阅读说明：本技术 一种外生菌根菌颗粒剂菌种的制备及播种方法 (Preparation and sowing method of ectomycorrhizal fungi granule strain ) 是由 易筑刚 于 2019-10-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种外生菌根菌颗粒剂菌种的制备,包括以下步骤：(1)将外生菌根菌搅拌打碎菌丝体得到外生菌根菌液；(2)将营养液加入步骤(1)的外生菌根菌液中得混合液；(3)将步骤(2)的混合液缓慢加入聚丙烯酰胺中,继续搅拌至混合液被吸附完,再加入麦麸粉,继续搅拌得到所述外生菌根菌颗粒剂菌种；其播种方法采用斜面断根或穴状断根进行。本申请外生菌根菌颗粒剂菌种改善了现有技术受目的菌根菌分布的限制以及播种劳动强度大、受天气影响较大的问题,且所用原料简单易得,制备方法简单,操作简便,降低了生产成本,提高了经济效益,适合大面积推广应用。(The invention discloses a preparation method of an ectomycorrhizal fungi granule strain, which comprises the following steps: (1) stirring the ectomycorrhizal fungi and smashing mycelia to obtain ectomycorrhizal fungi liquid; (2) adding the nutrient solution into the ectomycorrhizal bacteria liquid obtained in the step (1) to obtain a mixed solution; (3) slowly adding the mixed solution obtained in the step (2) into polyacrylamide, continuously stirring until the mixed solution is completely absorbed, then adding wheat bran powder, and continuously stirring to obtain the ectomycorrhizal fungi granule strain; the seeding method is carried out by cutting roots on a slope or cutting roots in a cave shape. The application of the ectomycorrhizal fungi granule strain improves the problems that the prior art is limited by the distribution of target mycorrhizal fungi, the labor intensity of seeding is high, and the weather influence is large, and the used raw materials are simple and easy to obtain, the preparation method is simple, the operation is simple and convenient, the production cost is reduced, the economic benefit is improved, and the ectomycorrhizal fungi granule strain is suitable for large-area popularization and application.)

一种外生菌根菌颗粒剂菌种的制备及播种方法

技术领域

本发明属于食用菌菌种制种技术领域，尤其涉及一种外生菌根菌颗粒剂菌种 的制备及播种方法。

背景技术

许多大型真菌和高等植物的根系形成共生关系，我们称为外生菌根。中国有 极为丰富的外生菌根菌，已知600种以上，例如伞菌类中的红菇属、乳菇属、鹅 膏菌属、牛肝苗属、腹苗类的硬皮马勃菌属、豆包菌以及子囊菌类的块菌属等。 外生菌根菌的研究应用，对于发展林业育苗，促进林木生长发育以及绿化荒山、 矿厂废地有重要意义。外生菌根菌是真菌与高等植物的根部形成的菌根合体，宿 主和菌根菌的代谢产物经过哈氏网的网络作双向运转。我国有外生菌根的主要树 木有栎、松、柳、椴、枫、胡桃及桦科等；菌根真菌中有许多是珍贵的食用菌， 如：牛肝菌，松茸(松口蘑)，松乳菇等经常出现于松林及云杉林。这种具有共 生共栖作用的菌根菌，具有明显的经济效益和环境效益。不仅木材的产量提高40％,而且还能提供大量美味可口的蘑菇。大量研究报道证明，外生菌根菌有利于 在贫瘠土壤生长出茂盛树林，在低营养土壤环境中，外生菌根菌的感染力仍然较 强，使大部分植物有了共同的开拓者。在获得大量速生树的同时，也获得了价值 可以同主产品同样或更高价值的菌类。

然而外生菌根性食药用菌不能在纯人工条件下繁殖，以往外生菌根菌菌种施 放都是用外生菌根菌液采用喷雾器在宿主根际喷施，这种方式不适于大面积推广 应用，主要存在如下两个因素：(1)劳动强度大，投入产出比不适宜大面积推 广应用；(2)若遇干旱，会极大降低菌种活性。按以往研究资料都局限在小范 围试验，对菌种施放、管理等诸多因素未作成本考虑，上述两因素是外生菌根性 食药用菌大面积推广应用的一大瓶颈。

发明内容

本发明为解决上述技术问题，提供了一种外生菌根菌颗粒剂菌种的制备及播 种方法。本申请通过将外生菌根菌液和营养液混合制成颗粒剂，再施放于土壤中， 能为菌丝生长提供充足养分和水分的同时还能促进宿主根部愈伤组织愈合形成 新根，继而形成新的菌根合体，为目的菌根菌的形成提供了便捷的可行手段，进 而可根据目的菌根菌的分布状况采取不同播种方法，改善了现有技术受目的菌根 菌分布的限制以及播种劳动强度大、受天气影响较大的问题，且所用的原料简单 易得，制备方法简单，操作简便，降低了生产成本，提高了经济效益，适合大面 积推广应用。

为了能够达到上述所述目的，本发明采用以下技术方案：

一种外生菌根菌颗粒剂菌种的制备方法，包括以下步骤：通过搅拌将外生菌 根菌的菌丝体打碎后，先加入营养液，混匀后，将混合液缓慢加入到聚丙烯酰胺 中，搅拌至混合液被吸附完，然后再加入麦麸粉，继续搅拌制得所述外生菌根菌 颗粒剂菌种；所述外生菌根菌为松乳菇、牛肝菌、灰蘑菌；所述聚丙烯酰胺为非 离子型聚丙烯酰胺或阴离子型聚丙烯酰胺。

进一步地，所述的一种外生菌根菌颗粒剂菌种的制备方法，包括以下步骤：

(1)将外生菌根菌置于容器中，搅拌打碎菌丝体得到外生菌根菌液；

(2)将营养液加入步骤(1)的外生菌根菌液中并搅拌均匀，得到混合液；

(3)将聚丙烯酰胺置于容器内，搅拌状态下，将步骤(2)的混合液缓慢加 入聚丙烯酰胺中，继续搅拌至混合液被吸附完，再加入麦麸粉，继续搅拌得到所 述外生菌根菌颗粒剂菌种。

进一步地，在步骤(1)，所述搅拌的速度为250～300r/min，时间为3～5min。

进一步地，在步骤(2)，所述营养液和外生菌根菌液按照等体积进行混合； 所述营养液由以下重量份的原料制成：生玉米粉20～50份、葡萄糖10～40份、 氯化钙0.3～1份、氯化钠0.3～1份、硫酸镁1～3.5份、磷酸二氢钾2～5份、 VB1 0.05～0.15份、吲哚丁酸钾0.5～2份；其制备方法为：将生玉米粉加入水 中，并加热60～100℃搅拌使生玉米粉溶解成玉米液，冷却至室温，然后再加入 其他原料，搅拌混合均匀制得。

进一步地，在步骤(3)，所述混合液加入聚丙烯酰胺中的搅拌速度为250～ 300r/min；麦麸粉加入时的搅拌速度为500～800r/min。

进一步地，在步骤(3)，所述麦麸粉与聚丙烯酰胺的体积比＝1～2:1。

进一步地，在步骤(3)，所述聚丙烯酰胺和混合液按照体积比＝16～19:10 进行混合，且混合液加入聚丙烯酰胺的速度为10～15cm³/s。

进一步地，一种如上述所述制备方法制得的外生菌根菌颗粒剂菌种，所述外 生菌根菌颗粒剂菌种的颗粒直径为0.2cm～0.5cm，含水量为30％～45％。

进一步地，所述的外生菌根菌颗粒剂菌种的播种方法，采用斜面断根或穴状 断根播种方法进行播种。

进一步地，所述斜面断根播种方法包括以下步骤：在多雨季节，将枯枝落叶 层靶在一边，剥离表层土5～8cm，在距离寄主树干2～4m，以树干为圆心挖环 状斜面，按每平方200～400g将外生菌根菌颗粒剂菌种均匀撒施于斜面并压紧， 然后覆盖5～8cm厚的腐殖土或表层土并压紧，再覆盖枯枝落叶；所述环状斜面 的坡度为15°、深为28～32cm；

所述穴状断根播种方法包括以下步骤：在宿主分布均匀的树林中，选择距四 周宿主2～4m定一点，以该点为圆心先将枯枝落叶层沿穴靶在一边，并剥离表 土层于边沿，然后以点为圆心挖半径1.1～1.3m、中间深0.2～0.4m的锅状穴， 边沿坡度为15°，按每平方200～400g将外生菌根菌颗粒剂菌种均匀撒施于锅 状斜面上并压紧，覆盖5～8cm厚的腐殖土或表层土并压紧，再覆盖枯枝落叶。

本申请根据多数真菌生长需要碳源、氮源和无机盐，向外生菌根菌液中加入 营养液，所述营养液的pH自然。

本申请所述斜面断根和穴状断根播种方法，是根据大部分植物的细根和须根 主要分布在0～30cm范围内(尤其以松乳菇宿主马尾松最为典型)，因此该方法 为菌丝生长繁殖提供充足养分和水分的同时还能促进宿主根部愈伤组织愈合形 成新根，继而形成新的菌根合体，为目的菌根菌的形成提供了便捷的可行手段。

一、聚丙烯酰胺的选定

发明人在主持《马尾松林下松乳菇促产技术推广应用》研究过程中发现：按 传统的常规施撒液体菌种方法会造成：①耗费大量人力物力财力；②受制于自 然条件限制，若遇天干或久晴无雨，则菌种就会很快丧失活性；③目的菌种替 换原外生菌根菌以提高其产量，效果微乎其微。鉴于此，发明人创造性地采用高 分子聚合物(聚丙烯酰胺)具有锁住水分、养分同时还能保持菌种活性的特性， 解决实际推广应用中遇到的问题，并通过设计实验进一步证明了选用何种类型的 聚丙烯酰胺，具体实验如下：

(一)材料

1.原料：阴离子型聚丙烯酰胺250～800万单位、阳离子型聚丙烯酰胺250～ 800万单位、非离子型聚丙烯酰胺250～800万单位、麦麸粉10～50目；

2.主要试剂：葡萄糖；

3.液体菌种：采用优选液体培养基(液体培养基由以下重量份的原料制成： 生玉米粉20～50份、葡萄糖10～40份)，经9天发酵所得菌种(100倍显微镜 视界80～120个孢子)；

4.主要设备：搅拌器、三角瓶、高温高压蒸汽灭菌锅、恒温恒湿培养箱、 真空干燥箱、万分之一电子天平、培养皿、滤纸等。

(二)方法

1.试剂准备

①稀释液：用优选液体培养基(液体培养基由以下重量份的原料制成：生玉 米粉20～50份、葡萄糖10～40份)经高温高压灭菌，备用；

②菌种稀释：按1:1稀释，量取5mL液体菌种(100倍显微镜视界80～120 个孢子)，然后加入5mL稀释液搅拌均匀；

③分别量取阴、阳、非离子型聚丙烯酰胺17mL，分别倒入三个三角瓶中；

④量取目粒度为10～50目的麦麸粉120mL，备用。

2.菌种制作方法

量取5ml液体菌种，加入等量稀释液5mL充分搅拌均匀得菌种稀释液，缓 慢将其倒入装有聚丙烯酰胺的三角瓶内，用搅拌器按250～300r/min边搅拌边缓 慢倒入，直至液体被均匀充分吸附，将搅拌器转速调至500～800r/min，再缓慢 倒入麦麸粉17mL，充分搅拌至0.2～0.5cm颗粒状制得；

对照组菌种制作：与实验组不同之处在于：对照不添加聚丙烯酰胺，菌种稀 释液与麦麸粉的体积比＝1:2。

(三)菌种活性实验及结果

1.方法：将海绵剪成5*5*0.5cm浸透水平摊在培养皿内，上覆与海绵同样 大小的滤纸，然后取3粒颗粒剂等距排在滤纸上，在培养皿内加水5mL，盖上 盖子放进温度为28℃、相对湿度为80％培养箱内培养。

2.效果测定：菌丝生长情况采用定性描述判断，实验结果如下表1所示。

表1不同离子型聚丙烯酰胺对菌种活性的影响实验结果

由表1实验数据可知，非离子型聚丙烯酰胺和阴离子型聚丙烯酰由于具有锁 住水分养分特性，用于制备菌种可保持菌种活性时间较长，因此可将非离子型和 阴离子型聚丙烯酰胺用作制备菌种材料，且实验结果非离子型稍好于阴离子型， 故最终优选非离子型聚丙烯酰胺作为菌种材料；而阳离子型聚丙烯酰胺颗粒剂呈 强酸性，不适宜菌丝生长；对照组没有添加聚丙烯酰胺，无保水能力，自然状态 下水分易散失，导致菌种活性受到极大影响。

本申请利用聚丙烯酰胺具有极强的吸水和凝絮吸附特性，让其锁住水分的同 时将菌丝体和营养物质吸附在表面，一旦遇到合适的条件菌丝体就能利用颗粒菌 剂自身的水份和养份生长，从而在土壤或其他介质环境中迅速蔓延，并能缓慢释 放营养成分和水分，持续为菌种提供生长所需的物质，从而可以使得菌种活性保 持时间较长。

二、无机盐对菌丝萌发特性及活性有效期实验

(一)无机盐由以下重量份的原料制成：1～3.5份的MgSO₄、2～5份的 KH₂PO₄、0.3～1份的NaCl和0.3～1份的CaCl₂。

(二)菌种制作方法

1.含盐颗粒剂菌种的制备：称取10～35mg的MgSO₄、20～50mg的KH₂PO₄、 3～10mg的NaCl、3～10mg的CaCl₂，倒入5mL稀释液(稀释液由以下重量份 的原料制成：生玉米粉20～50份、葡萄糖10～40份)内加热搅拌溶解；待冷却 至室温后倒入5mL液体菌种中拌匀；

2.不含盐颗粒剂菌种的制备：采用含盐颗粒剂菌种的制备方法，但是原料不 添加无机盐来制作不含盐颗粒剂菌种。

(三)测定方法

1.实验设计：将制作好的含盐颗粒剂菌种和不含盐颗粒剂菌种分别随机平 均分成六份，分批次进行菌丝萌发实验，每批同时进行实验，每间隔6天进行一 批实验，每批次再培养到第2天、第3天、第5天时，分别进行观察并记录菌丝 生长状态，共进行6批实验。

2.实验方法：将海绵剪成5*5*0.5浸透水平摊在培养皿内，上覆与海绵同 样大小的滤纸，然后取3粒颗粒菌剂等距排在滤纸上，在培养皿内加水5mL， 盖上盖子放进温度28℃、相对湿度80％的恒温恒湿培养箱内培养。

3.数据处理

本实验对菌丝生长情况采用定性描述，实验结果如下表2所示；然后以菌丝致密性和菌 丝长度两因子，通过权重赋值确定菌丝生长指数赋值，实验结果如下表3所示；根据菌丝生 长指数赋值结果，得到菌种有效期竖图形式判断菌种有效期，结果如图1所示。

表2

表3菌丝生长指数赋值

(四)实验结果

1.由表2可知，含盐颗粒剂菌种能更快促进菌丝萌发，利于菌丝生长，能 较长时间保持其活性，在23天后其活性逐渐降低，而不含盐颗粒剂菌种活性是 持续下降的；所以含盐颗粒剂菌种活性最佳为20d以内，生产出的含盐颗粒剂菌 种必须在20天内施放，最迟不得超过30天。

2.通过图1(菌种有效期竖图)明显看出：含盐颗粒剂菌种能更快促进菌 丝萌发，利于菌丝生长，能较长时间保持其活性，在23天后其活性逐渐降低， 而不含盐颗粒剂菌种活性是持续下降的；所以含盐颗粒剂菌种活性最佳为20d以 内，生产出的含盐颗粒剂菌种必须在20天内施放，最迟不得超过30天；且在实 验室条件下菌丝生长状态随时间推移而越来越旺盛，第5天好于第3天。

三、菌种中添加生长激素对植物根再生及外生菌根菌寄生的实验观察

(一)实验方法

1.含生长激素颗粒剂制备

①称取10～35mg的MgSO₄、20～50mg的KH₂PO₄、3～10mg的NaCl、3～ 10mg的CaCl₂，倒入5mL稀释液(稀释液由以下重量份的原料制成：生玉米粉 20～50份、葡萄糖10～40份)内加热搅拌溶解；

②待冷却至室温后倒入5mL液体菌种中搅拌均匀；然后分别制成500ppm(实 验1)、1000ppm(实验2)和2000ppm(实验3)3种生长激素(吲哚丁酸钾) 浓度菌剂。

(二)植物根再生及外生菌根菌寄生实验(苗木断根法)

1.营养袋苗断根处理实验：

①靠苗木茎1cm作纵向切割，在断面均匀施放颗粒剂，用尼龙纱网覆盖压 紧，再将切开的另一半营养袋泥覆盖其上压实；

②每个生长激素浓度分别作3株，重复1次，共18株；

③对照：采用相同方法断根，不放颗粒剂，作3株处理；

④将处理后的营养袋苗倾斜30°～45°放置在24℃、相对湿度80％、光照 1级的培养箱内培养，每间隔一天喷次水。

2.显微镜观察：培养第20d，取成活苗木放入清水中浸泡3～5h，轻抖掉泥 土，将根系置于培养皿中注水淹没根系，于10倍显微镜下观察。

(二)实验结果

1.断根实验于2018年2月15日开始，3月6日结束，结果如表4所示。

2.根部10倍显微镜观察结果：根系周边覆盖一层有大量菌丝体的膜状物， 该膜状物为高分子聚合物附在根须表面，同时新生根明显，如图2所示。

表4营养袋苗断根处理实验结果

由表4实验数据可知，菌种有很强保水性，能充分保证植物根系对水分的需 求，同时菌种的水分为外生菌根真菌的生长提供保障。由图2可知，菌种吸水后 在根须周围具有极强的附着性，同时菌丝生长旺盛，添加的植物生长激素对根的 生长具有促进作用。因此可知，颗粒剂菌种具有很好的保水保湿功能，除能促进 保证植物根系的生长外，还有利于自身携带的真菌菌丝体的生长繁殖。

由于本发明采用了以上技术方案，具有以下有益效果：

(1)本申请通过将外生菌根菌液和营养液混合制成颗粒剂，再施放于土壤 中，能为菌丝生长提供充足养分和水分的同时还能促进宿主根部愈伤组织愈合形 成新根，继而形成新的菌根合体，为目的菌根菌的形成提供了便捷的可行手段， 进而可根据目的菌根菌的分布状况采取不同播种方法，改善了现有技术受目的菌 根菌分布的限制以及播种劳动强度大、受天气影响较大的问题，且所用的原料简 单易得，制备方法简单，操作简便，降低了生产成本，提高了经济效益，适合大 面积推广应用。

(2)采用海绵和滤纸培养法测定本申请制得的外生菌根菌颗粒剂菌种的活 性，每间隔6d作一次，实验观察菌丝生长情况，菌种制剂30d内均有菌丝生长， 说明本申请外生菌根菌颗粒剂菌种能够良好应对自然环境，不会因干旱导致菌种 活性极大降低。

(3)本申请外生菌根菌颗粒剂菌种可以采用斜面断根法和穴状断根法多种 方法进行播种。制作和播种方法简单，降低了劳动力强度，且其自身保水性好， 不会因干旱导致菌种活性极大降低，另一方面为目的菌种的浸入替换形成新的菌 根体提供了便捷的可行手段。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实例或现有技术中的技术方案，下面将对实施实例 或现有技术描述中所需要的附图做简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图 仅仅是本发明的一些实例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性的前 提下，还可以根据这些附图获得其他的附图：

图1为本申请外生菌根菌颗粒剂菌种的菌种活性竖图；

图2为本申请外生菌根菌颗粒剂菌种中添加生长激素对植物根再生及外生 菌根菌寄生的根部10倍显微镜。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这 些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求 所要求保护的范围。

实施例1

一种外生菌根菌颗粒剂菌种的制备方法，包括以下步骤：

(1)将外生菌根菌置于容器中，搅拌打碎菌丝体得到外生菌根菌液；所述 搅拌的速度为250r/min，时间为3min；

(2)将营养液加入步骤(1)的外生菌根菌液中并搅拌均匀，得到混合液； 所述营养液和外生菌根菌液按照等体积进行混合；所述营养液由以下重量份的原 料制成：生玉米粉20份、葡萄糖10份、氯化钙0.3份、氯化钠0.3份、硫酸镁 1份、磷酸二氢钾2份、VB1 0.05份、吲哚丁酸钾0.5份；其制备方法为：将生 玉米粉加入水中，并加热60℃搅拌使生玉米粉溶解成玉米液，冷却至室温，然 后再加入其他原料，搅拌混合均匀制得；

(3)将聚丙烯酰胺置于容器内，搅拌状态下，将步骤(2)的混合液缓慢加 入聚丙烯酰胺中，继续搅拌至混合液被吸附完，再加入麦麸粉，继续搅拌得到所 述外生菌根菌颗粒剂菌种；所述混合液加入聚丙烯酰胺中的搅拌速度为 250r/min；麦麸粉加入时的搅拌速度为500r/min；所述麦麸粉与聚丙烯酰胺的体 积比＝1:1；所述聚丙烯酰胺和混合液按照体积比＝16:10进行混合，且混合液加入 聚丙烯酰胺的速度为10cm³/s；

所述外生菌根菌为松乳菇；所述聚丙烯酰胺为非离子型聚丙烯酰胺或阴离子 型聚丙烯酰胺。

一种如上述所述制备方法制得的外生菌根菌颗粒剂菌种，所述外生菌根菌颗 粒剂菌种的颗粒直径为0.2cm，含水量为30％。

一种如上述所述的外生菌根菌颗粒剂菌种的播种方法，采用斜面断根或穴状 断根播种方法进行播种；所述斜面断根播种方法包括以下步骤：在多雨季节，将 枯枝落叶层靶在一边，剥离表层土5cm，在距离寄主树干2m，以树干为圆心挖 环状斜面，按每平方200g将外生菌根菌颗粒剂菌种均匀撒施于斜面并压紧，然 后覆盖5cm厚的腐殖土或表层土并压紧，再覆盖枯枝落叶；所述环状斜面的坡 度为15°、深为28cm；

所述穴状断根播种方法包括以下步骤：在宿主分布均匀的树林中，选择距四 周宿主2m定一点，以该点为圆心先将枯枝落叶层沿穴靶在一边，并剥离表土层 于边沿，然后以点为圆心挖半径1.1m、中间深0.2m的锅状穴，边沿坡度为15°， 按每平方200g将外生菌根菌颗粒剂菌种均匀撒施于锅状斜面上并压紧，覆盖5cm 厚的腐殖土或表层土并压紧，再覆盖枯枝落叶。

实施例2

一种外生菌根菌颗粒剂菌种的制备方法，包括以下步骤：

(1)将外生菌根菌置于容器中，搅拌打碎菌丝体得到外生菌根菌液；所述 搅拌的速度为300r/min，时间为5min；

(2)将营养液加入步骤(1)的外生菌根菌液中并搅拌均匀，得到混合液； 所述营养液和外生菌根菌液按照等体积进行混合；所述营养液由以下重量份的原 料制成：生玉米粉50份、葡萄糖40份、氯化钙1份、氯化钠1份、硫酸镁1～ 3.5份、磷酸二氢钾5份、VB1 0.15份、吲哚丁酸钾2份；其制备方法为：将生 玉米粉加入水中，并加热100℃搅拌使生玉米粉溶解成玉米液，冷却至室温，然 后再加入其他原料，搅拌混合均匀制得；

(3)将聚丙烯酰胺置于容器内，搅拌状态下，将步骤(2)的混合液缓慢加 入聚丙烯酰胺中，继续搅拌至混合液被吸附完，再加入麦麸粉，继续搅拌得到所 述外生菌根菌颗粒剂菌种；所述混合液加入聚丙烯酰胺中的搅拌速度为 300r/min；麦麸粉加入时的搅拌速度为800r/min；所述麦麸粉与聚丙烯酰胺的体 积比＝2:1；所述聚丙烯酰胺和混合液按照体积比＝19:10进行混合，且混合液加入 聚丙烯酰胺的速度为15cm³/s；

所述外生菌根菌为牛肝菌；所述聚丙烯酰胺为非离子型聚丙烯酰胺或阴离子 型聚丙烯酰胺。

一种如上述所述制备方法制得的外生菌根菌颗粒剂菌种，所述外生菌根菌颗 粒剂菌种的颗粒直径为0.5cm，含水量为45％。

一种如上述所述的外生菌根菌颗粒剂菌种的播种方法，采用斜面断根或穴状 断根播种方法进行播种；所述斜面断根播种方法包括以下步骤：在多雨季节，将 枯枝落叶层靶在一边，剥离表层土8cm，在距离寄主树干4m，以树干为圆心挖 环状斜面，按每平方400g将外生菌根菌颗粒剂菌种均匀撒施于斜面并压紧，然 后覆盖8cm厚的腐殖土或表层土并压紧，再覆盖枯枝落叶；所述环状斜面的坡 度为15°、深为32cm；

所述穴状断根播种方法包括以下步骤：在宿主分布均匀的树林中，选择距四 周宿主4m定一点，以该点为圆心先将枯枝落叶层沿穴靶在一边，并剥离表土层 于边沿，然后以点为圆心挖半径1.3m、中间深0.4m的锅状穴，边沿坡度为15°， 按每平方400g将外生菌根菌颗粒剂菌种均匀撒施于锅状斜面上并压紧，覆盖8cm 厚的腐殖土或表层土并压紧，再覆盖枯枝落叶。

实施例3

一种外生菌根菌颗粒剂菌种的制备方法，包括以下步骤：

(1)将外生菌根菌置于容器中，搅拌打碎菌丝体得到外生菌根菌液；所述 搅拌的速度为260r/min，时间为3.5min；

(2)将营养液加入步骤(1)的外生菌根菌液中并搅拌均匀，得到混合液； 所述营养液和外生菌根菌液按照等体积进行混合；所述营养液由以下重量份的原 料制成：生玉米粉30份、葡萄糖20份、氯化钙0.5份、氯化钠0.5份、硫酸镁 1.5份、磷酸二氢钾3份、VB1 0.08份、吲哚丁酸钾1.0份；其制备方法为：将 生玉米粉加入水中，并加热70℃搅拌使生玉米粉溶解成玉米液，冷却至室温， 然后再加入其他原料，搅拌混合均匀制得；

(3)将聚丙烯酰胺置于容器内，搅拌状态下，将步骤(2)的混合液缓慢加 入聚丙烯酰胺中，继续搅拌至混合液被吸附完，再加入麦麸粉，继续搅拌得到所 述外生菌根菌颗粒剂菌种；所述混合液加入聚丙烯酰胺中的搅拌速度为 260r/min；麦麸粉加入时的搅拌速度为600r/min；所述麦麸粉与聚丙烯酰胺的体 积比＝1.2:1；所述聚丙烯酰胺和混合液按照体积比＝17:10进行混合，且混合液加 入聚丙烯酰胺的速度为11cm³/s；

所述外生菌根菌为灰蘑菌；所述聚丙烯酰胺为非离子型聚丙烯酰胺或阴离子 型聚丙烯酰胺。

一种如上述所述制备方法制得的外生菌根菌颗粒剂菌种，所述外生菌根菌颗 粒剂菌种的颗粒直径为0.3cm，含水量为35％。

一种如上述所述的外生菌根菌颗粒剂菌种的播种方法，采用斜面断根或穴状 断根播种方法进行播种；所述斜面断根播种方法包括以下步骤：在多雨季节，将 枯枝落叶层靶在一边，剥离表层土6cm，在距离寄主树干2.5m，以树干为圆心 挖环状斜面，按每平方250g将外生菌根菌颗粒剂菌种均匀撒施于斜面并压紧， 然后覆盖6cm厚的腐殖土或表层土并压紧，再覆盖枯枝落叶；所述环状斜面的 坡度为15°、深为29cm；

所述穴状断根播种方法包括以下步骤：在宿主分布均匀的树林中，选择距四 周宿主2.5m定一点，以该点为圆心先将枯枝落叶层沿穴靶在一边，并剥离表土 层于边沿，然后以点为圆心挖半径1.15m、中间深0.25m的锅状穴，边沿坡度为 15°，按每平方250g将外生菌根菌颗粒剂菌种均匀撒施于锅状斜面上并压紧， 覆盖6cm厚的腐殖土或表层土并压紧，再覆盖枯枝落叶。

实施例4

一种外生菌根菌颗粒剂菌种的制备方法，包括以下步骤：

(1)将外生菌根菌置于容器中，搅拌打碎菌丝体得到外生菌根菌液；所述 搅拌的速度为290r/min，时间为4.5min；

(2)将营养液加入步骤(1)的外生菌根菌液中并搅拌均匀，得到混合液； 所述营养液和外生菌根菌液按照等体积进行混合；所述营养液由以下重量份的原 料制成：生玉米粉40份、葡萄糖30份、氯化钙0.0份、氯化钠0.9份、硫酸镁 3份、磷酸二氢钾4份、VB1 0.12份、吲哚丁酸钾1.5份；其制备方法为：将生 玉米粉加入水中，并加热90℃搅拌使生玉米粉溶解成玉米液，冷却至室温，然 后再加入其他原料，搅拌混合均匀制得；

(3)将聚丙烯酰胺置于容器内，搅拌状态下，将步骤(2)的混合液缓慢加 入聚丙烯酰胺中，继续搅拌至混合液被吸附完，再加入麦麸粉，继续搅拌得到所 述外生菌根菌颗粒剂菌种；所述混合液加入聚丙烯酰胺中的搅拌速度为 290r/min；麦麸粉加入时的搅拌速度为700r/min；所述麦麸粉与聚丙烯酰胺的体 积比＝1.9:1；所述聚丙烯酰胺和混合液按照体积比＝18:10进行混合，且混合液加 入聚丙烯酰胺的速度为14cm³/s；

所述外生菌根菌为牛肝菌；所述聚丙烯酰胺为非离子型聚丙烯酰胺或阴离子 型聚丙烯酰胺。

一种如上述所述制备方法制得的外生菌根菌颗粒剂菌种，所述外生菌根菌颗 粒剂菌种的颗粒直径为0.4cm，含水量为40％。

一种如上述所述的外生菌根菌颗粒剂菌种的播种方法，采用斜面断根或穴状 断根播种方法进行播种；所述斜面断根播种方法包括以下步骤：在多雨季节，将 枯枝落叶层靶在一边，剥离表层土7cm，在距离寄主树干3.5m，以树干为圆心 挖环状斜面，按每平方350g将外生菌根菌颗粒剂菌种均匀撒施于斜面并压紧， 然后覆盖7cm厚的腐殖土或表层土并压紧，再覆盖枯枝落叶；所述环状斜面的 坡度为15°、深为31cm；

所述穴状断根播种方法包括以下步骤：在宿主分布均匀的树林中，选择距四 周宿主3.5m定一点，以该点为圆心先将枯枝落叶层沿穴靶在一边，并剥离表土 层于边沿，然后以点为圆心挖半径1.25m、中间深0.25m的锅状穴，边沿坡度为 15°，按每平方350g将外生菌根菌颗粒剂菌种均匀撒施于锅状斜面上并压紧， 覆盖7cm厚的腐殖土或表层土并压紧，再覆盖枯枝落叶。

实施例5

一种外生菌根菌颗粒剂菌种的制备方法，包括以下步骤：

(1)将外生菌根菌置于容器中，搅拌打碎菌丝体得到外生菌根菌液；所述 搅拌的速度为275r/min，时间为4min；

(2)将营养液加入步骤(1)的外生菌根菌液中并搅拌均匀，得到混合液； 所述营养液和外生菌根菌液按照等体积进行混合；所述营养液由以下重量份的原 料制成：生玉米粉35份、葡萄糖25份、氯化钙0.7份、氯化钠0.6份、硫酸镁 2份、磷酸二氢钾4份、VB1 0.10份、吲哚丁酸钾1.2份；其制备方法为：将生 玉米粉加入水中，并加热80℃搅拌使生玉米粉溶解成玉米液，冷却至室温，然 后再加入其他原料，搅拌混合均匀制得；

(3)将聚丙烯酰胺置于容器内，搅拌状态下，将步骤(2)的混合液缓慢加 入聚丙烯酰胺中，继续搅拌至混合液被吸附完，再加入麦麸粉，继续搅拌得到所 述外生菌根菌颗粒剂菌种；所述混合液加入聚丙烯酰胺中的搅拌速度为 275r/min；麦麸粉加入时的搅拌速度为650r/min；所述麦麸粉与聚丙烯酰胺的体 积比＝1.5:1；所述聚丙烯酰胺和混合液按照体积比＝18:10进行混合，且混合液加 入聚丙烯酰胺的速度为13cm³/s；

所述外生菌根菌为松乳菇；所述聚丙烯酰胺为非离子型聚丙烯酰胺或阴离子 型聚丙烯酰胺。

一种如上述所述制备方法制得的外生菌根菌颗粒剂菌种，所述外生菌根菌颗 粒剂菌种的颗粒直径为0.4cm，含水量为37％。

一种如上述所述的外生菌根菌颗粒剂菌种的播种方法，采用斜面断根或穴状 断根播种方法进行播种；所述斜面断根播种方法包括以下步骤：在多雨季节，将 枯枝落叶层靶在一边，剥离表层土6cm，在距离寄主树干3m，以树干为圆心挖 环状斜面，按每平方300g将外生菌根菌颗粒剂菌种均匀撒施于斜面并压紧，然 后覆盖7cm厚的腐殖土或表层土并压紧，再覆盖枯枝落叶；所述环状斜面的坡 度为15°、深为30cm；

所述穴状断根播种方法包括以下步骤：在宿主分布均匀的树林中，选择距四 周宿主3m定一点，以该点为圆心先将枯枝落叶层沿穴靶在一边，并剥离表土层 于边沿，然后以点为圆心挖半径1.2m、中间深0.3m的锅状穴，边沿坡度为15°， 按每平方300g将外生菌根菌颗粒剂菌种均匀撒施于锅状斜面上并压紧，覆盖6cm 厚的腐殖土或表层土并压紧，再覆盖枯枝落叶。

综上所述，本申请通过将外生菌根菌液和营养液混合制成颗粒剂，再施放于 土壤中，能为菌丝生长提供充足养分和水分的同时还能促进宿主根部愈伤组织愈 合形成新根，继而形成新的菌根合体，为目的菌根菌的形成提供了便捷的可行手 段，进而可根据目的菌根菌的分布状况采取不同播种方法，改善了现有技术受目 的菌根菌分布的限制以及播种劳动强度大、受天气影响较大的问题，且所用的原 料简单易得，制备方法简单，操作简便，降低了生产成本，提高了经济效益，适 合大面积推广应用。采用滤纸培养和PDA液体培养法测定本申请制得的外生菌 根菌颗粒剂菌种的活性，每间隔7d作一次实验观察菌丝生长情况，菌种制剂30d 内均有菌丝生长，说明本申请外生菌根菌颗粒剂菌种能够良好应对自然环境，不 会因干旱导致菌种活性极大降低。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而 且在没有背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本 发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制 性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利 要求的等同腰间的含义和范围内的所有变化囊括在本发明的保护范围之内。