阅读说明：本技术 一种高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法 (Rapid hydrolysis analysis method for protein under high-temperature and high-pressure state ) 是由 欧阳证 王宇晨 于 2020-04-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法。其中,该方法包括：(1)将蛋白质样品与酸混合配制酸性溶液,其中所述蛋白质样品中含有天冬氨酸；(2)于密闭环境中将所述酸性溶液加热至高温高压状态,以便使所述蛋白质样品水解；(3)采用高分辨质谱仪对步骤(2)得到的水解液进行质谱分析。方法不仅步骤简单、处理快速、引入杂质少且成本低廉,还可以通过鉴定蛋白质的特异性水解片段得到原始蛋白序列信息,该自下而上的蛋白质分析方法可以作为蛋白质特征肽段、以及指纹图谱分析的有力工具,从而特异性地鉴定目标蛋白。(The invention discloses a rapid hydrolysis analysis method for protein under a high-temperature and high-pressure state. Wherein, the method comprises the following steps: (1) mixing a protein sample with acid to prepare an acidic solution, wherein the protein sample contains aspartic acid; (2) heating the acidic solution to a high temperature and high pressure state in a closed environment so as to hydrolyze the protein sample; (3) and (3) performing mass spectrometry on the hydrolysate obtained in the step (2) by using a high-resolution mass spectrometer. The method has the advantages of simple steps, rapid treatment, less introduced impurities and low cost, and can obtain original protein sequence information by identifying the specific hydrolysis fragments of the protein.)

一种高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法

技术领域

本发明属于蛋白质组学研究领域，具体而言，涉及蛋白质的自下而上的特征多肽碎片的检测方法，更具体地，涉及一种高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法。

背景技术

使用蛋白酶对蛋白质进行特异性解离，检测新产生游离特征肽段的方法是最为常见的蛋白质分析手段之一。不同种类的蛋白酶作用的位点不尽相同，最常见的胰蛋白酶的作用位点是赖氨酸和精氨酸的C末端。传统酶解通常需要适宜的环境温度(约37℃)和较长的反应时间(大于10h)，且由于引入的反应体系复杂，杂质较多，需要使用液相色谱等方式进行分离纯化，或使用基质辅助激光解离技术进行质谱进样。近些年来，固定化蛋白酶技术、微波催化蛋白酶技术等新型酶切技术在一定程度上提升了蛋白质解离的效率，但仍然存在着装置重复性差，反应体系复杂、引入较多大分子有机物(如蛋白酶自溶片段)和小分子无机盐等杂质的劣势。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法，该方法步骤简单、处理快速且引入杂质少，可以通过鉴定蛋白质的特异性水解片段得到原始蛋白序列信息，是一种新型的自下而上的蛋白质分析方法。

根据本发明的第一个方面，本发明提出了一种高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法。根据本发明的实施例，该方法包括：

(1)将蛋白质样品与酸混合配制酸性溶液，其中所述蛋白质样品中含有天冬氨酸；

(2)于密闭环境中将所述酸性溶液加热至高温高压状态，以便使所述蛋白质样品水解；

(3)采用高分辨质谱仪对步骤(2)得到的水解液进行质谱分析。

发明人发现，在酸性环境下加热蛋白质，无需引入蛋白酶即可使其肽链上天冬氨酸的C-末端和N-末端位点发生断裂，由此不仅可以避免产生蛋白酶自溶物等大分子有机物，同时还可以避免引入蛋白酶制备过程中存在的无机盐等不利于质谱检测的非挥发性杂质；与常规酶解的固定化酶等技术相比，本发明无需对水解反应装置进行前处理，水解装置搭建简单且重复性好；此外，与常规酶解温度37℃和常规酶解时间12-24h相比，本发明中通过使蛋白质在高温高压状态下水解，酶解效率大幅度提升，显著地减少了时间的消耗。综上所述，本发明上述实施例的高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法不仅步骤简单、处理快速、引入杂质少且成本低廉，还可以通过鉴定蛋白质的特异性水解片段得到原始蛋白序列信息，具体地，该自下而上的蛋白质分析方法可以作为蛋白质特征肽段、以及指纹图谱分析的有力工具，从而特异性地鉴定目标蛋白。

另外，根据本发明上述实施例的高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法还可以具有如下附加的技术特征：

在本发明的一些实施例中，步骤(1)中，所述酸性溶液的pH值为1～5，优选2～3。

在本发明的一些实施例中，所述蛋白质样品为重组人泛素蛋白、牛血清蛋白、重组结核抗原Esat-6蛋白、重组结核抗原Cfp-10蛋白、核糖核酸酶或辣根过氧化氢酶等。

在本发明的一些实施例中，步骤(1)中，配制所述酸性溶液之前，预先将所述蛋白质样品与还原剂混合，以便切断所述蛋白质样品中的二硫键。

在本发明的一些实施例中，步骤(2)中，所述加热时间不大于20min，优选1～4min。

在本发明的一些实施例中，步骤(2)中，所述酸性溶液在高温高压状态下的温度为105～200℃，压力为1.2～16atm。

在本发明的一些实施例中，步骤(2)中，所述酸性溶液在高温高压状态下的温度为150～200℃，压力为5～16atm。

在本发明的一些实施例中，步骤(3)中，预先将步骤(2)得到的水解液与极性溶剂混合后再采用高分辨质谱仪进行分析。

在本发明的一些实施例中，步骤(3)中，所述水解液中蛋白质的质量浓度为1～200ppm。

在本发明的一些实施例中，步骤(3)中，所述质谱分析的进样方式为纳流电喷雾离子源。

在本发明的一些实施例中，步骤(2)中，将所述酸性溶液置于微型密闭反应容器中进行加热，所述微型密闭反应容器为微型毛细管反应器或微型高压反应釜。

在本发明的一些实施例中，所述微型毛细管反应器中，所述毛细管的材质为柔性毛细管或刚性毛细管。

在本发明的一些实施例中，所述毛细管为细长型毛细管，所述毛细管的一端通过连接注射器或注射泵吸收所述酸性溶液，所述毛细管的两端通过加压方式进行密闭。

在本发明的一些实施例中，所述毛细管的内径不大于4mm，长度不大于20cm；优选地，所述毛细管的内径不大于2mm，长度不大于10cm。

在本发明的一些实施例中，所述毛细管为高分子聚合物毛细管，所述毛细管采用径向加压夹紧的方式进行密闭；或者，所述毛细管为不锈钢毛细管，所述毛细管采用轴向加压阻塞的方式进行密闭。

在本发明的一些实施例中，所述加热采用接触式加热法或非接触式加热法；

在本发明的一些实施例中，所述加热采用非接触式加热法，所述毛细管的外壁与发热单元之间填充有导热材料。

根据本发明的第二个方面，本发明提出了一种用于上述高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法的微型毛细管反应器。根据本发明的实施例，该微型毛细管反应器包括：

加热毛细管，所述加热毛细管进一步包括：

毛细管；

阀门，所述阀门包括第一阀门和所述第二阀门，所述第一阀门和所述第二阀门分别设在所述毛细管的两端，所述第一阀门和所述第二阀门控制所述毛细管的密闭状态；

金属管，所述金属管套设在所述毛细管外且位于所述第一阀门和所述第二阀门之间，所述金属管的内表面与所述毛细管的外表面之间填充有导热材料；

加热丝，所述加热丝缠绕在所述金属管外表面且所述加热丝表面包覆有绝缘层；

热敏电阻，所述热敏电阻设在所述金属管的中部并通过所述绝缘层表面的小孔与所述金属管接触；

加热控制器，所述加热控制器包括控制器和功率放大器，所述控制器通过所述功率放大器与所述加热毛细管相连。

根据本发明上述实施例的微型毛细管反应器，对酸性溶液进行加热时，可以利用毛细管盛装酸性溶液、利用第一阀门和第二阀门对盛装酸性溶液后的毛细管进行密闭、利用加热丝通过金属管间接对毛细管内的酸性溶液进行加热、在金属管的内表面与毛细管的外表面之间填充导热材料来提高传热效率、利用热敏电阻反馈实时加热温度，且功率放大器通过接受控制器的信号控制电路的通道，实现对毛细管加热的启停。由此，可以快速使酸性溶液达到高温高压状态，以实现蛋白质的快速水解。

在本发明的一些实施例中，所述毛细管为高分子聚合物毛细管，所述阀门包括螺丝和卡管，所述卡管具有与所述螺丝相匹配的螺纹，所述卡管套设在所述毛细管的两端且所述螺丝通过所述螺纹与所述卡管相连。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明一个实施例的高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法的流程图。

图2是根据本发明一个实施例的高温高压状态下的蛋白质快速水解的机理图。

图3是根据本发明一个实施例的微型毛细管反应器的结构示意图。

图4是根据本发明实施例1的重组人泛素蛋白的氨基酸指纹图谱。

图5是根据本发明实施例1对应图4的重组人泛素蛋白的水解结果质谱图。

图6是根据本发明实施例2的牛血清蛋白的氨基酸指纹图谱。

图7是根据本发明实施例2对应图6的牛血清蛋白的水解结果质谱图。

图8是根据本发明实施例3的重组结核抗原Esat-6蛋白的氨基酸指纹图谱。

图9是根据本发明实施例3对应图8的重组结核抗原Esat-6蛋白的水解结果质谱图。

图10是根据本发明实施例4的重组结核抗原Cfp-10蛋白的氨基酸指纹图谱。

图11是根据本发明实施例4对应图8的重组结核抗原Cfp-10蛋白的水解结果质谱图。

图12是根据本发明实施例5对应图4的重组人泛素蛋白的水解结果质谱图。

图13是根据本发明实施例6对应图4的重组人泛素蛋白的水解结果质谱图。

图14是根据本发明对比例1对应图4的重组人泛素蛋白的水解结果质谱图。

图15是根据本发明对比例2对应图4的重组人泛素蛋白的水解结果质谱图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

根据本发明的第一个方面，本发明提出了一种高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法。根据本发明的实施例，参考图1，该方法包括：(1)将蛋白质样品与酸混合配制酸性溶液，其中蛋白质样品中含有天冬氨酸；(2)于密闭环境中将酸性溶液加热至高温高压状态，以便使蛋白质样品水解；(3)采用高分辨质谱仪对步骤(2)得到的水解液进行质谱分析。该方法不仅步骤简单、处理快速、引入杂质少且成本低廉，还可以通过鉴定蛋白质的特异性水解片段得到原始蛋白序列信息，具体地，该自下而上的蛋白质分析方法可以作为蛋白质特征肽段、以及指纹图谱分析的有力工具，从而特异性地鉴定目标蛋白。

下面参考图1-2对本发明上述实施例的高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法进行详细描述。

S100:将蛋白质样品与酸混合配制酸性溶液

根据本发明的实施例，将蛋白质样品与酸混合配制酸性溶液，其中蛋白质样品中含有天冬氨酸。

根据本发明的一个具体实施例，酸性溶液的pH值可以为1～5，发明人发现，在酸性环境下，尤其是在弱酸环境下加热蛋白质，无需引入蛋白酶即可使其肽链上天冬氨酸的C-末端和N-末端位点发生断裂，而若酸性溶液的酸度过低，蛋白质的水解效率也较低，若酸度过大，又容易导致蛋白质发生其它类型的结构变化，例如在非特异性氨基酸位点过度水解等，影响后续质谱分析的准确性。本发明中通过控制酸性溶液的pH值为1～5，既可以显著提高蛋白质的水解效率，又可以大大降低蛋白质水解过程中的副反应，从而使分析结果准确、可靠。优选地，酸性溶液的pH值可以为2～3，由此可以进一步降低蛋白质水解过程中的副反应，进而进一步提高后续分析结果的准确性和可靠性。

根据本发明的再一个具体实施例，本发明中酸的种类并不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择，只需满足酸能够在水中电离或部分电离出氢离子即可。例如，酸可以为无机酸和/或有机酸，再例如，无机酸可以为氯化氢等，有机酸可以为甲酸等。

根据本发明的又一个具体实施例，本发明中蛋白质样品的种类和形态并不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择，只需满足蛋白质样品中含有天冬氨酸即可。如蛋白质样品可以为粉末状态或溶液状态；蛋白质样品可以为重组人泛素蛋白、牛血清蛋白、重组结核抗原Esat-6蛋白、重组结核抗原Cfp-10蛋白、核糖核酸酶或辣根过氧化氢酶等。

根据本发明的又一个具体实施例，若蛋白质样品中含有分子内二硫键，在配制酸性溶液之前可以预先将蛋白质样品与还原剂混合，以便切断蛋白质样品中的二硫键，由此可以进一步提高后续分析结果的准确性和可靠性。

S200:于密闭环境中将酸性溶液加热至高温高压状态，使蛋白质样品水解

根据本发明的实施例，于密闭环境中将酸性溶液加热至高温高压状态，以便使蛋白质样品水解。发明人发现，在酸性环境下加热蛋白质，无需引入蛋白酶即可使其肽链上天冬氨酸的前后位点发生断裂，由此不仅可以避免产生蛋白酶自溶物等大分子有机物，同时还可以避免引入蛋白酶制备过程中存在的无机盐等不利于质谱检测的非挥发性杂质；与常规酶解的固定化酶等技术相比，本发明无需对水解反应装置进行前处理，水解装置搭建简单且重复性好；此外，与常规酶解温度37℃和常规酶解时间12-24h相比，本发明中通过使蛋白质在高温高压状态下水解，酶解效率大幅度提升，显著地减少了时间的消耗。

根据本发明的一个具体实施例，参考图2，蛋白质样品中天冬氨酸的N末端和C末端在酸性条件下发生特异性裂解的机理为：天冬氨酸的残基含有游离的羧基，在酸性条件下游离羧基和与天冬氨酸相邻的两侧肽键(-CO-NH-)部分反应，产生五元环/六元环中间体，随后肽键发生断裂，实现蛋白质的水解。其中，图2中，“Asp-X”和“X-Asp”中的“Asp”代表天冬氨酸，“X”代表任意氨基酸，“R₁”和“R₂”各自代表氨基酸链。

根据本发明的再一个具体实施例，于密闭环境中对酸性溶液加热时，加热时间可以不大于20min，发明人发现，若加热时间过长，容易导致蛋白质样品发生其它副反应，例如过度水解等，与常规酶解时间12-24h相比，本发明中通过控制加热时间不大于20min，可以在短时间内将酸性溶液加热至高温高压状态，在使蛋白质水解发生在天冬氨酸的前后位点的前提下，显著提高蛋白质的水解效率。优选地，加热时间可以为1～4min，由此不仅可以进一步避免蛋白质样品发生副反应，还能进一步提高蛋白质的水解效率，保证后续分析结果的准确性和可靠性。

根据本发明的又一个具体实施例，本发明中所述的高温高压状态指的是溶液的温度高于其在大气压下的沸点，但由于密闭空间中产生数倍于大气压的高压仍保持液态的一种亚临界状态。

根据本发明的又一个具体实施例，酸性溶液在高温高压状态下的温度可以为105～200℃，压力可以为1.2～16atm(1atm指一个标准大气压)，例如温度可以105℃、115℃、125℃、135℃、145℃、155℃、165℃、175℃、185℃或195℃等，压力可以为相应温度对应的压力，只需满足1.2～16atm即可，发明人发现，升高酸性溶液的温度和压力可以显著提高蛋白质的水解效率，但若酸性溶液的温度过高或压力过大，同样会导致蛋白质样品发生过度水解等副反应，本发明中通过控制上述温度和压力条件，可以有效避免蛋白质样品发生副反应并显著提高蛋白质的水解效率，保证后续分析结果的准确性和可靠性。优选地，酸性溶液在高温高压状态下的温度可以为150～200℃，压力可以为5～16atm，由此可以在有效避免蛋白质样品发生副反应的前提下进一步提高水解效率。

根据本发明的又一个具体实施例，可以将酸性溶液置于微型密闭反应容器中进行加热，微型密闭反应容器可以为微型毛细管反应器或微型高压反应釜。其中，优选微型密闭反应容器能够承载的内压不低于20atm。

根据本发明的又一个具体实施例，微型毛细管反应器中毛细管的材质可以为柔性毛细管或刚性毛细管，其中柔性毛细管可以为高分子聚合物毛细管，例如聚四氟乙烯等毛细管，刚性毛细管可以为不锈钢毛细管。进一步地，毛细管可以为细长型毛细管，毛细管的一端可以通过连接注射器或注射泵吸收酸性溶液，毛细管的两端可以通过加压方式进行密闭，例如，高分子聚合物毛细管可以采用径向加压夹紧的方式进行密闭，不锈钢毛细管可以采用轴向加压阻塞的方式进行密闭。

根据本发明的又一个具体实施例，将酸性溶液置于微型密闭反应容器中进行加热时可以采用接触式加热法或非接触式加热法对微型密闭反应容器进行加热，其中，接触式加热法的热源可以为电热陶瓷片或电阻丝等，非接触式加热法的热源可以为火源或热风机等。优选地，采用非接触式加热法时，毛细管的外壁与发热单元之间可以填充有导热材料，由此可以进一步提高传热效率。

根据本发明的又一个具体实施例，毛细管的内径可以不大于4mm，长度可以不大于20cm，优选地，毛细管的内径可以不大于2mm，长度可以不大于10cm。由此可以进一步提高加热效率，大大缩短整个工艺流程的耗时。

S300:采用高分辨质谱仪对得到的水解液进行质谱分析

根据本发明的实施例，可以采用高分辨质谱仪对得到的水解液进行质谱分析，其中，质谱分析为二级串联质谱。

根据本发明的一个具体实施例，可以预先将得到的水解液与极性溶剂混合后再采用高分辨质谱仪进行分析，水解后的蛋白质自身携带的电荷较少，通过将水解液与极性溶剂(如甲醇)混合，可以使水解后的蛋白质片断携带的电荷增多，从而显著提高制备质谱检测时的信噪比，实现对蛋白质样品高通量和高灵敏度的结构分析。

根据本发明的再一个具体实施例，水解液中蛋白质的质量浓度为1～200ppm，由此可以有效避免水解液中蛋白质含量过多对质谱仪和分析结果的不利影响。

根据本发明的又一个具体实施例，质谱分析的进样方式可以为纳流电喷雾离子源，在采用电喷雾离子源进样方式时具有高通量和高信噪比等特性，由此可以显著地提升检测灵敏度，对原始蛋白质含量的需求降低，适用于微量样品的检测与鉴定，实现对蛋白质样品高通量和高灵敏度的结构分析。

发明人发现，在酸性环境下加热蛋白质，无需引入蛋白酶即可使其肽链上天冬氨酸的前后位点发生断裂，由此不仅可以避免产生蛋白酶自溶物等大分子有机物，同时还可以避免引入蛋白酶制备过程中存在的无机盐等不利于质谱检测的非挥发性杂质；与常规酶解的固定化酶等技术相比，本发明无需对水解反应装置进行前处理，水解装置搭建简单且重复性好；此外，与常规酶解温度37℃和常规酶解时间12-24h相比，本发明中通过使蛋白质在高温高压状态下水解，酶解效率大幅度提升，显著地减少了时间的消耗。综上所述，本发明上述实施例的高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法不仅步骤简单、处理快速、引入杂质少且成本低廉，还可以通过鉴定蛋白质的特异性水解片段得到原始蛋白序列信息，具体地，该自下而上的蛋白质分析方法可以作为蛋白质特征肽段、以及指纹图谱分析的有力工具，从而特异性地鉴定目标蛋白。

综上所述，本发明上述实施例的高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法可以具有以下有益效果：(1)相比与蛋白酶解技术，本发明使用酸性溶液作为反应体系，无需引入蛋白酶等大分子有机物，避免产生蛋白酶自溶物等大分子有机物，同时避免引入蛋白酶制备过程中存在的无机盐等不利于质谱检测的杂质；(2)与常规酶解温度37℃和常规酶解时间12-24h相比，本发明中通过使蛋白质在高温高压状态下水解，酶解效率大幅度提升，显著地减少了时间的消耗；(3)与常规酶解的固定化酶等技术相比，本发明无需对水解反应装置进行前处理，水解装置搭建简单且重复性好；(4)质谱分析时的进样方式可以为纳流电喷雾离子源，相比于传统基质辅助激光解离技术，可以显著地提升检测灵敏度，对原始蛋白质含量的需求降低，适用于微量样品的检测与鉴定。

根据本发明的第二个方面，本发明提出了一种用于上述高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法的微型毛细管反应器。根据本发明的实施例，如图3所示，该微型毛细管反应器包括加热毛细管100和加热控制器200。

其中，加热毛细管100进一步包括：毛细管110、阀门、金属管130、加热丝140和热敏电阻160，其中，阀门包括第一阀门121和第二阀门122，第一阀门121和第二阀门122分别设在毛细管110的两端，第一阀门121和第二阀门122控制毛细管110的密闭状态；金属管130套设在毛细管110外且位于第一阀门121和第二阀门122之间，金属管130的内表面与毛细管110的外表面之间填充有导热材料(未示出)；加热丝140缠绕在金属管130外表面且加热丝140表面包覆有绝缘层150；热敏电阻160设在金属管130中部的绝氧层150外并通过绝缘层150表面的小孔与金属管130直接接触；加热控制器200包括控制器210和功率放大器220，控制器210通过功率放大器220与加热毛细管100相连。采用该微型毛细管反应器对酸性溶液进行加热时，可以利用毛细管盛装酸性溶液、利用第一阀门和第二阀门对盛装酸性溶液后的毛细管进行密闭、利用加热丝通过金属管间接对毛细管内的酸性溶液进行加热、在金属管的内表面与毛细管的外表面之间填充导热材料来提高传热效率、利用热敏电阻反馈实时加热温度，且功率放大器通过接受控制器的信号控制电路的通道，实现对毛细管加热的启停。由此，可以快速使酸性溶液达到高温高压状态，以实现蛋白质的快速水解。

根据本发明的一个具体实施例，毛细管110可以为高分子聚合物毛细管，阀门包括螺丝和卡管(未示出)，卡管具有与螺丝相匹配的螺纹，卡管套设在毛细管的两端且螺丝通过螺纹与卡管相连，如需阀门紧闭，则旋转螺丝压迫软管，阻断液体流通；如需阀门打开，则反向旋转螺丝，软管在弹性力作用下回复，允许液体流通。

根据本发明的再一个具体实施例，绝缘层150可以为绝缘胶带，绝缘胶带能够有效起到高温下辅助贴合的作用，其中，绝缘层150可以分为内层和外层，内层的绝缘胶带用于隔绝加热丝140与金属管130，防止系统电路短路，可以使电阻丝沿内层绝缘胶带缠绕在金属管130上，扩大受热面积；外层的绝缘胶带用于封装加热丝140，并有一定的保温作用。

根据本发明的又一个具体实施例，毛细管的内径可以不大于4mm，长度可以不大于20cm，优选地，毛细管的内径可以不大于2mm，长度可以不大于10cm。由此可以进一步提高加热效率，大大缩短整个工艺流程的耗时。

根据本发明的又一个具体实施例，热敏电阻160可以为玻璃封装的负温度系数热敏电阻，在25～200℃条件下，其电阻变化范围可以在500KΩ～5KΩ。

根据本发明的又一个具体实施例，控制器210的中央控制单元可以为单片机，单片机接收热敏电阻的电压信号，经运算后通过PWM调制方波的方式控制功率放大器，功率放大器连接加热丝进行加热。

根据本发明的又一个具体实施例，单片机可以使用ATMega328P，并配套ArduinoUNO型电路板。该型号单片机的工作电压5V，内部采用7805型稳压管稳定工作电压。板卡含模拟采样端口，其精度为10位。通过USB串口通讯协议连接计算机进行程序烧写和参数监测。使用开源软件Arduino进行c语言程序编写逻辑控制算法，系统采样率10Hz。采用闭环PI反馈调节，最终效果达到25s内达到预设温度，5min内温度控制精度在±3℃内。

根据本发明的又一个具体实施例，功率放大器可以含L298n型芯片，通过PWM调制方波形式控制输出端口的电路通断。

需要说明的是，上述针对微型毛细管反应器所描述的特征和方法同样适用于上述高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

一般方法：

高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法，其具体的分析流程如下所述：

(1)将待处理的蛋白质样品粉末(或溶液)加入稀释液中稀释。如待处理蛋白质为溶液状态，也可以先使用氮气流吹干，去除挥发性杂质，随后加入稀释液中进行稀释。稀释液指体积分数2.5％的甲酸-水溶液。

(2)将上述步骤得到的稀释后的蛋白溶液加至微型毛细管反应器中进行加热，预先设定反应温度为105～200℃，加热时间不大于20min。

(3)将上述步骤得到的溶液取出后稀释。稀释标准为适合于质谱检测的蛋白质溶液浓度。以蛋白质质量分数计算，一般控制在200ppm内。随后加入与上述待测物溶液等体积的纯甲醇，得到待测物。加入甲醇能够促进多肽分子的电离，提升电喷雾离子源的离子化效率，增强质谱的信噪比。

微型毛细管反应器

采用的微型毛细管反应器分为加热毛细管和加热控制器两部分。

加热毛细管由以下部分组成：

毛细管用于承装反应体系，毛细管使用聚四氟乙烯材料，熔点高于210℃。毛细管外径为1.6mm，内径为0.8mm，长度30cm。实际使用时，毛细管一端连接注射针泵，自另一侧进行吸取溶液和推出溶液的操作。

阀门用于在反应期间夹持软管两端加压阻断液体流通。在溶液加热期间，体系温度将上升至150℃，此时毛细管内部的水溶液将处于高温高压的状态，内部压力可达10atm。阀门由螺丝和卡管组成，螺丝为直径2mm铜制螺丝，卡管指具有一个2mm侧向螺纹孔的内径3mm的铜管，将柔性毛细管穿过铜管，并装配上述螺丝，如需阀门紧闭，则旋转螺丝压迫软管，阻断液体流通；如需阀门打开，则反向旋转螺丝，软管在弹性力作用下回复，允许液体流通。

金属管套于毛细管外侧以使毛细管均匀受热，金属管的材质为304型不锈钢圆柱形管，外径为2.5mm，内径为2mm，长度75mm。高导热性材料填充在金属管和柔性毛细管的间隙处，以使热量传递更加均匀。高导热材料选用导热硅脂，其导热系大于4.15W/m·k。

加热丝作为发热材料用于使体系升温，并用绝缘胶带进行封装。绝缘胶带使用聚酰亚胺材料，其分解温度高于400℃，能够有效起到高温下辅助贴合的作用。绝缘胶带106分为内层和外层，内层的绝缘胶带用于隔绝加热丝与金属管，防止系统电路短路；使用约20cm的电阻丝沿内层绝缘胶带缠绕在金属管上，扩大受热面积；外层的绝缘胶带用于封装加热丝，并有一定的保温作用。加热丝选用直径0.25mm的Ni80Cr20型镍铬合金电阻丝，其电阻率为22.21Ω/m，总电阻值为10Ω。

热敏电阻紧密贴合在金属管的中央位置，用于反馈实时加热温度。所用热敏电阻为玻璃封装的负温度系数热敏电阻，在25～200℃的温度变化范围下，其电阻变化范围在500KΩ～5KΩ。

加热控制器由以下部分组成：

控制器使用单片机作为中央控制单元。具体使用ATMega328P，并配套Arduino UNO型电路板。该型号单片机工作电压5V，内部采用7805型稳压管稳定工作电压。板卡含模拟采样端口，其精度为10位。通过USB串口通讯协议连接计算机进行程序烧写和参数监测。使用开源软件进行c语言程序编写温度闭环控制算法，系统采样率为10Hz。

功率放大器含L298n型芯片。其接收到控制器发出的方波，通过PWM调制的方式控制芯片输出端口的电路通断。系统使用12V稳压电源进行供电。系统最大功率11W，闲置功率1W。系统开启后，25s内可达到预设温度，5min内温度漂移在±3℃内。

实施例1

重组人泛素蛋白在弱酸环境下快速特异性水解结果分析

重组人泛素蛋白是含有76个氨基酸的单链蛋白质，分子量为8.57KDa。该蛋白含有5个天冬氨酸位点，在图4中加粗标注。在弱酸水解的条件下可碎裂为6条特异性片段。针对该蛋白的分析方法如下：

(a)取2mg/ml的重组人泛素蛋白溶液5.2μL，加入体积分数2.5％的甲酸水溶液20.8μL震荡摇匀，得到26μL的反应体系。在此反应体系中，蛋白质浓度为0.4mg/mL，甲酸体积分数为2％，反应前pH值为2.2；

(b)将上述反应体系通过注射泵吸入微型毛细管反应器中，预设加热温度150℃，在密封条件下加热2min。达到预设加热温度时，管内压力不超过6atm。随后关闭加热装置，降温后取出溶液；

(c)将上述步骤得到的溶液加入26μL的甲醇，充分混合；

(d)将上述步骤得到的溶液通过nanoESI-Q-TOF-MS进行检测，并分析结果。

上述步骤得到的质谱图见图5，从图5可以看出，泛素蛋白经过弱酸环境下的特异性水解，在Asp-X和X-Asp位点发生断裂，新产生了6条特异性肽段，图4中标注的多肽碎片峰含有全部6条特异性肽段，并具有高信噪比。每条肽段均经过MS/MS二级谱图检测。其中部分多肽的水解结果在质谱图上有△m/z＝-18Da的缺失，是由于局部温度过高导致的肽段内部脱去一个水(H₂O)分子，这也说明了不能无限制提升反应温度以加速反应的进行。

实施例2

牛血清蛋白在弱酸环境下快速特异性水解结果分析

牛血清蛋白是含有607个氨基酸的单链蛋白质，分子量约为66.7KDa。该蛋白中还含有12条二硫键，以维持蛋白质的高级结构。该蛋白含有40个天冬氨酸位点，在图6中加粗标注。在弱酸水解的条件下可碎裂为36条特异性多肽片段。由于牛血清蛋白中含有多条分子内二硫键，需要在反应前进行切断，从而进一步进行多肽序列分析。因此，需要在针对该蛋白的特异性水解分析方法的同时加入二硫键切断的前处理步骤。具体步骤如下：

(a)取牛血清蛋白冻干粉2.81mg，并加入1mL水，配置成2.81mg/mL的蛋白溶液；

(b)取上述溶液80μL，加入60mM的二硫苏糖醇水溶液10μL，加入体积分数10％的甲酸水溶液22.5μL，震荡摇匀，取出26μL作为反应体系。在此反应体系中，蛋白质浓度为2.00mg/mL，二硫苏糖醇浓度为5.33mM，甲酸体积分数为2％，反应前pH值为2.2；

(c)将上述反应体系通过注射泵吸入微型毛细管反应器中，预设加热温度150℃，在密封条件下加热5min。达到预设加热温度时，管内压力不超过6atm。随后关闭加热装置，降温后取出溶液；

(d)将上述步骤得到的溶液加入234μL的甲醇，充分混合；

(e)将上述步骤得到的溶液通过nanoESI-Q-TOF-MS进行检测，并分析结果。

上述步骤得到的质谱图见图7。其中步骤(b)中引入的二硫苏糖醇是一种高效的还原剂，常用于将蛋白质中的二硫键还原为巯基(-SH)。在传统蛋白酶切的方法中，蛋白的前处理需要使用二硫苏糖醇溶液或其他还原剂用于切断蛋白质中的二硫键，常用的实验条件为50℃水浴加热15min～1h。本分析方法提出了将二硫苏糖醇溶液混合于反应体系中，直接进行特异性酸水解反应，较传统的样品前处理方法进行了步骤和时间上的简化。

从图7中可以看出，牛血清蛋白经过弱酸环境下的特异性水解，在Asp-X和X-Asp位点发生断裂，新产生了25条特异性肽段，在图6中使用实下划线进行了标注，并在图6的质谱图中标注的多肽碎片峰。通过对图6的计算，实验结果覆盖了53.5％的氨基酸序列。这说明本方法对于牛血清蛋白等长链多肽也有很好的切割作用，可以用大质量数蛋白的鉴定。

实施例3

重组结核抗原Esat-6蛋白在弱酸环境下快速特异性水解结果分析。

结核杆菌是结核病的致病源，通过检测结核杆菌分泌的Esat-6和Cfp-10蛋白，是确诊生物体是否致病的有效手段。

重组结核抗原Esat-6蛋白是含有95个氨基酸的单链蛋白质，并在生产环节中引入了端部的标签修饰，分子量为11.1kDa。该蛋白含有2个天冬氨酸位点，在图8中加粗标注。在弱酸水解的条件下可碎裂为3条特异性片段。针对该蛋白的分析方法如下：

(a)取1.50mg/ml的重组结核抗原Esat-6蛋白溶液5.2μL，加入体积分数2.5％的甲酸水溶液20.8μL震荡摇匀，得到26μL的反应体系。在此反应体系中，蛋白质浓度为0.30mg/mL，甲酸体积分数为2％，反应前pH值为2.2；

(b)将上述反应体系通过注射泵吸入微型毛细管反应器中，预设加热温度150℃，在密封条件下加热2min。达到预设加热温度时，管内压力不超过6atm。随后关闭加热装置，降温后取出溶液；

(c)将上述步骤得到的溶液加入26μL的甲醇，充分混合；

(d)将上述步骤得到的溶液通过nanoESI-Q-TOF-MS进行检测，并分析结果。

上述步骤得到的质谱图见图9，从图9可以看出，Esat-6蛋白经过弱酸环境下的特异性水解，在Asp-X和X-Asp位点发生断裂，新产生了3条特异性肽段，图9中标注的多肽碎片峰含有全部3条特异性肽段谱峰，及其相应的结合金属离子的谱峰，并具有高信噪比。每条肽段均经过MS/MS二级谱图检测。其中#2多肽的水解结果在质谱图上有△m/z＝-18Da的缺失，是由于局部温度过高导致的肽段内部脱去一个水(H₂O)分子所致。

实施例4

重组结核抗原Cfp-10蛋白在弱酸环境下快速特异性水解结果分析。

重组结核抗原Cfp-10蛋白是含有100个氨基酸的单链蛋白质，并在生产环节中引入了端部的标签修饰，分子量为11.7kDa。该蛋白含有5个天冬氨酸位点，在图10中加粗标注。在弱酸水解的条件下可碎裂为6条特异性片段。针对该蛋白的分析方法如下：

(1)取2.70mg/ml的重组结核抗原Esat-6蛋白溶液5.2μL，加入体积分数2.5％的甲酸水溶液20.8μL震荡摇匀，得到26μL的反应体系。在此反应体系中，蛋白质浓度为0.54mg/mL，甲酸体积分数为2％，反应前pH值为2.2；

(2)将上述反应体系通过注射泵吸入微型毛细管反应器中，预设加热温度150℃，在密封条件下加热2min。达到预设加热温度时，管内压力不超过6atm。随后关闭加热装置，降温后取出溶液；

(3)将上述步骤得到的溶液加入52μL的甲醇，充分混合；

(4)将上述步骤得到的溶液通过nanoESI-Q-TOF-MS进行检测，并分析结果。

上述步骤得到的质谱图见图11，从图11可以看出，Cfp-10蛋白经过弱酸环境下的特异性水解，在Asp-X和X-Asp位点发生断裂，新产生了4条特异性肽段，图11中标注的多肽碎片峰含有肽链中部的4条特异性肽段谱峰，并具有高信噪比。每条肽段均经过MS/MS二级谱图检测。

实施例5

与实施例1的区别在于：

(b)将上述反应体系通过注射泵吸入微型毛细管反应器中，预设加热温度200℃，在密封条件下加热2min，压力控制为16atm，取出溶液；

上述步骤得到的质谱图见图12。在图12中，以P1、P2分别标记泛素蛋白通过特异性水解得到的碎片肽段#6和#4，以S1、S2、S3标记原始泛素蛋白10+、9+和8+的多电荷峰。通过对比图5相应位置的峰的相对强度，可以看出图12中P1、P2峰较S1、S2、S3峰的强度比更高。因此可以得到以下结论：相比于实施例1，加热温度为200℃时，泛素蛋白的水解效率更高。

实施例6

与实施例1的区别在于：

(b)将上述反应体系通过注射泵吸入微型毛细管反应器中，预设加热温度105℃，在密封条件下加热8min，压力控制为1.2atm，取出溶液；

上述步骤得到的质谱图见图13。在图13中，以P1、P2分别标记泛素蛋白通过特异性水解得到的碎片肽段#6和#4，以S1、S2、S3标记原始泛素蛋白10+、9+和8+的多电荷峰。通过对比图5和图13相应位置的P1、P2峰较S1、S2、S3峰的强度比，可以看出：相比于实施例1，加热温度为105℃时，蛋白出现特异性水解现象，但水解效率较差。通过较长时间的加热，蛋白已经开始出现部分水解片段，如P1标记泛素单边的特异性碎片肽段#6。但是在此条件下水解效率较低，P2标记的碎片肽段#4位置并没有产生显著的肽段碎裂结果。以S1、S2、S3标记原始泛素蛋白10+、9+和8+的多电荷峰在质谱图中表现为相对离子强度最高的峰。

对比例1

与实施例1的区别在于：

(b)将上述反应体系通过注射泵吸入微型毛细管反应器中，预设加热温度50℃，在密封条件下加热2min，压力控制为1atm，取出溶液；

上述步骤得到的质谱图见图14。在图14中，以P1、P2分别标记泛素蛋白通过特异性水解得到的碎片肽段#6和#4，以S1、S2、S3标记原始泛素蛋白10+、9+和8+的多电荷峰。可以看出，在本对比例的热解条件下，原始蛋白没有显著的特异性解离。这说明较低的温度不利于蛋白进行特异性水解。

对比例2

与实施例1的区别在于：

(b)将上述反应体系通过注射泵吸入微型毛细管反应器中，预设加热温度230℃，在密封条件下加热2min，压力控制为28atm，取出溶液；

上述步骤得到的质谱图见图15。在图15中，以P1、P2分别标记泛素蛋白通过特异性水解得到的碎片肽段#6和#4，以S1、S2、S3标记原始泛素蛋白10+、9+和8+的多电荷峰。相比于实施例5的结果，P1、P2峰的相对强度相比于S1、S2、S3进一步提升，较图12表现出了体系反应效率有进一步提升。但加热温度提升至230℃时，过高的温度和压力对本反应器尤其是聚四氟乙烯材质的微型毛细管寿命造成影响。因此，此装置不宜长时间工作在230℃条件下，应控制加热温度在聚四氟乙烯材料的软化点以下30度，保证加热装置的安全性和复现性。

结合以上蛋白质的应用实例，本发明中在弱酸环境下快速特异性水解蛋白质的分析方法是一种新型、快速的蛋白鉴定的特异性检测方法。该方法对于不同来源、不同长度蛋白有很好的兼容性，并可用于疾病的蛋白标记物检测。相比于传统的蛋白酶切技术大幅度缩短了反应时间；避免了引入蛋白酶自溶产物、酶切所需高浓度盐环境等杂质，无需分离和富集的手段即可通过纳流喷雾离子源进行检测，同时提升了反应产物检测结果的信噪比。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。