阅读说明：本技术 一种pH和温度双响应UV交联壳聚糖可注射水凝胶的制备方法 (Preparation method of pH and temperature dual-response UV cross-linked chitosan injectable hydrogel ) 是由 李保强 丁海昌 冯玉杰 贾德昌 周玉 于 2020-06-04 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种pH和温度双响应的UV交联壳聚糖可注射水凝胶的制备方法,属于生物医用水凝胶领域。本发明首先分别合成pH响应的烯丙基壳聚糖(OAL-CS)和温度响应性的巯基改性聚异丙基丙烯酰胺(HS-PNIPAM),然后基于巯基-烯点击化学能够在UV辐照下可将含有光引发剂的OAL-CS/HS-PNIPAM溶液快速转化为水凝胶；通过调整OAL-CS/HS-PNIPAM质量比,可实现控制水凝胶的pH和温度响应性溶胀大小。本发明不但实现了OAL-CS/HS-PNIPAM溶液在UV辐照下快速形成凝胶,而且赋予UV交联壳聚糖可注射水凝胶的溶胀行为具有pH和温度的智能响应性；由于该水凝胶体系可快速UV固化,可以通过UV固化或UV光刻技术制备用于组织工程、药物释放和创面修复等领域的快速成型的水凝胶。(The invention relates to a preparation method of pH and temperature dual-response UV cross-linked chitosan injectable hydrogel, belonging to the field of biomedical hydrogel. Firstly, respectively synthesizing pH-responsive allyl chitosan (OAL-CS) and temperature-responsive sulfydryl-modified polyisopropylacrylamide (HS-PNIPAM), and then quickly converting an OAL-CS/HS-PNIPAM solution containing a photoinitiator into hydrogel under UV irradiation based on sulfydryl-alkene click chemistry; by adjusting the mass ratio of OAL-CS/HS-PNIPAM, the control of the pH and temperature response swelling size of the hydrogel can be realized. The invention not only realizes that the OAL-CS/HS-PNIPAM solution quickly forms gel under UV irradiation, but also endows the swelling behavior of the UV cross-linked chitosan injectable hydrogel with intelligent responsiveness of pH and temperature; because the hydrogel system can be rapidly UV cured, the rapidly formed hydrogel used in the fields of tissue engineering, drug release, wound repair and the like can be prepared by UV curing or UV photoetching technology.)

一种pH和温度双响应UV交联壳聚糖可注射水凝胶的制备方法

技术领域

本发明涉及一种pH和温度双响应UV交联壳聚糖可注射水凝胶的制备方法，属于生物医用水凝胶领域。

背景技术

智能响应性水凝胶是指水凝胶在收到外部刺激后，比如温度、pH、光、电场、磁场、氧化/还原剂等，其一些性能会发生显著的变化，包括体积、渗透压、相态等等。这些性能的改变能够被控制，给予了智能水凝胶广阔的需求应用。在这些外部刺激中，pH和温度是人体环境最易调节的变化，并且与人体的生理活动息息相关。目前的报道，几乎所有的pH和温度响应的水凝胶都是人工合成高分子且不可生物降解的，这无法满足体内生物可降解的要求。因此，开发基于天然产物的生物可降解的pH和温度双响应性水凝胶很有必要。

壳聚糖是自然界中唯一带有氨基的弱碱性天然多糖，由于良好的生物相容性、生物可降解性使其可应用于药物释放、组织工程和伤口敷料等领域。但是由于壳聚糖分子内和分子间强烈的氢键的作用使得其不溶于水、生理盐水或模拟体液等pH为中性的水性介质。壳聚糖分子中氨基赋予壳聚糖pH响应性和生物活性，但壳聚糖自身缺乏温度响应性，需要在壳聚糖分子引入温度响应性基团。目前，温度响应的聚异丙基丙烯酰胺通过自由基聚合引入的壳聚糖分子，并成功的制备了温敏性的壳聚糖水凝胶。

但上述可UV固化壳聚糖衍生物的合成方法仍存在以下问题：(1)壳聚糖分子中的温度响应性聚异丙基丙烯酰胺的接枝率难以控制；(2)壳聚糖水凝胶的pH响应性丢失。本发明合成出可快速UV固化且能溶于水的pH和温度双响应的水凝胶体系，其中O-烯丙基壳聚糖提供pH响应性，巯基PNIPAM提供温度响应性。两种物质混合后不但能在UV辐照下快速固化形成水凝胶，而且该凝胶的体积能够可逆的发生变化。由于该体系可快速UV固化，因此可以通过UV光刻或UV固化技术制备任意形状与尺寸的水凝胶(微米～厘米尺寸范围)，在组织工程支架、药物释放和创面修复等领域有潜在的应用。

发明内容

本发明目的在于针对现有技术中可UV固化壳聚糖水凝胶不具有智能性的问题，比如pH和温度响应性。基于壳聚糖含有大量氨基时拥有的pH响应性，合成具有pH响应性的壳聚糖；基于PNIPAM的温度响应性，合成温度响应性的巯基PNIPAM；两种物质溶液通过巯基-烯点击化学在UV固化时可快速(20～60秒)的制备双响应性水凝胶。

本发明所提供的一种pH和温度双响应的UV交联壳聚糖可注射水凝胶，pH和温度双响应的UV交联壳聚糖可注射水凝胶是指O-烯丙基壳聚糖(OAL-CS)和巯基PNIPAM(HS-PNIPAM)，O-烯丙基壳聚糖和巯基PNIPAM具有以下结构式(Ⅰ)。

本发明一种pH和温度双响应的UV交联壳聚糖可注射水凝胶的制备方法，具体步骤为：

步骤一：利用对壳聚糖的氨基保护策略，合成具有pH响应的O-烯丙基壳聚糖(OAL-CS)；利用可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)技术合成具有温度响应的PNIPAM，再通过酯化反应合成温度响应的巯基PNIPAM(HS-PNIPAM)；

步骤二：将两种响应性物质溶于去离子水、生理盐水或细胞培养基中配制成OAL-CS/HS-PNIPAM溶液，其中OAL-CS/HS-PNIPAM的质量比为2～6；采用UV辐照含有光引发剂Irgacure 2959的OAL-CS/HS-PNIPAM混合溶液一定时间，即可得到UV固化的双响应性水凝胶；

本发明一种pH和温度双响应的UV交联壳聚糖可注射水凝胶的制备方法，pH和温度双响应的UV交联壳聚糖可注射水凝胶OAL-CS/HS-PNIPAM不但能在UV辐照(波长为360～480nm，UV辐照度为4mW/cm²)下10～50秒快速固化形成水凝胶，而且该水凝胶溶胀行为具有pH和温度响应性。

本发明一种pH和温度双响应的UV交联壳聚糖可注射水凝胶的制备方法，所述光引发剂Irgacure 2959的浓度为0.05％(w/v)；所述UV的波长在360～480nm，UV辐照度为4mW/cm²，辐照时间在5～10秒。

本发明一种pH和温度双响应的UV交联壳聚糖可注射水凝胶的制备方法，所述配制的O-烯丙基壳聚糖水溶液的浓度为20～25mg/mL，巯基PNIPAM的浓度为4～10mg/mL。

本发明一种pH和温度双响应的UV交联壳聚糖可注射水凝胶的制备方法，所述O-烯丙基壳聚糖的合成时，催化剂NaOH浓度为0.5％。

本发明一种pH和温度双响应的UV交联壳聚糖可注射水凝胶的制备方法，所述巯基PNIPAM使用的溶剂为DMF：H₂O＝1：1的混合液，常温反应时间为3天。

本发明一种pH和温度双响应的UV交联壳聚糖可注射水凝胶的制备方法，本发明合成pH响应的壳聚糖和温度响应的PNIPAM，通过保留壳聚糖中大量的氨基基团，能够保持壳聚糖自身的pH响应性，同时分子上的烯丙基基团提供可交联性能；巯基PNIPAM不仅提供温度响应性，同时分子上的巯基基团提供可交联性能；用UV辐照含有光引发剂的两种物质的混合水溶液，在较短辐照时间(5～10秒)内，即可获得壳聚糖水凝胶；该体系结构可控，凝胶操作简便，凝胶的溶胀比既体积可调。

附图说明

图1本发明一种pH和温度双响应的UV交联壳聚糖可注射水凝胶的制备方法的结构式。

图2为实施例中壳聚糖与O-烯丙基壳聚糖的¹H NMR谱图。

图3为实施例中壳聚糖与O-烯丙基壳聚糖的FTIR光谱

图4为实施例中PNIPAM和巯基PNIPAM的¹H NMR谱。

图5为实施例中pH和温度双响应水凝胶的溶胀调控，(A)pH＝7.2时不同温度下的溶胀比，(B)37℃下不同pH条件下的溶胀比。

具体实施方式

实施例1：如图1所示，本实施例所涉及的一种pH和温度双响应的UV交联壳聚糖可注射水凝胶，该凝胶体系有pH响应性的O-烯丙基壳聚糖和温度响应性的巯基PNIPAM，两种物质具有以下的结构(Ⅰ)

一种pH和温度双响应的UV交联壳聚糖可注射水凝胶制备方法：

利用对壳聚糖的氨基保护策略，合成具有pH响应的O-烯丙基壳聚糖(OAL-CS)，该物质中存在大量的氨基基团，其能够保持壳聚糖自身的pH响应性，同时分子上的烯丙基基团提供可交联性能。

利用RAFT技术合成具有温度响应的PNIPAM，再通过酯化反应合成温度响应的巯基PNIPAM(HS-PNIPAM)，该分子结构提供温度响应性，同时分子上的巯基基团提供可交联性能。

将两种响应性物质溶解在去离子水中配制成OAL-CS和HS-PNIPAM混合溶液，其中OAL-CS/HS-PNIPAM的质量比为2～6，采用UV辐照含有光引发剂Irgacure 2959的混合溶液一定时间，即可得到UV固化的双响应性水凝胶。

在O-烯丙基壳聚糖的合成步骤中，催化剂NaOH浓度为0.5％；在巯基PNIPAM合成中，巯基PNIPAM使用的溶剂为DMF：H₂O＝1：1的混合液，常温反应时间为3天；配制的O-烯丙基壳聚糖水溶液的浓度为20～25mg/mL，巯基PNIPAM的浓度为4～10mg/mL。

在固化形成水凝胶过程中，光引发剂Irgacure 2959的浓度为0.05％(w/v)、UV波长在360～480nm，UV辐照度为4mW/cm²，辐照时间在5～10秒。

实施例2：如图2-5所示，本实施例所涉及的一种pH和温度双响应的UV交联壳聚糖可注射水凝胶的具体实验过程：

将1.0g苯甲醛保护的壳聚糖溶解于浓度为0.5％(v/v)的NaOH溶液中，向溶液中缓慢加入环氧烯丙醚0.10g，于80℃水浴搅拌反应12h，反应后混合溶液倒入2mol/L的盐酸中，继续反应4h。将混合液装入透析袋中，于去离子水的环境中透析数天，每隔一段时间更换去离子水。透析完成后进行冷冻干燥数天，即可获得水溶性的O-烯丙基壳聚糖，其结构见通式(Ⅰ)。

将PNIPAM溶解于DMF：H₂O＝1：1的混合溶液中，加入氨基乙硫醇0.5g，氮气氛围下反应3天后，将混合液装入透析袋中，于去离子水的环境中透析数天，每隔一段时间更换去离子水。透析完成后进行冷冻干燥数天，即可获得巯基PNIPAM，其结构见通式(Ⅰ)。

采用核磁共振氢谱(¹H-NMR)表征了O-烯丙基壳聚糖分子内不同化学环境下的氢核的化学位移，其图谱如图2所示(上面的曲线为CS，下面的曲线位OAL-CS)。在化学位移为5.54ppm与5.80ppm处有两条谱线，这是乙烯基质子(＝CH₂)对应的化学位移。这说明化学改性后壳聚糖分子链上引入了带有双键的烯丙基基团。采用傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析表征了壳聚糖和N-甲基丙烯酰化壳聚糖分子中基团原子间振动跃迁时的特征吸收峰，其图谱如图3所示(上面的曲线为CS，下面的曲线为OAL-CS)。壳聚糖在1640cm^-1处的峰变宽变强，说明双键(C＝C)已经成功的接枝在壳聚糖分子上。

采用核磁共振氢谱(¹H-NMR)表征了巯基PNIPAM分子内不同化学环境下的氢核的化学位移，其图谱如图4所示(最上面的曲线代表链转移剂，中间的曲线代表PNIPAM，最下面的曲线代表HS-PNIPAM)。通过HS-PNIPAM的核磁可以看到，在化学位移为3.42ppm与2.68ppm处有两条谱线，这是巯基旁的亚甲基质子(-CH₂-)对应的化学位移。这说明化学改性后PNIPAM分子链末端引入了巯基基团。

将O-烯丙基壳聚糖溶于中性水溶液(如去离子水)中，配成浓度为20mg/mL的溶液，加入巯基PNIPAM使其浓度为10mg/mL，加入0.05wt％的光引发剂Irgacure2959，再加入0.1wt％的罗丹明B，将其滴加至培养皿底部的两载玻片之间，并加盖盖玻片，用波长为360～480nm，UV辐照度为4mW/cm²的紫外光辐照5秒。采用含有罗丹明B的N-甲基丙烯酰化壳聚糖(UV固化前后)在倾斜玻璃表面(倾斜角＝18.5°)流动性来表征是否完成固化。经过UV固化后的液滴能够保持固定形状且能抵抗重力流动，为凝胶状态。而未经UV固化的N-甲基丙烯酰化壳聚糖溶液在倾斜玻璃表面无法保持液滴形状，在重力作用下会发生流动，留下一条流动的痕迹。这说明N-甲基丙烯酰化壳聚糖溶液在UV固化后可形成其水凝胶，而未UV固化的N-甲基丙烯酰化壳聚糖溶液则仍表现为流动的溶液状态。

将上述配置的溶液置于聚二甲基硅氧烷的模具中，用波长为360～480nm，UV辐照度为4mW/cm²的紫外光辐照30秒，制备出直径为0.5cm的圆柱形水凝胶，称其重量为原始重量。将水凝胶置于pH＝5.0的溶液中，4℃下保持12h充分溶胀。用滤纸吸走凝胶表面的水，称其溶胀后的重量。计算其溶胀比如图5所示，当pH＝7.2时，大于37℃凝胶则显示收缩状态；当温度为37℃时，pH>6.8凝胶就显示收缩状态。温度和pH越高，凝胶收缩的程度越大。

实施例3：本实施例所涉及的一种pH和温度双响应的UV交联壳聚糖可注射水凝胶的具体实验过程：

将O-烯丙基壳聚糖溶于中性水溶液(如去离子水)中，配成浓度为2mg/mL的溶液，加入巯基PNIPAM使其浓度为1mg/mL，加入0.05wt％的光引发剂Irgacure2959，充分混合均匀。溶液置于聚二甲基硅氧烷的模具中，用波长为360～480nm，UV辐照度为4mW/cm²的紫外光辐照30秒，制备出直径为0.5cm的圆柱形水凝胶。称其重量为原始重量。将水凝胶置于pH＝6.8的溶液中，4℃下保持12h充分溶胀。用滤纸吸走凝胶表面的水，称其溶胀后的重量。计算其溶胀比。

实施例4：本实施例所涉及的一种pH和温度双响应的UV交联壳聚糖可注射水凝胶的具体实验过程：

将O-烯丙基壳聚糖溶于中性水溶液(如去离子水)中，配成浓度为2mg/mL的溶液，加入巯基PNIPAM使其浓度为1mg/mL，加入0.05wt％的光引发剂Irgacure2959，充分混合均匀。溶液置于聚二甲基硅氧烷的模具中，用波长为360～480nm，UV辐照度为4mW/cm²的紫外光辐照30秒，制备出直径为0.5cm的圆柱形水凝胶。称其重量为原始重量。将水凝胶置于pH＝7.2的溶液中，4℃下保持12h充分溶胀。用滤纸吸走凝胶表面的水，称其溶胀后的重量。计算其溶胀比。

实施例5：本实施例所涉及的一种pH和温度双响应的UV交联壳聚糖可注射水凝胶的具体实验过程：

将O-烯丙基壳聚糖溶于中性水溶液(如去离子水)中，配成浓度为2mg/mL的溶液，加入巯基PNIPAM使其浓度为1mg/mL，加入0.05wt％的光引发剂Irgacure2959，充分混合均匀。溶液置于聚二甲基硅氧烷的模具中，用波长为360～480nm，UV辐照度为4mW/cm²的紫外光辐照30秒，制备出直径为0.5cm的圆柱形水凝胶。称其重量为原始重量。将水凝胶置于pH＝8.0的溶液中，4℃下保持12h充分溶胀。用滤纸吸走凝胶表面的水，称其溶胀后的重量。计算其溶胀比。

实施例6：本实施例所涉及的一种pH和温度双响应的UV交联壳聚糖可注射水凝胶的具体实验过程：

将O-烯丙基壳聚糖溶于中性水溶液(如去离子水)中，配成浓度为2mg/mL的溶液，加入巯基PNIPAM使其浓度为1mg/mL，加入0.05wt％的光引发剂Irgacure2959，充分混合均匀。溶液置于聚二甲基硅氧烷的模具中，用波长为360～480nm，UV辐照度为4mW/cm²的紫外光辐照30秒，制备出直径为0.5cm的圆柱形水凝胶。称其重量为原始重量。将水凝胶置于pH＝5.0的溶液中，25℃下保持12h充分溶胀。用滤纸吸走凝胶表面的水，称其溶胀后的重量。计算其溶胀比。

实施例7：本实施例所涉及的一种pH和温度双响应的UV交联壳聚糖可注射水凝胶的具体实验过程：

将O-烯丙基壳聚糖溶于中性水溶液(如去离子水)中，配成浓度为2mg/mL的溶液，加入巯基PNIPAM使其浓度为1mg/mL，加入0.05wt％的光引发剂Irgacure2959，充分混合均匀。溶液置于聚二甲基硅氧烷的模具中，用波长为360～480nm，UV辐照度为4mW/cm²的紫外光辐照30秒，制备出直径为0.5cm的圆柱形水凝胶。称其重量为原始重量。将水凝胶置于pH＝5.0的溶液中，37℃下保持12h充分溶胀。用滤纸吸走凝胶表面的水，称其溶胀后的重量。计算其溶胀比。

实施例8：本实施例所涉及的一种pH和温度双响应的UV交联壳聚糖可注射水凝胶的具体实验过程：

将O-烯丙基壳聚糖溶于中性水溶液(如去离子水)中，配成浓度为2mg/mL的溶液，加入巯基PNIPAM使其浓度为1mg/mL，加入0.05wt％的光引发剂Irgacure2959，充分混合均匀。溶液置于聚二甲基硅氧烷的模具中，用波长为360～480nm，UV辐照度为4mW/cm²的紫外光辐照30秒，制备出直径为0.5cm的圆柱形水凝胶。称其重量为原始重量。将水凝胶置于pH＝5.0的溶液中，45℃下保持12h充分溶胀。用滤纸吸走凝胶表面的水，称其溶胀后的重量。计算其溶胀比。

实施例9：本实施例所涉及的一种pH和温度双响应的UV交联壳聚糖可注射水凝胶的具体实验过程：

将O-烯丙基壳聚糖溶于中性水溶液(如去离子水)中，配成浓度为2mg/mL的溶液，加入巯基PNIPAM使其浓度为1mg/mL，加入0.05wt％的光引发剂Irgacure2959，充分混合均匀。溶液置于聚二甲基硅氧烷的模具中，用波长为360～480nm，UV辐照度为4mW/cm²的紫外光辐照30秒，制备出直径为0.5cm的圆柱形水凝胶。称其重量为原始重量。将水凝胶置于pH＝6.0的溶液中，25℃下保持12h充分溶胀。用滤纸吸走凝胶表面的水，称其溶胀后的重量。计算其溶胀比。

实施例10：本实施例所涉及的一种pH和温度双响应的UV交联壳聚糖可注射水凝胶的具体实验过程：

将O-烯丙基壳聚糖溶于中性水溶液(如去离子水)中，配成浓度为2mg/mL的溶液，加入巯基PNIPAM使其浓度为1mg/mL，加入0.05wt％的光引发剂Irgacure2959，充分混合均匀。溶液置于聚二甲基硅氧烷的模具中，用波长为360～480nm，UV辐照度为4mW/cm²的紫外光辐照30秒，制备出直径为0.5cm的圆柱形水凝胶。称其重量为原始重量。将水凝胶置于pH＝6.8的溶液中，25℃下保持12h充分溶胀。用滤纸吸走凝胶表面的水，称其溶胀后的重量。计算其溶胀比。

实施例11：本实施例所涉及的一种pH和温度双响应的UV交联壳聚糖可注射水凝胶的具体实验过程：

将O-烯丙基壳聚糖溶于中性水溶液(如去离子水)中，配成浓度为2mg/mL的溶液，加入巯基PNIPAM使其浓度为1mg/mL，加入0.05wt％的光引发剂Irgacure2959，充分混合均匀。溶液置于聚二甲基硅氧烷的模具中，用波长为360～480nm，UV辐照度为4mW/cm²的紫外光辐照30秒，制备出直径为0.5cm的圆柱形水凝胶。称其重量为原始重量。将水凝胶置于pH＝8.0的溶液中，37℃下保持12h充分溶胀。用滤纸吸走凝胶表面的水，称其溶胀后的重量。计算其溶胀比。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，这些具体实施方式都是基于本发明整体构思下的不同实现方式，而且本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。