
本发明与现有的技术相比的优点在于：
提供了可产生抗人AD7c-NTP单克隆抗体的杂交瘤细胞株I1B10和杂交瘤细胞株X1C11，以及抗人 AD7c-NTP单克隆抗体I1B10和X1C11，该抗体对可通过双抗体夹心法对人体液中AD7c-NTP浓度进行检测， 具有重要的应用前景。
本发明提供了一种人AD7c-NTP体外重组蛋白的表达与纯化方法，解决了人AD7c-NTP蛋白体外不易获 得，且不稳定的问题，而且，利用人AD7c-NTP重组蛋白免疫动物，可制备更加广谱抗AD7c-NTP抗体，尤 其可制备亲和力、特异性更好的鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体，此外，采用抗人AD7c-NTP单克隆抗体I1B10 和X1C11，建立人AD7c-NTP蛋白检测ELISA方法，实现了检测的高灵敏度(0.3ng/ml)和特异性，最后， 可以快速、准确地测定尿液中人AD7c-NTP蛋白的含量，对于AD患者的早期诊断、早期治疗提供可靠的临 床参考价值。
附图说明
图1是重组质粒pET30a-AD7c-NTP小样诱导表达SDS-PAGE鉴定结果图。
图2是人AD7c-NTP重组蛋白纯化及复性后SDS-PAGE鉴定结果图。
图3是人AD7c-NTP抗原ELISA检测方法线性及灵敏度图。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。在本发明的范围内或者在 不脱离本发明的内容、精神和范围内，对本发明进行的变更、组合或替换，对于本领域的技术人员来说是 显而易见的，且包含在本发明的范围之内。
一种抗人AD7c-NTP蛋白的单克隆抗体的制备方法，通过以下步骤制备：以AD7c-NTP重组蛋白为免疫 原，免疫BALB/c小鼠，再进行小鼠脾细胞和鼠骨髓瘤细胞融合及亚克隆，筛选特异性、效价高的单克隆 抗体，最后腹水制备及纯化，获得抗人AD7c-NTP蛋白的单克隆抗体。
所述AD7c-NTP重组蛋白具有SEQ ID NO.1序列，其制备方法如下：将人AD7c-NTP基因(SEQ ID NO.2) 插入表达载体pET30a，构建pET30a-AD7c-NTP融合表达质粒，转化大肠杆菌，然后用IPTG诱导，纯化、 复性得到人AD7c-NTP重组蛋白，BALB/c小鼠为8-12周龄雌性小鼠，抗人AD7c-NTP单克隆抗体是采用ELISA 法(酶联免疫吸附试验)高通量筛选获得的，纯化方法为Protein A亲和纯化。
一种抗人AD7c-NTP蛋白的单克隆抗体，所述抗人AD7c-NTP蛋白的单克隆抗体如上述制备方法制备得 到。
一种AD7c-NTP抗体对筛选方法，采用棋盘滴定法进行AD7c-NTP抗原检测，选择灵敏度及特异性较好 的配对抗体。
一种AD7c-NTP浓度的检测方法，通过鼠抗人AD7c-NTP单克隆抗体I1B10和鼠抗人AD7c-NTP单克隆 抗体X1C11可基于免疫方法对人体组织、细胞或体液中AD7c-NTP浓度进行检测，优选对尿液样本中的人 AD7c-NTP进行检测，所述体液包括尿液、脑脊液、血清或血液。
实施例一：人AD7c-NTP重组蛋白的制备
(1)、人AD7c-NTP原核表达载体的构建
人工合成人AD7c-NTP基因序列SEQ ID NO.2，将其插入至经NdeI和XhoI双酶切的原核表达质粒pET30a 中，并转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)。0.1g/L卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆，并用终浓度为1mM IPTG 进行诱导，诱导温度分别为16℃、25℃、30℃、37℃诱导，优选的是25℃诱导，200rpm振荡培养14h诱 导人AD7c-NTP重组蛋白表达。最后经SDS-PAGE鉴定，结果如图1.所示。
注：M：预染蛋白Marker，泳道1-3分别为诱导前pET30a-AD7c-NTP菌液、诱导后pET30a-AD7c-NTP 菌液超声上清、诱导后pET30a-AD7c-NTP菌液超声后沉淀。
(2)、pET30a-AD7c-NTP融合蛋白的表达
将鉴定正确的pET30a-AD7c-NTP菌种转接至含100ug/ml卡那霉素LB培养基过夜培养，次日以1:100 转接到新鲜的含有100ug/ml卡那霉素的LB培养基中，于37℃、200rpm震荡培养至A600+0.4-0.6时，加 入IPTG时期终浓度为1mmol/L，温度调至25℃诱导表达14h。4℃，10000r/min离心10min收集沉淀。
(3)、pET30a-AD7c-NTP融合蛋白的纯化
A、将上述的菌体沉淀用菌体裂解Buffer A(20mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA，0.1％Triton X-100， 1mM DTT)重悬，600W功率超声破碎，10000rpm离心30min，收集包涵体沉淀。
B、将包涵体沉淀用缓冲液I(20mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM DTT,8M尿素)、缓冲液II(20mM Tris-HCl (pH9.0)，1mM DTT,8M尿素)、缓冲液III(20mM Tris-HCl(pH11)，1mM DTT,8M尿素)进行溶解，优选 为缓冲液III，10000rpm，离心30min，收集上清。
C、溶解后的包涵体蛋白通过Ni柱亲和层析纯化：本发明采用AKTA Pure25纯化仪对蛋白样品进行纯 化。
装柱：取5ml Ni Sepharose excel(GE)亲和填料转入XK 16/20Colum(GE)色谱柱，用5倍柱体 积的结合缓冲液III(20mM Tris-HCl(pH11.0)，1mM DTT,8M尿素)平衡镍柱；
上样：将蛋白样品经0.45μm滤膜过滤后准备上样，流速2ml/min；最后用5-10倍柱体积缓冲液III 进行平衡。
洗脱：分别用洗脱液I(20mM Tris-HCl(pH11.0)，1mM DTT,8M尿素，50mM咪唑)、洗脱液II(20mM Tris-HCl(pH11.0)，1mM DTT,8M尿素，200mM咪唑)和洗脱液(20mM Tris-HCl(pH11.0)，1mM DTT,8M 尿素，500mM咪唑)进行洗脱，分别收集不同洗脱峰。
平衡及保存：分别用5倍柱体积的结合缓冲液III、纯化水、20％乙醇进行平衡镍柱，并于4℃保存。
(4)、蛋白复性：采用尿素梯度透析法进行复性，复性缓冲液为：20mM Tris-HCl(pH11.0)，1mM GSH， 0.1GSSG，0.5M精氨酸,4M尿素，最终得到可溶性的人AD7c-NTP重组蛋白。
(5)、SDS-PAGE鉴定
采用SDS-PAGE对人AD7c-NTP重组蛋白纯化及复性后的样品进行鉴定，结果见图2.
注：M：预染蛋白Marker，泳道2：纯化及复性后人AD7c-NTP重组蛋白。
实施例二：抗人AD7c-NTP单克隆抗体的制备
(1)、动物免疫
以纯化的人AD7c-NTP重组蛋白为免疫原，常规方法免疫8-12周龄BALB/c雌性小鼠，初次用弗氏完 全佐剂与抗原进行乳化，经皮下和腹腔多点免疫，剂量为100μg/只；隔两周加强免疫一次，共三次，佐 剂为弗氏不完全佐剂，剂量100μg/只/次；采用间接ELISA法检测小鼠尾血效价>1:10^4，融合前三天进 行腹腔注射加强免疫100μg人AD7c-NTP抗原。
(2)、细胞融合
取免疫脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)按照5:1的比例混合，1000rpm，离心10min，弃上清；用RPMI-1640 培养基重悬细胞，1000rpm，离心10min，弃上清，用滴管吸出残留液体，轻击管底，使沉淀细胞松散均匀， 至于37℃水浴中预热，在60s内加入预热的PEG1500(Roche)1ml，然后缓慢滴加RPMI-1640培养基至 20ml，1000rpm，离心10min，弃上清。用含HAT培养基重悬细胞，并分装至96孔细胞培养板，并置于37℃， 5％CO2培养箱内培养。
(3)、细胞筛选及单克隆化
采用间接ELISA法筛选与人AD7c-NTP重组蛋白特异性结合的阳性培养孔，其具体过程为：
A、抗原酶标板的制备
用50mM pH9.6碳酸盐华冲也将人AD7c-NTP重组蛋白稀释至2μg/ml，分别加入至96孔酶标板，100 μl/孔，4℃包被过夜；用PBST(10mM PBS(pH7.4)，0.05％T-80)洗涤3-5次，甩干后，用封闭液(10mM PBS(pH7.4)，5％BSA)37℃封闭2h后备用。
B、细胞上清ELISA检测
分别取待筛选的96孔细胞上清100μl，加入至96孔已制备的抗原酶标板，37℃，孵育1h，用PBST 洗版3-5次。进一步，在每孔中加入1:5000稀释的羊抗鼠-HRP 100μl，37℃孵育45min，用PBST洗板 3-5次。最后加入底物H2O2-TMB((3,3’，5,5’-四甲基联苯胺))，100μl/孔，避光显色10min，加入2M 硫酸50ul/孔终止反应，于酶标仪中测定450nM的吸光值。
C、细胞单克隆化
选择ELISA检测阳性的细胞孔，采用有限稀释法分别进行细胞单克隆化，确保每个培养孔内至多含有 一个杂交瘤细胞。待细胞长至培养孔1/3-1/2时再次经间接ELISA法筛选，最终确保单一细胞株可稳定分 泌抗人AD7c-NTP重组蛋白的抗体。
(4)、细胞冻存
细胞冻存液：90％胎牛血清+10％DMSO，将杂交瘤细胞离心，重悬于预冷的细胞冻存液中，细胞密度为 10^7，分转至冻存管中，1ml/支，置于-80℃冰箱中，次日放入液氮长期保存。
(5)、单克隆抗体制备
本发明中，通过制备小鼠腹水法获得抗人AD7c-NTP重组蛋白的单克隆抗体，具体步骤如下：
首先将8-12周龄BALB/c雄性致敏(腹腔注射液体石蜡，0.5ml/只)，2周后腹腔接种上述获得的杂交 瘤细胞(需经无血清培养洗涤至少一次)，接种量10^6/只，待小鼠腹部可见明显膨胀，反复抽取腹腔腹水， 4000rmp，离心30min，收集上清，分装，于-20℃备用。
实施例三：抗人AD7c-NTP重组蛋白的单克隆抗体纯化
(1)、单克隆抗体的纯化
将实施例二中得到的单抗腹水通过Protein A亲和层析法进行纯化，具体步骤如下：
基本步骤为：平衡-上样-平衡-洗脱-平衡-保存
平衡液：20mM PB(pH7.2)缓冲液
洗脱液：0.1M pH 3.0甘氨酸-HCl缓冲液
中和缓冲液：1M，pH9.0，Tris-HCl缓冲液
保存液：20％无水乙醇
取3-5ml腹水，用50％饱和硫酸铵进行沉淀2h以上，10000rmp，离心20min，弃上清；沉淀用平衡液 进行溶解，并用0.45μm滤膜过滤后，准备上样；Protein A亲和柱预先经5倍柱体积的平衡液平衡，然 后以2ml/min的流速将硫酸铵沉淀的蛋白进行上样，最后再用5倍柱体积平衡液进行平衡；更换为洗脱液 进行洗脱，并收集目的蛋白，然后按照抗体：中和缓冲液＝20:1的体积比进行中和，得到纯化的抗抗人 AD7c-NTP重组蛋白的单克隆抗体。
实施例四：抗体配对检测
(1)、抗体辣根过氧化物酶(HRP)标记
HRP标记采用高碘酸钠氧化法。标记抗体采用间接ELISA法进行效价检测，于-20℃保存备用。
(2)、抗体对筛选
采用棋盘滴定法进行抗体配对，分别取浓度为0.3ng/ml、0.6ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、 10ng/ml、20ng/ml的人AD7c-NTP重组蛋白筛选最佳配对抗体。以经验浓度200ng/孔包被24种酶标抗体， 4℃过夜，PBST洗涤3-5遍，加入封闭液300μl/孔，37℃封闭2h，PBST洗涤3-5遍；加入定值人AD7c-NTP 重组蛋白，37℃孵育1h后PBST洗3-5遍；再分别加入1:500倍稀释的HRP标记抗体，37℃孵育45min，PBST洗3-5遍；加入底物TMB，37℃避光显色10min后，加入终止液2M硫酸50μl，于酶标仪中测定450nM 的吸光值。结果见表1-2所示，分析配对结果。
表1.HRP标记抗人AD7c-NTP抗体效价ELISA检测结果
表2.棋盘法滴定法筛选的最优配对抗体检测结果
实施例五：临床尿液样本中人AD7c-NTP含量的检测
采用实施例四中的I1B10-X1C11配对抗体，建立人AD7c-NTP抗原双抗体夹心ELISA检测方法，并对 临床尿液样本进行检测，具体步骤如下：
样本采集：留晨尿，健康人样本8份、临床阳性样本5份
AD7c-NTP抗体酶标板的制备：方法与实施例四中抗体对筛选相同
AD7c-NTP蛋白标准品的配制：用10mM pH7.4 PBS稀释AD7c-NTP蛋白至终浓度分别为0.3ng/ml、 0.6ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml。
向预包被酶标板中加入待见尿液和抗原标准品各100μl/孔，空白孔加100μl PBS，37℃孵育60min， PBST洗涤3-5遍，拍干。在各孔内加入标记HRP的配对抗体100μl/孔，37℃孵育45min，PBST洗涤3-5 遍，拍干。加入底物TMB，37℃避光显色15min。每孔加入终止液2M硫酸50μl，于酶标仪中测定450nM 的吸光值(OD值)。以吸光度值为Y轴，抗原标准品浓度为X轴，制作标准曲线，并计算样本中AD7c-NTP 的浓度。具体结果见表3.和图3.
表3. 13份尿液样本中AD7c-NTP的浓度检测结果
以上所述仅为本发明专利的较佳实施例而已，并不用以限制本发明专利，凡在本发明专利的精神和原 则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明专利的保护范围之内。