一种抗癌胚抗原的高亲和力纳米抗体及其应用
阅读说明：本技术 一种抗癌胚抗原的高亲和力纳米抗体及其应用 (High-affinity nano antibody for resisting carcinoembryonic antigen and application thereof ) 是由 宋海鹏 于建立 古一 李飞 王欢 刘原源 周宇航 黄琪 李婧婵 于 2016-12-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抗癌胚抗原CEA的高亲和力纳米抗体,所述纳米抗体具有独特的3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3,本发明还公开了所述纳米抗体在制备肿瘤治疗药物中的应用。本发明提供的抗CEA的纳米抗体对CEA抗原具有特异的识别和结合能力,并且对于肿瘤细胞MKN-45具有显著的ADCC效应,而且可以在小鼠体内实现肿瘤的精确成像。(The invention discloses a high-affinity nano antibody for resisting carcinoembryonic antigen CEA, which has unique 3 complementarity determining regions CDR1, CDR2 and CDR3, and also discloses application of the nano antibody in preparing a tumor treatment drug. The anti-CEA nanobody provided by the invention has specific recognition and binding capacity to CEA antigen, has obvious ADCC effect on tumor cells MKN-45, and can realize accurate imaging of tumor in a mouse body.)
技术领域
本发明公开了一种纳米抗体，属于免疫学领域。
背景技术
癌胚抗原(CEA，又称为CEACAM-5或CD66e)是一种具有约180kDa分子量的糖蛋白。CEA是免疫球蛋白超家族的一名成员，并且含有经由糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚与细胞膜连接的7个域。7个域包括单一N端Ig可变域和与Ig恒定域同源的6个域(A1-B1-A2-B2-A3-B3)。CEA最初分类为仅在胎儿组织中表达的蛋白质，现在已经在几种正常成年组织中鉴定出。CEA的过量表达在许多类型的癌症中观察到，包括结肠直肠癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、肝细胞瘤、乳腺癌和甲状腺癌。因此，CEA已经被鉴定为肿瘤相关抗原。CEA容易自细胞表面切割，并直接或经由淋巴系统自肿瘤脱落入血流中。由于此特性，已经使用血清CEA的水平作为临床标志物以诊断癌症并筛选癌症。而且，CEA也已被用作肿瘤标记，测量癌症患者血液中升高的CEA的免疫学测定法已在临床上用于癌症的预后和控制。
更重要的是，CEA已成为用于靶向治疗的潜在有用的肿瘤相关抗原。已经报道的使用CEA靶向免疫治疗癌症主要有2种主要方法。一种方法使用抗CEA抗体引发免疫细胞的溶解活性，特别是通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)，以消除表达CEA的肿瘤细胞。另一种方法是通过抗CEA抗体或抗体片段与例如药物、毒素、放射性核苷酸、免疫调节剂或细胞因子等效应分子缀合，特异性靶向表达CEA的肿瘤细胞，从而发挥效应分子的治疗作用。
目前已经针对CEA生成多种单克隆抗体。Chester等已经自噬菌体展示文库分离出单链抗CEA抗体以在放射性免疫检测和放射性免疫疗法中使用(美国专利No.5,876,691)，随后将抗体人源化(美国专利No.7,232,888)。放射性标记的抗CEA抗体已经在结肠直肠癌患者的临床试验中使用。
在骆驼科动物(骆驼，单峰骆驼和美洲驼)的体内存在着一类仅有重链二聚体抗体H2，其主要是IgG2和IgG3类型。此类抗体由于缺乏轻链，于是将这种抗体称为仅有重链的抗体(heavychain-only-like Antibody，HCAbs)，而它们的抗原结合部位由一个结构域组成，称为VHH区，因此该类抗体也被称为单结构域抗体或者单域抗体(sdAb)。由于该类抗体为去除恒定区后的可变区序列，分子量只有15kD，大约10纳米的直径，因此也被称为纳米抗体(Nbs)。另外，在鲨鱼中也观察到这类单结构域抗体，称为VNAR。这种仅有重链的抗体原来只是作为一种人类B细胞增生性疾病(重链病)的病理形式被人们所认识，这种仅有重链的抗体可能是由于基因组水平的突变和缺失而导致重链CH1结构域不能表达，使得表达出的重链缺乏CH1，从而缺乏与轻链的结合能力，从而形成一种重链二聚体。
相对于常规的四链抗体的scFv而言，纳米抗体在亲和力方面与其对应的scFv相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及DNA操作、文库构建和3-D结构测定的容易性方面超越scFv。
纳米抗体有来源于成年骆驼体内HCAbs的最小的功能性抗原结合片段，具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力，能与蛋白裂隙和酶活性位点的相互作用，使之作用类似于抑制剂。因此，纳米抗体可以为从肽模拟药物设计小分子酶抑制物提供新的思路。由于仅有重链，纳米抗体的制造较mAb容易。纳米抗体的独特性质，如处于极端温度和pH环境中的稳定性，可以低成本制造大产量。因此，纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值，在肿瘤的抗体靶向诊断和治疗中也具有很大的发展前景。
鉴于CEA更多地过量表达于一些诸如结肠直肠癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、肝细胞瘤、乳腺癌和甲状腺癌等实体肿瘤中，因此研发抗CEA的纳米抗体，充分发挥纳米抗体超强的抗原识别能力，特别是识别一些隐匿于裂隙或空腔里的抗原决定簇成为抗体技术领域的一种新的需求。但是鉴于纳米抗体分子过低而存在的一些诸如亲和力低、易于集聚、血清半衰期短等结构缺陷却阻碍着纳米抗体的进一步应用。本发明的目的就是提供一种能够充分发挥纳米抗体的优越性能，又能克服其固有缺陷的抗CEA的纳米抗体，并进一步发挥其在人体样本的CEA检测和在制药学领域中的应用。
发明内容
基于上述发明目的，本发明首先提供了一种抗癌胚抗原的纳米抗体，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1序列由SEQ ID NO.13所述氨基酸序列组成，并且CDR2序列由SEQ ID NO.14所述氨基酸序列组成，并且CDR3序列由SEQ IDNO.15所述氨基酸序列组成。
在一个优选的技术方案中，所述纳米抗体的可变区序列由SEQ ID NO.16所述氨基酸序列组成。
第二，本发明还提供了一种含有上述纳米抗体的可变区的抗体，所述抗体还具有恒定区，所述抗体的恒定区序列由SEQ ID NO.17所述氨基酸序列组成。
第三，本发明还提供了一种编码上述抗体的序列的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子的序列由SEQ ID NO.18所示。
第四，本发明提供了一种含有上述多核苷酸分子的表达载体。
在一个优选的技术方案中，所述载体为pMES4。
第五，本发明提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞。
在一个优选的技术方案中，所述细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
最后，本发明还提供了上述的纳米抗体在制备肿瘤治疗药物中的应用。
本发明提供的抗CEA的纳米抗体，由于具有独特的CDR1、2、3区序列，使所述抗体对CEA抗原具有特异的识别和结合能力，而与其它非特异性交叉反应性蛋白没有反应。本发明提供的纳米抗体具有显著的ADCC效应，能够诱导表达CEA的肿瘤细胞MKN-45的裂解，而对于不表达CEA的MKN-74细胞则不具有这种效应，显示了在肿瘤治疗药物制备中的应用前景。而且，本发明提供的抗CEA纳米抗体可以在小鼠体内实现肿瘤的精确成像，显示了在诊断试剂制备和体内成像技术中的应用前景。
附图说明
图1.pMES4表达载体结构示意图；
图2.提取的总RNA电泳鉴定图；
图3.第一轮PCR扩增抗体可变区基因电泳鉴定图；
图4.第二轮PCR扩增抗体可变区基因电泳鉴定图；
图5.pMES4载体双酶切反应产物电泳鉴定图；
图6.菌落PCR鉴定转化子电泳鉴定图；
图7.纳米抗体SDS-PAGE鉴定图；
图8.融合表达载体构建示意图；
图9.纳米抗体与融合表达载体双酶切电泳鉴定图；
图10.纳米抗体纯化SDS-PAGE图；
图11.纳米抗体ADCC效应曲线；
图12.标记纳米抗体对小鼠移植肿瘤的成像定位结果图
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
实施例1抗CEA纳米抗体噬菌体展示文库库的构建及筛选
1.1羊驼的免疫：选取健康成年羊驼一只羊，将重组蛋白CEA与弗氏佐剂按1:1的比例混匀，按6-7μg/Kg采用背部皮下多点注射的方式免疫羊驼，共免疫四次，免疫间隔为2周。之后采集羊驼外周血，用于构建噬菌体展示文库。
1.2驼源淋巴细胞的分离：按照本技术领域常规程序从采集的驼源抗凝全血中分析淋巴细胞，每2.5×107个活细胞加入1mL RNA分离试剂，取1mL进行RNA提取，其余-80℃保存。
1.3总RNA提取：按照本技术领域常规程序提取总RNA，用RNase-free水调整浓度到1μg/μL(总RNA提取电泳鉴定结果见图2)。
1.4反转录合成cDNA：
根据逆转录试剂盒说明书(Roche公司的transcripor first stand cDNAsynthesis KIT)以1.3步骤获得的RNA为模板进行逆转录cDNA
1.5抗体可变区基因扩增：将反转录得到的cDNA作为模版进行PCR反应。扩增共进行两轮，第一轮PCR的引物序列如下：
CALL001：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG
CALL002：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
PCR反应条件及程序为：：95℃5min；95℃30s，57℃30s，72℃30s，30cycles；72℃7min
使用琼脂糖凝胶回收试剂盒胶回收700bp左右的条带，最终用水调整核酸浓度至5ng/μl(第一轮PCR产物鉴定见图3，其中，1：第一轮PCR产物；M：分子量标记)。
第二轮PCR的引物序列如下：
VHH-Back：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG
VHH-For：CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT
PCR反应条件及程序为：：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，15cycles；72℃7min
使用PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物(第二轮PCR产物鉴定见图4，其中，1：第二轮PCR产物；M：分子量标记)。
1.6载体构建
将pMES4(购自Biovector，其结构示意图见图1)与第二次PCR产物分别进行PstI、BstEII双酶切，取1.5μg酶切后载体和450ng酶切后的第二次PCR产物，加15μL T4 DNA连接酶，补充缓冲液和水至150μL总体积，16℃过夜连接并回收连接产物。使用PCR产物回收试剂盒进行产物回收，20μL水洗脱。图5为pMES4载体双酶切反应产物电泳鉴定图(1:pMES4载体双酶切产物；2：pMES4载体；M：分子量标记)。
1.7电转化及库容测定
取10μL纯化后的连接产物，加入到含有50μL大肠杆菌TG1感受态细胞的预冷电转杯中置入电转仪(ECM630电转仪，美国BTX公司)进行电转化，取出电转杯，复苏并培养转化子。随机挑选24个克隆，进行菌落PCR鉴定(电泳鉴定见图6，其中，1-23：23个转化子；N：阴性对照；M：分子量标记)。根据PCR阳性率推算库容(库容量＝克隆数×稀释倍数×[阳性率]PCR鉴定×10)。
引物序列如下：
MP57：TTATGCTTCCGGCTCGTATG
GIII：CCACAGACAGCCCTCATAG
1.8噬菌体扩增
取复苏的菌液接种至YT-AG培养基中，37℃200rpm培养到培养物OD600＝0.5。取出10ml菌液加入4×1010VCSM13，37℃静止感染30min。4000rpm，常温离心10min，去净上清。用2×YT-AK(含氨苄青霉素和卡那霉素)培养基重悬菌体，37℃200rpm培养过夜。离心取上清40ml管中，加入10ml PEG/NaCl(20％/2.5M)溶液充分混合，离心弃上清，沉淀用1ml冰PBS洗涤离心，取上清250μl预冷的PEG/NaCl，充分混匀并洗涤重悬。
测定噬菌体滴度：将TG1培养至OD600＝0.4，用LB培养基梯度稀释噬菌体，取倍比稀释的噬菌体TG1培养物混合培养，次日观察培养板中噬菌斑形成情况，对噬菌斑数在30-300的稀释梯度平板进行计数并按照下列公式计算噬菌体滴度(pfu)。
噬菌体滴度(pfu/ml)＝稀释倍数×噬菌斑数目×100
1.9纳米抗体筛选
通过ELISA方法以重组CEA抗原筛选阳性克隆。以重组CEA抗原包被ELISA板，5％BSA封闭，PBST洗涤。每孔加入100μl噬菌体上清液，37℃放置1h。弃上清，加入HRP标记的小鼠抗M13的二抗，37℃放置1h。弃上清，加入TMB溶液，室温孵育5min，每孔加入2M硫酸终止液，用酶标仪450nm读数。
1.10纳米抗体在大肠杆菌中的表达和纯化
挑选噬菌体ELSIA结果阳性的克隆，提取质粒并转化至菌株BL21感受态细胞，以IPTG诱导纳米抗体蛋白表达，收集上清(周质提取物)，并将周质提取物透析至PBS，使用Ni-NTA树脂进行纯化，使用不同浓度咪唑进行洗脱和收集，将收集的样品进行还原型蛋白电泳分析，结果参见图7(图7中，1-3：分别为VHH-CEA1穿透液、低浓度咪唑洗脱杂蛋白及洗脱目的蛋白；4：分子量标记；5-7：分别为VHH-CEA2穿透液、低浓度咪唑洗脱杂蛋白及洗脱目的蛋白；8-10：分别为VHH-CEA3穿透液、低浓度咪唑洗脱杂蛋白及洗脱目的蛋白)。
通过羊驼免疫、细胞分离、噬菌体文库的构建、纳米抗体的筛选，共筛选出3株抗CEA的纳米抗体。用Vector NTI软件对测序结果进行分析，登录IMGT(http:// www.imgt.org/IMGT_vquest)，对抗体轻链和重链基因进行分析，以确定可变区的框架区(framework regions，FR)和互补决定区(complementarity determining regions，CDR)。
纳米抗体VHH-CEA 1重链核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示，可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示，其中第1-20位氨基酸序列为FR1，第21-30位氨基酸序列为CDR1，第31-44位氨基酸序列为FR2，第45-61位氨基酸序列为CDR2，第62-93位氨基酸序列为FR3，第94-104位氨基酸序列为CDR3，第105-115位氨基酸序列为FR4，恒定区氨基酸序列为为SEQ ID NO.5所示。
纳米抗体VHH-CEA2重链核苷酸序列为SEQ ID NO.12，可变区氨基酸序列为SEQ IDNO.10所示，其中第1-20位氨基酸序列为FR1，第21-30位氨基酸序列为CDR1，第31-44位氨基酸序列为FR2，第45-57位氨基酸序列为CDR2，第58-89位氨基酸序列为FR3，第90-99位氨基酸序列为CDR3，第100-110位氨基酸序列为FR4，恒定区氨基酸序列为SEQ ID NO.11所示。
纳米抗体VHH-CEA 3重链核苷酸序列为SEQ ID NO.18，可变区氨基酸序列为SEQID NO.16，其中第1-20位氨基酸序列为FR1，第21-30位氨基酸序列为CDR1，第31-44位氨基酸序列为FR2，第45-61位氨基酸序列为CDR2，第62-93位氨基酸序列为FR3，第94-104位氨基酸序列为CDR3，第105-115位氨基酸序列为FR4，恒定区氨基酸序列为为SEQ ID NO.17所示。
实施例2.抗CEA纳米抗体的制备
2.1纳米抗体原始菌株TG1扩增及纳米抗体重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)
将含有纳米抗体核酸的原始菌株TG1甘油菌，按照1：1000比例接种于5mL新鲜的LB-A培养基，37℃，200rpm过夜培养。次日，使用Plasmid mini kit(OMEGA)按照说明书提取质粒。经验证后将上述质粒1ul转化于100ul感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上放置30min，42℃水浴热击90s，冰浴冷却3min。向离心管加入600ul LB培养基，37℃振荡培养60min。取上清100ul，用三角涂布器涂布在LB-A平板上，37℃倒置培养过夜。
2.2纳米抗体的诱导表达和提取
挑取上述单克隆菌落于LB-A培养基中，37℃振荡培养过夜。次日，取该菌液按照1：100比例加入100ml新鲜LB-A培养基，37℃振荡培养3h至菌液OD600＝0.8左右，加入终浓度为1mM IPTG，30℃诱导过夜。第三日，8000rpm，离心10min收集菌体，加入1.5mL的预冷TES缓冲液重悬沉淀。冰浴2min后，轻柔振荡30s，重复此循环6次。加3.0ml TES/4(将TES用水稀释4倍)，轻柔振荡30s后，冰浴静置2min，同样重复振荡和静置步骤共6次。9000rpm，4℃离心10min，收集约4.5mL的上清(周质提取物)，将上清进行蛋白电泳分析。
2.3纳米抗体的纯化和鉴定
将IMAC Sepharose(GE公司)重悬后，取2ml加入到重力柱内，静置30min，使sepharose自然沉降于重力柱底部，流出保存缓冲液。加入2倍柱体积的硫酸镍溶液(0.1M)，按照约8s/滴的流速流出硫酸镍溶液；加入10倍柱体积的平衡缓冲液平衡并洗涤sepharose，流速维持不变；将样品使用平衡缓冲液2倍稀释后，加入重力柱中，调节流速为6s/滴，收集穿透液；加入10倍柱体积洗涤缓冲液洗涤sepharose，维持流速不变，收集洗涤液；加入3倍柱体积的洗脱缓冲液，流速维持在6s/滴，收集含有目的蛋白的洗脱液；最后依次加入10倍柱体积的平衡缓冲液、10倍柱体积的纯水和10倍柱体积的20％乙醇洗涤sepharose，并最终保留4ml的20％乙醇来保存柱子。上述收集的样品分别进行SDS-PAGE检测(参见图10，其中，M:分子量；1：纯化后的纳米抗体)和Western blot检测。结果表明，本发明提供的纳米抗体对CEA抗原具有高度特异的结合活性，而与NCA抗原(非特异性交叉反应性蛋白)没有反应。
实施例3抗CEA纳米抗体与CEA抗原的亲和活性
3.1芯片抗原偶联
将抗原用不同pH的醋酸钠缓冲液(pH 5.5，pH 5.0，pH 4.5，pH 4.0)配制成20ug/mL的工作液，同时准备50mM的NaOH再生溶液，利用Biacore T100蛋白相互作用分析系统仪器中的模板方法对不同pH条件的抗原与芯片(GE公司)表面之间的静电结合进行分析，以信号增加的量达到5倍RL为标准，选择合适的最偏中性的pH体系并根据需要调整抗原浓度作为偶联时的条件。按照仪器中自带的模板方法对芯片进行偶联：其中1通道选择空白偶联模式，2通道选择Target偶联模式，目标设置为设计好的理论偶联量。偶联过程大概耗时60min。
3.2分析物浓度设置条件探索及再生条件优化
采取手动进样模式，选择1，2通道2-1模式进样，流速设置为30uL/min。进样条件均为120s，30uL/min。再生条件均为30s，30uL/min。首先持续空走运行缓冲液直至所有基线均稳定。准备浓度跨度较大的纳米抗体溶液，以运行缓冲液配置，建议设置200ug/mL，150ug/mL，100ug/mL，50ug/mL，20ug/mL，10ug/mL，2ug/mL。准备再生溶液，选择谷氨酸盐酸体系四个pH梯度的再生溶液：1.5，2.0，2.5，3.0。手动进样200ug/mL分析物样品，观察2通道，从最偏中性pH的再生缓冲液进行再生，直至2通道再生后的响应线回到与基线同一高度。再手动进样一次200ug/mL分析物样品，观察2-1通道的信号变化并记录结合量，用上一步中最后使响应线回到基线的再生溶液进行再生后，再次收手动进样200ug/mL分析物样品，观察2-1通道的信号变化并记录结合量与刚才的结合量数值对比，若偏差小于5％，即认为此pH的再生溶液为最佳的再生溶液，若再次进样的结合量偏低，则继续以更低pH的再生缓冲液进行实验。以选择的最佳再生溶液，作为每次进样后的芯片表面再生试剂。分别进样上面设置的分析物浓度样品，并对每个浓度的结合量进行分析，最终确定亲和力测试所需的浓度梯度。
3.3亲和力测试
按优化好的样品浓度梯度，再生溶液，使用仪器自带的模板方法(其中设置进样条件为60s，30uL/min；解离时间：600s；再生条件：30s，30uL/min)对纳米抗体及抗原之间的亲和力进行测试。随时观察2-1通道的信号情况。亲和力测试过程大概耗时200min。
3.4结果分析
选择合适的几个浓度梯度的结合解离曲线采用1：1binding的模式对所有曲线进行拟合，最终得到亲和力数值及结合常数和解离常数等重要参数。
表1：纳米抗体亲和力数据
样品编号
亲和力
VHH-CEA 1
2.40E-09
VHH-CEA 2
3.20E-09
VHH-CEA 3
1.99E-09
从表1可以看出，本发明获得的这三株抗CEA的纳米抗体与CEA抗原的亲和活性在3.20E-09和1.99E-09之间，具有极高的亲和力，完全可以在诊断试剂和药物制备中得到应用。
实施例4.三种不同纳米抗体与CEA抗原结合的重叠实验
4.1抗原饱和浓度的确定
以2ug/ml的浓度包被CEA抗原，100ul/孔，4℃包被24h，洗板5遍。以1％BSA作为封闭剂过夜封闭，洗板5遍。酶标板中加入不同梯度稀释的纳米抗体，阴性对照(阴性血清1:100)，PBS空白对照，37℃孵育30min，洗板5遍。加入1：4000比例稀释的HRP标记的羊抗羊驼IgG，37℃孵育30min，洗板5遍。加TMB显色液，37℃孵育10min，2M硫酸终止反应。读取吸光值450nm读数，绘制抗体饱和曲线，根据结果选择随浓度增加读数不再增加的浓度为饱和浓度。
4.2位点叠加实验
先加入第一种抗体进行反应，洗板后再加第二种抗体，洗板后加酶标二抗，TMB显色读数(方法同4.1)。计算两株抗体叠加率AI，AI>50％说明被测2株抗体抗原位点不同，AI<50％说明被测两株抗体抗原表位相同，AI值越大，位点重叠可能性越低。公式为：AI＝[2*A(1+2)-(A1+A2)]/A(1+2)*100％
A1—第一株抗体读数
A2—第二株抗体读数
A(1+2)--叠加2种抗体读数
表2：抗体抗原表位叠加实验
本实施例的实验结果表明，三株纳米抗体分别针对CEA抗原不同的抗原表位，这预示着在纳米抗体的诊断和治疗应用上，三株纳米抗体可以作为表位互补的组合物联合应用，从而可以增大诊断或治疗的效率。
实施例5.抗CEA纳米抗体诱导的ADCC活性测定
利用引物，以VHH-pMES4为模板，PCR扩增纳米抗体基因。引物序列如下：
F:CCGAAATTCGAGTCTGGAGGAGG
R:GGAAGATCTCTGGGTCCCCTGGCCC
利用EcoRⅠ和Bgl II限制性内切酶(NEB)将PCR产物与融合表达载体pFUSE-hIgG1-Fc分别进行双酶切(参见图8)。利用T4连接酶(NEB)将双酶切后的载体与纳米抗体基因连接过夜(参见图9，其中，1-3：VHH-pFUSE-hIgG1-Fc；4：阴性对照；M：分子量标记)，转化DH5α感受态后利用无内毒素大提试剂盒(天根)提取质粒。转染人293细胞，采用蛋白A亲和层析的方法从293细胞的培养上清中纯化CEA的单域抗体。
在96孔细胞微孔板内培养MKN-45和MKN-74细胞(3×104/孔)48小时，然后根据特定比例加入LAK细胞(淋巴因子激活的杀伤细胞，lymphokine activated killer cells)、抗CEA纳米抗体VHH-CEA1、2和3或者IgG抗体对照，LAK细胞与靶细胞的比例为1、5、10、15、20:1，抗体浓度均为2μg/ml。在5％CO2环境下37℃孵育6小时，吸去LAK细胞和死亡的肿瘤细胞，使用MTS方法进行细胞活力测定。
细胞毒性(％)＝[实验靶细胞的OD490/对照靶细胞的OD490]×100结果显示，抗CEA纳米抗体VHH-CEA 1、2和3均能显著诱导LAK细胞的ADCC活性，肿瘤细胞裂解率在45-75％之间，在不表达CEA的MKN-74细胞中未观察到这种裂解现象(参见图11)。
实施例6.抗CEA纳米抗体对异种移植瘤小鼠的体内成像定位
配制MKN-45细胞溶液(5×106MKN-45细胞溶于0.2ml PBS)，皮下注射于SCID小鼠的背部，待肿瘤生长20天后，通过尾静脉注射的方法分别给予小鼠金属锝99标记的纳米抗体VHH-CEA 1、2和3，或者对照抗体IgG(30μg/0.1ml)，在小动物活体成像系统中对小鼠的移植肿瘤进行成像定位。
结果显示，本发明提供的抗CEA纳米抗体都可以在小鼠体内实现肿瘤的精确成像，将来可用于相关肿瘤的精准体内诊断(参见图12)。
序 列 表
<110> 深圳市国创纳米抗体技术有限公司
<120> 一种抗癌胚抗原的高亲和力纳米抗体及其应用
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Ala Met Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 2
Ala Ile Ser Ser Ala Gly Gly Thr Arg Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 3
Val Pro Asp Thr Asn Thr Val Asn Asn Ala Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 109
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 4
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Ala Met Arg Trp Asp
20 25 30
Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala Ala Ile Ser Ser
35 40 45
Ala Gly Gly Thr Arg Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Asn Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Val Pro Asp
85 90 95
Thr Asn Thr Val Asn Asn Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105
<210> 5
<211> 231
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 5
Ala His His Ser Glu Asp Pro Ser Ser Lys Cys Pro Lys Cys Pro Gly
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Thr Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Val Leu Ser Ile Thr Arg Lys Pro Glu Val Thr Cys Val Val
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Val Asp Val Gly Lys Glu Asp Pro Glu Ile Glu Phe Ser Trp Ser Val
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Asp Asp Thr Glu Val His Thr Ala Glu Thr Lys Pro Lys Glu Glu Gln
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Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala
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Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr
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Lys Asp Thr Val Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Phe Pro Ala
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Asp Ile Asn Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Gly
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Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Gly Lys Asn Thr Trp Gln Gln Gly Glu
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