阅读说明：本技术 一种基于硼酯键的手性超分子核苷水凝胶及其制备方法和用途 (Chiral supramolecular nucleoside hydrogel based on boron ester bond and preparation method and application thereof ) 是由 刘江 杜玉琦 刘天楠 丁婷婷 曾昕 于 2020-05-18 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种基于硼酯键的手性超分子核苷水凝胶及其制备方法和用途。具体提供了一种超分子水凝胶,所述超分子水凝胶是以由鸟嘌呤核苷和硼酸盐为原料,在溶剂中混合得到的；所述鸟嘌呤核苷为D-鸟嘌呤核苷和/或L-鸟嘌呤核苷。该超分子水凝胶具有优异的稳定性、可注射性和自修复性,同时具有良好的生物相容性,在动物体内未表现明显急性毒性,能够在体内降解,可作为细胞外基质用于细胞的3D培养。本发明提供的超分子水凝胶作为支架材料在组织工程领域具有非常好的应用前景。(The invention relates to a chiral supramolecular nucleoside hydrogel based on a boron ester bond, a preparation method and application thereof. The supermolecule hydrogel is prepared by mixing guanosine and borate serving as raw materials in a solvent; the guanosine is D-guanosine and/or L-guanosine. The supramolecular hydrogel has excellent stability, injectability and self-repairing property, has good biocompatibility, does not show obvious acute toxicity in animal bodies, can be degraded in the bodies, and can be used as extracellular matrix for 3D culture of cells. The supermolecule hydrogel provided by the invention has a very good application prospect in the field of tissue engineering as a scaffold material.)

一种基于硼酯键的手性超分子核苷水凝胶及其制备方法和 用途

技术领域

本发明属于水凝胶领域，具体涉及一种基于硼酯键的手性超分子核苷水凝胶及其制备方法和用途。

背景技术

口腔黏膜病是指发生在口腔黏膜及软组织上的类型各异、种类众多疾病的总称。在临床工作中，某些口腔黏膜疾病常表现为迁延不愈、广泛而严重的糜烂面或者溃疡面，如口腔扁平苔藓、重型复发性阿弗他溃疡等；此类疾病在组织病理学上表现为上皮部分或上皮全层的组织缺损。目前的治疗方式包括去除原发因素、药物治疗、手术治疗、激光治疗等。但是由于某些原发因素不明或者难以去除、药物治疗效果不佳或者副作用大等缺点，传统的治疗方式难以满足临床需要。

近年来，组织工程技术在骨及软骨组织再生等方面取得了长足的进步，或许也是口腔黏膜病治疗的新思路。组织工程通常由支架材料、种子细胞、生长因子三个要素构成。常见的组织工程策略为：种子细胞在精确控制的条件下在三维多孔的组织支架里生长、扩增形成结构物，再将细胞/支架结构植入到体内所需部位，引导新组织在支架内形成，而支架随着组织的形成而逐渐降解消失，损伤的组织和器官得以重建。其中，支架材料不仅起着支撑作用，为种子细胞的分化和迁移提供基础，并且可同时作药物及细胞因子的缓释平台，促进受损的组织器官修复和重建。

可用于组织工程支架的材料有很多，理想的支架材料应该具有良好的生物降解性，能促进细胞增殖、分化及产生细胞外基质，具有营养物质及代谢产物的交换通道，能与周围组织黏附、整合等特点。按组织支架是否需要提前制备，可分为预制多孔支架和水凝胶两类。其中，水凝胶材料是一类具有三维网状结构的聚合物，在水中能吸收大量的水分而溶胀，并在溶胀之后能够继续保持其原有结构而不被溶解。其三维网状结构与天然的细胞外基质相近，同时富含水分，有利于种子细胞的存活，是一类广泛应用于各类组织工程研究的支架材料。

按键合网络的不同，水凝胶可分为化学水凝胶和物理水凝胶。化学水凝胶通过共价键交联形成，多为高分子聚合物水凝胶，按来源可分为人工合成的高分子聚合物(如：聚乙烯醇、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚乙烯等)以及天然高分子聚合物(如：明胶、胶原蛋白、琼脂、淀粉等)。虽然高分子聚合物水凝胶具有优良的稳定性和力学性能，但是人工合成的聚合物形成的水凝胶缺乏细胞识别的信号，在生理条件下往往无法降解，或降解产物有毒，严重影响材料的生物安全性；天然高分子聚合物因其结构来源不同，结构与性能存在批次间的差异，材料性能重复性差、机械强度不足，结构和性能可调范围窄，限制了化学水凝胶在支架材料中的应用。

而物理水凝胶是通过分子间弱的非共价键相互作用(如氢键、离子键、π-π堆积、范德华力、或静电相互作用等)形成的，其在外力作用下易发生可逆的溶胶-凝胶行为，且制备简单，无需化学反应的参与，更有利于其在生物医学领域的应用。近年来，低分子量成胶分子(low molecular weight gelators,LMWG)逐渐引起研究者的重视。但是，与化学水凝胶相比，物理水凝胶的稳定性较差，这在很大程度上限制了物理水凝胶作为支架材料的应用。

某些低分子量的化合物如氨基酸、核酸等能在特定溶剂里通过非共价键相互作用形成自组装纤维网络(Self-Assembled Fibrillar Networks,SAFINs)，这些网络结构在一定程度上限制了溶剂分子的自由移动，形成了黏弹性固体样物质，即超分子水凝胶。超分子水凝胶与传统的聚合物水凝胶相比，在稳定性、机械性质、体内降解及代谢等方面都具有独特的性质，其结构能够对种子细胞的生长、增殖、分化等产生重要影响，在药载系统、组织工程等方面都显示出广泛的应用前景。

研究发现，鸟嘌呤核苷及其衍生物在某些金属离子的盐溶液中形成四聚体(G-quartet)，这些四聚体逐层堆积形成纤维样结构，纤维样结构相互交联形成网络。鸟嘌呤核苷及其衍生物在制备超分子水凝胶中具有较好的潜力。但是鸟嘌呤核苷分子本身具有逃离网络结构的趋势，随着时间的延长，越来越多的分子逃离网络，相互聚集，逐渐形成结晶或沉淀，导致凝胶垮塌，严重影响了凝胶的寿命和稳定。

此外，新型的动态共价键水凝胶(Dynamical covalent bonding gels,DCB gels)的出现，为功能性水凝胶在生物医学领域的应用开辟了新的发展道路。动态共价键水凝胶是以动态共价键为交联点构建水凝胶的三维网络结构，其整合了化学凝胶的稳定性和物理凝胶的可逆性，通常具有良好的自修复性(或自愈性)和可注射成型。这种独特的可调性使其在药物输送、传感器、组织工程、生物医学工程等多个领域中具有潜在的应用价值和发展前景。目前，以硼酯键(B-O)、酰腙键(-HC＝N-NH-CO-)和可逆亚胺键(-C＝N-)等为主导的动态共价键是合成功能性水凝胶的主要手段之一。

因此，制备出一种集优异的稳定性、自修复性(或自愈性)和可注射成型于一体的功能性超分子水凝胶，在组织工程支架材料等领域将具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于硼酯键的手性超分子核苷水凝胶及其制备方法和用途。

本发明提供了一种超分子水凝胶，所述超分子水凝胶是以由鸟嘌呤核苷和硼酸盐为原料，在溶剂中混合得到的；所述鸟嘌呤核苷为D-鸟嘌呤核苷和/或L-鸟嘌呤核苷，所述D-鸟嘌呤核苷的结构如式(Ⅰ)所示，L-鸟嘌呤核苷的结构如式(Ⅱ)所示：

进一步地，所述鸟嘌呤核苷为D-鸟嘌呤核苷或L-鸟嘌呤核苷，优选为L-鸟嘌呤核苷。

进一步地，所述硼酸盐为硼酸钠、硼酸钾、硼酸锂、硼酸镁、硼酸钙，优选为硼酸钠。

进一步地，所述溶剂为水或水溶液，所述水溶液优选为PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的pH范围优选为7.35～7.45。

进一步地，所述硼酸盐中的硼酸根离子与鸟嘌呤核苷的物质的量之比为1：(1～4)，优选为1:2。

进一步地，所述鸟嘌呤核苷在溶剂中的浓度为0.05～0.2M，优选为0.1M。

进一步地，所述超分子水凝胶中包含硼酯键。

本发明还提供了一种制备上述超分子水凝胶的方法，所述方法为将鸟嘌呤核苷、硼酸盐、溶剂混合均匀，加热，即得。

进一步地，所述加热的温度为80～100℃，优选为90℃；

和/或，所述加热的时间为至原料完全溶解。

本发明还提供了上述超分子水凝胶在制备细胞外基质或支架材料中的用途。

硼酸钠，又称四硼酸钠，俗称硼砂，分子式为分子式Na₂B₄O₇·10H₂O。

硼酯键的结构如下式(Ⅲ)所示：

实验结果表明，本发明提供的基于硼酯键的手性超分子水凝胶具有优异的稳定性、可注射性和自修复性，同时具有良好的生物相容性，在动物体内未表现明显急性毒性，能够在体内降解，可作为细胞外基质用于细胞的3D培养。本发明提供的超分子水凝胶作为支架材料在组织工程领域具有非常好的应用前景。

本发明提供的制备上述超分子水凝胶的方法简单，安全无毒，适合扩大化生产。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的

具体实施方式

，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：样品的¹¹B NMR(a)、红外(b)表征谱图；a图中，从上到下3根曲线的测试样品依次是实施例5制得的2.8％w/v L-G超分子水凝胶、实施例4制得的1.4％w/v L-G超分子水凝胶、硼酸钠，图中¹¹B-Diester表示硼酸二酯键化学位移，¹¹B-Monoester表示硼酸单酯键化学位移，¹¹B游离硼酸键化学位移；b图中，B-O(-)曲线表示原料L-鸟嘌呤核苷，B-O(+)曲线表示2.8％w/v L-G超分子水凝胶。

图2：各水凝胶制成后倒置5min、倒置24h、倒置8d后的状态。其中，a1表示对照例1制得的水凝胶，c1表示对照例2制得的水凝胶，e1表示对照例3制得的水凝胶，a2表示对照例4制得的水凝胶，c2表示对照例5制得的水凝胶，e2表示对照例6制得的水凝胶；b1表示实施例1制得的水凝胶，d1表示实施例2制得的水凝胶，f1表示实施例3制得的水凝胶，b2表示实施例4制得的水凝胶，d2表示实施例5制得的水凝胶，f2表示实施例6制得的水凝胶。

图3：不同剪切频率下各水凝胶的流变测试结果。其中a表示对照水凝胶2’，b表示对照水凝胶5’，c表示实施例2制得的超分子水凝胶，d表示实施例5制得的超分子水凝胶。

图4：不同剪切应变下各水凝胶的流变测试结果。其中a表示对照水凝胶2’，b表示对照水凝胶5’，c表示实施例2制得的超分子水凝胶，d表示实施例5制得的超分子水凝胶。

图5：2.8％w/v D-G超分子水凝胶(即图中的D-G)和2.8％w/v L-G超分子水凝胶(即图中的L-G)注入小鼠背部皮下不同时间后的重要脏器HE染色结果，“对照组”为对照组结果。

图6：2.8％w/v D-G超分子水凝胶(即图中的D-G)和2.8％w/v L-G超分子水凝胶(即图中的L-G)注入小鼠背部皮下不同时间后在小鼠体内降解情况，“control”为对照组结果。

图7：2.8％w/v L-G超分子水凝胶的3D细胞培养实验结果：(a)注入2.8％w/v L-G超分子水凝胶第6d的LIVE/DEAD细胞染色结果，其中绿色荧光表示活细胞，红色荧光表示死细胞；(b)活细胞百分比计数，其中0d表示对照组的结果，6d表示注入2.8％w/v L-G超分子水凝胶第6d的结果。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

以下实施例和实验例采用的PBS缓冲液的pH范围为7.35～7.45。

实施例1、本发明1.4％w/v D-G超分子水凝胶的制备

将160μL PBS缓冲液、40μL 0.25M硼酸钠水溶液与D-鸟嘌呤核苷(2.8mg)加入玻璃瓶，混合，加热(90℃)直至固体粉末完全溶解，室温冷却5分钟，即得本发明的1.4％w/v D-G。

实施例2、本发明2.8％w/v D-G超分子水凝胶的制备

将实施例1中D-鸟嘌呤核苷的质量修改为5.6mg，制得2.8％w/v D-G超分子水凝胶。

实施例3、本发明5.6％w/v D-G超分子水凝胶的制备

将实施例1中D-鸟嘌呤核苷的质量修改为11.2mg，制得5.6％w/v D-G超分子水凝胶。

实施例4、本发明1.4％w/v L-G超分子水凝胶的制备

将160μL PBS缓冲液、40μL 0.25M硼酸钠水溶液与L-鸟嘌呤核苷(2.8mg)加入玻璃瓶，混合，加热(90℃)直至固体粉末完全溶解，室温冷却5分钟，即得本发明的1.4％w/v L-G。

实施例5、本发明2.8％w/v L-G超分子水凝胶的制备

将实施例4中L-鸟嘌呤核苷的质量修改为5.6mg，制得2.8％w/v L-G超分子水凝胶。

实施例6、本发明5.6％w/v L-G超分子水凝胶的制备

将实施例4中L-鸟嘌呤核苷的质量修改为11.2mg，制得5.6％w/v L-G超分子水凝胶。

表1 实施例1～6各超分子水凝胶的原料及命名

以下为未引入硼酯键的对照水凝胶的制备方法：

对照例1、对照水凝胶1的制备

将实施例1中的160μL PBS缓冲液和40μL 0.25M硼酸钠水溶液替换为200μL PBS缓冲液，制得对照水凝胶1。

对照例2、对照水凝胶2的制备

将实施例2中的160μL PBS缓冲液和40μL 0.25M硼酸钠水溶液替换为200μL PBS缓冲液，制得对照水凝胶2。

对照例3、对照水凝胶3的制备

将实施例3中的160μL PBS缓冲液和40μL 0.25M硼酸钠水溶液替换为200μL PBS缓冲液，制得对照水凝胶3。

对照例4、对照水凝胶4的制备

将实施例4中的160μL PBS缓冲液和40μL 0.25M硼酸钠水溶液替换为200μL PBS缓冲液，制得对照水凝胶4。

对照例5、对照水凝胶5的制备

将实施例5中的160μL PBS缓冲液和40μL 0.25M硼酸钠水溶液替换为200μL PBS缓冲液，制得对照水凝胶5。

对照例6、对照水凝胶6的制备

将实施例6中的160μL PBS缓冲液和40μL 0.25M硼酸钠水溶液替换为200μL PBS缓冲液，制得对照水凝胶6。

表1 对照例1～6各对照水凝胶的原料及命名

对照例	硼酸钠	鸟嘌呤核苷浓度	鸟嘌呤核苷	对照水凝胶命名
					对照例1	无	0.05M	D-鸟嘌呤核苷	对照水凝胶1
对照例2	无	0.1M	D-鸟嘌呤核苷	对照水凝胶2
					对照例3	无	0.2M	D-鸟嘌呤核苷	对照水凝胶3
对照例4	无	0.05M	L-鸟嘌呤核苷	对照水凝胶4
					对照例5	无	0.1M	L-鸟嘌呤核苷	对照水凝胶5
对照例6	无	0.2M	L-鸟嘌呤核苷	对照水凝胶6

以下通过实验例证明本发明的有益效果。

实验例1、超分子水凝胶的结构表征

1、实验方法

取实施例4、5制得的超分子水凝胶，进行核磁(¹¹B NMR)表征，以原料硼酸钠为对照；

取实施例5制得的超分子水凝胶，进行红外表征，以原料L-鸟嘌呤核苷为对照。

2、实验结果

如图1a所示，可以看出，本发明实施例4和实施例5制得的超分子水凝胶中均成功引入了硼酯键。进一步通过对图1b的红外光谱分析发现，原料鸟嘌呤核苷中的核苷羟基峰信号ν(-OH，3300cm^-1)在引入硼酯键后明显减弱，说明核苷糖基2’-OH和3’-OH参与了硼酯键的形成。

实验例2、超分子水凝胶的稳定性评价

1、实验方法

(1)评价对象

实施例1～6制得的超分子水凝胶，对照例1～6制得的对照水凝胶。

(2)稳定性评价方法

将制备超分子水凝胶的玻璃瓶，在加热完成后，于室温冷却5分钟后，倒置。将上述玻璃瓶保持倒置状态5分钟(5min)、24小时(24h)、8天(8d)后，观察凝胶状态。

2、实验结果

结果如图2所示。可以看出，在各鸟嘌呤核苷浓度下，不加硼酸钠的鸟嘌呤核苷形成的对照水凝胶均在24小时内形成大量结晶，稳定性差；而加入硼酸钠后，鸟嘌呤核苷与硼酸钠作用形成的超分子水凝胶在24小时内均未见明显结晶，特别是图2中d1(实施例2制得)、d2(实施例5制得)所示的超分子水凝胶，不仅能够在较短时间内成胶，而且在倒置第8天仍然未见明显结晶。

所以，以D-鸟嘌呤核苷或L-鸟嘌呤核苷为原料，加入硼酸钠水溶液制得的超分子水凝胶比不加硼酸钠水溶液制得的水凝胶稳定性更好；说明引入硼酯键后，所得鸟嘌呤核苷超分子水凝胶的稳定性提高。

此外，在加入硼酸钠水溶液制得的超分子水凝胶中，当原料硼酸钠中的硼酸根离子与原料鸟嘌呤核苷的物质的量之比为1:2时，所得超分子水凝胶的稳定性最佳。

实验例3、超分子水凝胶的流变测试

1、实验方法

(1)表征对象

实施例2、5制得的超分子水凝胶；

将实施例2中的160μL PBS缓冲液和40μL 0.25M硼酸钠水溶液替换为200μL 0.2M的KCl水溶液后制得对照水凝胶2’；

将实施例5中的160μL PBS缓冲液和40μL 0.25M硼酸钠水溶液替换为200μL 0.2M的KCl水溶液后制得对照水凝胶5’。

(2)测试方法

(2.1)不同剪切频率下的流变测试：将各水凝胶加热至凝胶完全溶解形成溶液，吸取1.2mL溶液于已预热到80℃流变仪平行板上，下降锥板PC50至间隙距离为0.5mm，刮除多余样品，并沿平行板周围滴加适量标准油防止样品挥发，降温至20℃；由开始降温计算，5min或10min后开始测试，设定剪切应变为1％，剪切频率由100rad/s降至0.1rad/s。

(2.2)不同剪切应变下的流变测试：将各水凝胶加热至凝胶完全溶解形成溶液，吸取1.2mL溶液于已预热到80℃流变仪平行板上，下降锥板PC50至间隙距离为0.5mm，刮除多余样品，并沿平行板周围滴加适量标准油防止样品挥发，降温至20℃；由开始降温计算，5min或10min后开始测试，设定低剪切时应变为1％，频率1rad/s；高剪切时应变为300％，频率1rad/s。

2、实验结果

2.1 不同剪切频率下的流变测试

结果如图3所示。测试结果表明，剪切频率从100rad/s逐渐降至0.1rad/s，本发明实施例制得的超分子水凝胶弹性模量G’始终大于损耗模量G”(图3c-d)，说明本发明实施例制得的超分子水凝胶始终保持为凝胶状态。而且，在被测频率范围内，本发明实施例制得的超分子水凝胶G’始终大于未引入硼酯键的对照水凝胶(图3)。

此外，根据低剪切频率下的G’值可以比较不同样品的交联密度，G’值越高，材料越硬。根据图3看出，引入硼酯键后，本发明实施例制得的超分子水凝胶交联度提高，硬度增加，且实施例2制得的2.8％w/v D-G超分子水凝胶的交联度和硬度大于实施例5制得的2.8％w/v L-G超分子水凝胶。

2.2 不同剪切应变下的流变测试

结果如图4所示。测试结果表明，本发明实施例制得的超分子水凝胶在1％的剪切应变下G’>G”，表现出凝胶特性(图4c-d)。在经过300％的高剪切应变后，G’和G”迅速下降，且G’<G”，表明凝胶被破坏，转变为液体；当剪切应变恢复到1％后，G’和G”迅速上升，且G”<G’，表明液体又重新转变为凝胶。三次高剪切应变结束后，水凝胶的G’值与初始值相当，且高于G”值。

由此说明，本发明实施例制得的超分子水凝胶在受到高剪切应力后，会从凝胶转变为液体，说明该超分子水凝胶具有可注射性；当剪切应力解除后，该超分子水凝胶又从液体恢复成凝胶状态，说明该超分子水凝胶具有自修复性。

实验例4、超分子水凝胶的生物相容性表征

(1)实验方法

按照实施例2或5的方法制备超分子水凝胶，冷却10min后，取1mL注入于6-8周龄Babl/c雌性小鼠背部皮下，并于0h、3h、6h、12h、24h取出小鼠心、肝、脾、肺、肾进行HE染色，显微镜下观察组织变化。

以相同体积注射量的NaBO₃水溶液(0.25M)与PBS缓冲液形成的混合溶液为对照组，混合溶液中NaBO₃水溶液与PBS缓冲液的体积比v：v＝2:8。

(2)实验结果

结果如图5所示。结果表明，与对照组相比，2.8％w/v D-G和2.8％w/v L-G超分子水凝胶组均未见明显组织水肿、炎症、缺损，组织结构及细胞轮廓清晰，排列整齐，未见明显细胞萎缩或坏死，细胞间未见明显炎性渗出及出血。由此说明，本发明实施例制得的超分子水凝胶在动物体内未表现明显急性毒性。

实验例5、超分子水凝胶的体内降解速率表征

(1)实验方法

按照实施例2或5的方法制备超分子水凝胶，冷却10min后，取1mL注入于6-8周龄Babl/c雌性小鼠背部皮下，并于0h、3h、6h、12h、24h观察皮下水凝胶剩余量。

以相同体积注射量的NaBO₃水溶液(0.25M)与PBS缓冲液形成的混合溶液为对照组，混合溶液中NaBO₃水溶液与PBS缓冲液的体积比v：v＝2:8。

(2)实验结果

结果如图6所示。结果表明，2.8％w/v D-G超分子水凝胶在24h时完全降解；2.8％w/v L-G超分子水凝胶在24h时还有小部分残留。由此说明，本发明实施例制得超分子水凝胶的均能够在体内降解，其中，2.8％w/v L-G超分子水凝胶的体内降解速度比2.8％w/v D-G超分子水凝胶慢。

实验例6、超分子水凝胶作为支架材料的应用

(1)实验方法

通过LIVE/DEAD cell viability实验验证本发明2.8％w/v L-G超分子水凝胶作为细胞外基质用于细胞的3D培养的效果。

按照实施例5的方法制备2.8％w/v L-G超分子水凝胶，加热至凝胶完全溶解；同时收集生长良好的NOK细胞，配制成细胞悬液，调整其细胞密度为1～2*10⁵个/mL。取50μL细胞悬液和100μL预热凝胶液体混合，室温下冷却10min后，沿水凝胶周围滴加50μL培养基，每天换液1次，第6d时进行LIVE/DEAD细胞染色，荧光显微镜下观察、拍照，使用Bitplane Imaris7.4.2软件计数。

以50μL细胞悬液和100μL预热凝胶液体混合，室温下冷却10min后立即进行LIVE/DEAD细胞染色作为对照组。

(2)实验结果

结果如图7所示。结果表明，细胞在培养6d后，在凝胶内散在或成团生长，未见明显死亡细胞(图7a)，与对照组相比，活细胞百分比计数未见明显差异(图7b)，说明本发明制得的2.8％w/v L-G超分子水凝胶可作为细胞外基质用于细胞的3D培养。

上述实验表明，本发明制得的2.8％w/v L-G超分子水凝胶具有良好的生物相容性，未表现明显急性毒性，可作为细胞外基质用于细胞的3D培养。

综上，本发明提供了一种基于硼酯键的手性超分子水凝胶，该超分子水凝胶具有优异的稳定性、可注射性和自修复性，同时具有良好的生物相容性，在动物体内未表现明显急性毒性，能够在体内降解，可作为细胞外基质用于细胞的3D培养。本发明提供的超分子水凝胶作为支架材料在组织工程领域具有非常好的应用前景。