阅读说明：本技术 一种番鸭腺病毒2型、3型精制卵黄抗体及其制备方法 (Muscovy duck adenovirus type 2 and type 3 refined egg yolk antibody and preparation method thereof ) 是由 罗济冠 常娓娓 王学波 刘宁 郭春丽 罗展 徐丽娜 李朝阳 于 2019-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种番鸭腺病毒2型、3型精制卵黄抗体及其制备方法,其方法为：用鸭腺病毒2型、3型二联灭活疫苗免疫健康产蛋鸡,当所产鸡蛋卵黄中番鸭腺病毒2型、3型琼扩抗体效价≥1:32时收集高免鸡蛋；从高免鸡蛋中分离卵黄并进行第一次灭活；将第一次灭活的卵黄液加入到酸化反应罐酸化提取,将酸化提取液离心分离后取上清液加入辛酸进行第二次灭活,之后经深滤后向过滤液中加入甲醛溶液进行第三次灭活；经浓度调节、pH调节和除菌过滤后制得番鸭腺病毒2型、3型精制卵黄抗体。利用该方法制备的番鸭腺病毒2型、3型精制卵黄抗体免疫番鸭后,通过番鸭腺病毒2型和3型的攻毒试验,对雏鸭鸭腺病毒2型、3型均能有效较好的保护效果。(The invention discloses Muscovy duck adenovirus type 2 and type 3 refined egg yolk antibodies and a preparation method thereof, wherein the method comprises the following steps: immunizing healthy laying hens with the duplex inactivated vaccine of duck adenovirus type 2 and type 3, and collecting high-immunity eggs when the titer of the muscovy duck adenovirus type 2 and type 3 agaropectin in the egg yolk of the laid eggs is more than or equal to 1: 32; separating yolk from the high-immunity eggs and inactivating for the first time; adding the egg yolk liquid subjected to the first inactivation into an acidification reaction tank for acidification and extraction, performing centrifugal separation on an acidified extracting solution, taking supernate, adding octanoic acid into the supernate for second inactivation, performing deep filtration, and adding a formaldehyde solution into a filtrate for third inactivation; and (3) preparing the Muscovy duck adenovirus type 2 and type 3 refined egg yolk antibodies after concentration regulation, pH regulation, sterilization and filtration. After the Muscovy duck adenovirus type 2 and type 3 refined egg yolk antibodies prepared by the method are used for immunizing Muscovy ducks, the Muscovy duck adenovirus type 2 and type 3 virus challenge tests show that the Muscovy duck adenovirus type 2 and type 3 refined egg yolk antibodies can effectively and well protect duckling adenovirus type 2 and type 3.)

一种番鸭腺病毒2型、3型精制卵黄抗体及其制备方法

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种番鸭腺病毒2型、3型精制卵黄抗体及其制备方法。

背景技术

禽腺病毒(avian adenovirus)是家禽常见的传染病病原之一，可引起鸡、鸭、鹅等多种家禽或野禽的临床和病理症候群，包括心包积水、肝炎、再生障碍性贫血、出血、轻度呼吸道疾病等多种禽类的病症。

鸭(Anas platyrhynchos domestica)源腺病毒包括富AT腺病毒属的鸭源腺病毒A型(Duck atadenovirus A,DAdV-A)和禽腺病毒属的鸭源腺病毒B型 (DAdV-B)。DAdV-A即鸭腺病毒1型(Duck adenovirus type 1，DAdV-1)，又称为产蛋下降综合征病毒(Egg dropsyndrome virus,EDSV)，与产蛋下降综合症相关，要引起蛋鸭产蛋量下降。DAdV-B又称为鸭腺病毒2型(DAdV-2)， 1977年从法国番鸭爆发的大规模疾病中分离获得，2011年被命名，感染该病毒的番鸭(Cairna moschata)主要临床表现为消瘦、跛行，直到2014年才利用高通量测序技术获得全基因组序列，随后ICTV将其科学命名为DAdV-B。

近年来，广东、福建、安徽、浙江等番鸭饲养区流行一种以肝脏肿大、表面出血以及颜色变淡为特征的新发疫病，俗称番鸭“白肝病”。经病原的分离鉴定及病毒人工感染试验，初步表明该病病原为DAdV-2和另一种新型番鸭腺病毒，有专家将这种新型腺病毒命名为鸭腺病毒3型(Duck adenovirus type 3，DAdV-3)，但该命名尚未被国际病毒分类委员会(ICTV)接受。通过对该新型番鸭腺病毒的流行病学调查，发现该病在我国几乎在所有番鸭养殖区域都有流行，给番鸭养殖业造成较大的经济损失。目前，国内外尚无有效预防和治疗番鸭腺病毒2型和新型腺病的商品化疫苗(或抗体)，研制安全有效的疫苗和抗体迫在眉睫。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供番鸭腺病毒2型、3型精制卵黄抗体及其制备方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明技术方案如下：

一种番鸭腺病毒2型、3型精制卵黄抗体的制备方法，其中，按以下步骤进行：

用预先制备的鸭腺病毒2型、3型二联灭活疫苗免疫健康产蛋鸡，当所产鸡蛋卵黄中番鸭腺病毒2型、3型琼扩抗体效价≥1:32时收集高免鸡蛋；

从高免鸡蛋中分离卵黄并进行第一次灭活；

将第一次灭活的卵黄液加入到酸化反应罐进行酸化提取，将酸化提取液离心分离后取上清液加入辛酸进行第二次灭活，之后经深层过滤后向过滤液中加入甲醛溶液进行第三次灭活；

超滤膜过滤后加入吐温-80调节浓度，并调节pH值为6.5-7.0后进行除菌过滤，制得番鸭腺病毒2型、3型精制卵黄抗体。

所述的番鸭腺病毒2型、3型精制卵黄抗体的制备方法，其中，所述鸭腺病毒2型、3型二联灭活疫苗采用鸭腺病毒DAdV-2-GD株和鸭腺病毒DAdV-3-GD MM株作为灭活抗原制备得到，其中，鸭腺病毒DAdV-2-GD株和鸭腺病毒 DAdV-3-GD MM株均属于腺病毒科(Adenoviridae)，禽腺病毒属 (Aviadenovirus)，DAdV-2-GD株于2016年已保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：V201633；番鸭新型腺病毒GD MM株DAdV-3-GD MM株于2019年7 月30日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo： V201952。保藏地址：中国.武汉.武汉大学。

所述的番鸭腺病毒2型、3型精制卵黄抗体的制备方法，其中，健康产蛋鸡日龄100-150日龄，其中无禽白血病和禽流感感染，鸡白痢和鸡支原体感染阳性率应≤0.1％。

所述的番鸭腺病毒2型、3型精制卵黄抗体的制备方法，其中，用预先制备的鸭腺病毒2型、3型二联灭活疫苗免疫健康产蛋鸡具体步骤如下：

基础免疫：每只鸡胸部肌肉注射鸭腺病毒2型、3型二联灭活疫苗0.5ml；

二次免疫：在基础免疫后14日进行第2次接种，每只鸡胸部肌肉注射 1.0ml；

三次免疫：在二次免疫后14日进行第3次接种，每只鸡胸部肌肉注射 1.0ml；

维持免疫：当卵黄中番鸭腺病毒2型、3型琼扩抗体效价1:64时，维持接种1次，每只鸡胸部肌肉注射疫苗1.0ml；

收蛋：三次强化免疫后10日，抽样取蛋，分离卵黄，提取抗体，番鸭腺病毒2型、3型琼扩抗体效价≥1:32时，收集高免鸡蛋。

所述的番鸭腺病毒2型、3型精制卵黄抗体的制备方法，其中，高免鸡蛋分离卵黄前需要进行蛋壳消毒，具体步骤如下：将高免鸡蛋浸入42℃的0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15min，随后鸡蛋浸入95℃以上的水浴中消毒5秒钟，取出后晾干或吹干备用。

所述的番鸭腺病毒2型、3型精制卵黄抗体的制备方法，其中，从高免鸡蛋中分离卵黄并进行第一次灭活具体为：

手工或机械打蛋，充分除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄，将卵黄液加入巴氏灭菌罐中，加入生理盐水搅拌混匀后，加热至65℃，保温灭活15min，灭活结束后，水浴冷却至30℃以下。

所述的番鸭腺病毒2型、3型精制卵黄抗体的制备方法，其中，将第一次灭活的卵黄液加入到酸化反应罐进行酸化提取具体为：于酸化反应罐中加入相当于原卵黄体积4倍的生理盐水，用1mol/L HCL溶液调节pH值至4.2，并将水温降至2-4℃，然后，将第一次灭活的卵黄液加入，边加边搅拌，4～8℃保温静置4小时。

所述的番鸭腺病毒2型、3型精制卵黄抗体的制备方法，其中，将酸化萃取液冷冻离心，去沉淀，取上清液并向其中加入辛酸至终浓度0.02％，搅拌混匀，室温静置4h，之后采用K型多层板框实现深层过滤澄清，按终浓度0.05％加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，密封60min。

所述的番鸭腺病毒2型、3型精制卵黄抗体的制备方法，其中，用截留分子量为1000KD的超滤膜过滤，加入吐温-80至终浓度0.02％，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值6.8，再用0.22um微孔滤膜过滤，制得番鸭腺病毒2型、3型精制卵黄抗体。

一种番鸭腺病毒2型、3型精制卵黄抗体，其中，采用如上所述的方法制备而成。

有益效果

本发明提供一种番鸭腺病毒2型、3型精制卵黄抗体及其制备方法。本发明基于番鸭腺病毒2型、3型二联疫苗实现番鸭腺病毒2型、3型精制卵黄抗体的制备，利用该方法制备的番鸭腺病毒2型、3型精制卵黄抗体免疫番鸭后，通过番鸭腺病毒2型和3型的攻毒试验，对雏鸭鸭腺病毒2型、3型均能有效较好的保护效果。

附图说明

图1为本发明实施例3中免疫攻毒法效力检验结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1

1高免鸡蛋的生产

1.1产蛋鸡应具有商品蛋鸡的生产性能。

1.1.1无禽白血病和禽流感感染按鸡群0.5％抽样采血，应全部为阴性。

1.1.2鸡白痢和鸡支原体按NY/T536-2002《鸡伤寒和鸡白痢诊断技术》和NY/T553-2002《禽支原体病诊断技术》进行检测，鸡白痢和鸡支原体感染阳性率应≤0.1％。

1.1.3产蛋鸡的饲养管理鸡场建设必须符合兽医卫生防疫规范要求。鸡场应离交通要道500米以上，进、出口道路应分开。场内料、粪道路分开。鸡场进出口应设有消毒池。育雏舍与成鸡舍应设隔离带。此外，鸡场应具备粪污处理设施，实施全进全出制，鸡场饮水应达到卫生标准，饲养人员应卫生健康。

1.1.4鸡的疫病防治根据当地疫病发生的实际情况，按科学免疫程序适时接种相关疫苗，根据情况需要，按常规在饲料中添加抗菌药物防治细菌感染及添加抗球虫药预防球虫感染等。

1.1.5鸡的日龄100～150日龄。

1.2番鸭腺病毒2型、3型二联灭活疫苗免疫

基础免疫每只鸡胸部肌肉注射疫苗0.5ml；

二次免疫在基础免疫后14日进行第2次接种，每只鸡胸部肌肉注射1.0ml；

三次免疫在二次免疫后14日进行第3次接种，每只鸡胸部肌肉注射1.0ml；

维持免疫：当卵黄中番鸭腺病毒2型、3型琼扩抗体效价均达到1:64时，维持接种1次，每只鸡胸部肌肉注射疫苗1.0ml。

收蛋三次强化免疫后10日，抽样取蛋，分离卵黄，提取抗体，番鸭腺病毒2型、3型琼扩抗体效价≥1:32为合格，收集高免鸡蛋，4～8℃贮存，应不超过10日。

实施例2：番鸭腺病毒2型、3型精制卵黄抗体制备

2.1蛋壳消毒

将高免蛋浸入42℃的0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15分钟，蛋壳污染严重的，事先选出，单独消毒并用清水冲洗干净后，再浸泡消毒一次。随后，鸡蛋浸入95℃以上的水浴中消毒5秒钟，取出后晾干或吹干备用。

2.2分离蛋黄手工或机械打蛋，充分除去蛋清(白)、胚盘和系带，收集蛋黄。

2.3灭活I

将蛋黄液加入巴氏灭菌罐中，加入适量的注射用水，搅拌混匀后，加热至65℃，保温灭活15分钟，灭活结束后，水浴冷却至30℃以下。

2.4酸化提取

于酸化反应罐中加入相当于原蛋黄体积4倍的注射用水，用1mol/L HCL溶液调节pH值至4.2，并将水温降至2～4℃，然后，将灭活I的蛋黄液加入，边加边搅拌，4～8℃保温静置4小时。

2.5离心分离将酸化萃取液冷冻离心，去沉淀，取上清液备用。

2.6灭活II加入辛酸至终浓度0.02％，搅拌混匀，室温放置4小时。

2.7深滤用K型多层板框过滤澄清。

2.8灭活III按终浓度0.05％加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，密封60分钟。

2.9超滤除病毒用截留分子量为1000KD的超滤膜过滤除病毒。

2.10调配总混加入吐温-80至终浓度0.02％，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值6.8。

2.11除菌过滤将调配合格的抗体用0.22um微孔滤膜进行过滤除菌，无菌分装，100ml/瓶，即为新型番鸭腺病毒精致卵黄抗体。

实施例3：抗体检验

3.1纯净性按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检测，无细菌、支原体和外源病毒污染。

3.2辛酸及甲醛残留分别按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检测，结果符合规定。

3.3安全性检验5日龄健康雏番鸭10只，每只皮下注射1.0ml，观察14日，全部健活。

3.4效力检验

3.4.1抗体琼扩效价检测按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检测抗体琼扩抗体效价，记录抗体结果。

3.4.2免疫攻毒法用1～3日龄雏番鸭40只，随机分成5组，每组10只，1 组和3组为接种抗体组，每只皮下注射抗体1.0ml，2组和4组为生理盐水免疫 DAdV-2-GD和DAdV-3-GDMM攻毒对照组，5组为为生理盐水免疫对照组，每只皮下注射生理盐水1.0ml，接种抗体后24小时进行攻毒，1组和2组每只番鸭肌肉注射DAdV-2-GD株0.5ml/只，3组和4组每只番鸭肌肉注射DAdV-3-GD MM株0.5ml/只，连续观察10日，比较每组雏番鸭发病死亡情况。

如图1所示，3批番鸭腺病毒2型、3型琼扩抗体效价均不低于1:32，1日龄雏番鸭接种抗体后，3批抗体接种组攻毒后，1组和3组抗体免疫组均能提供 9/10以上的保护，而2组DAdV-2-GD攻毒对照组雏番鸭全部发病，3批攻毒试验每次鸭子死亡3-5只，死亡番鸭以及攻毒后10天存活番鸭剖检均可见肝脏肿大、有出血点或出血斑、肝脏颜色变浅，部分黄染，脾脏肿大出血，肾脏充血肿大。4组DAdV-3-GD MM攻毒对照组雏番鸭全部发病，3批攻毒试验每次鸭子死亡8-10只，死亡番鸭以及攻毒后10天存活番鸭剖检均可见肝脏肿大，有不同程度的出血点或出血斑，十二指肠出血，脾脏肿大出血，胆囊肿大，肾脏充血肿大等典型病变。

综上，本发明制备的鸭腺病毒2型、3型二联抗体免疫番鸭后，通过番鸭腺病毒2型和3型的攻毒试验，对雏鸭鸭腺病毒2型、3型均能有效较好的保护效果。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。