阅读说明：本技术 用于nadh测量的生物传感器用电极及其制造方法 (Biosensor electrode for NADH measurement and method for manufacturing the same ) 是由 李圭弘 于 2018-12-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及用于NADH测量用生物传感器的电极及其制造方法,在通过根据本发明的方法制造的电极中,在电聚合反应时电流流动稳定,改性后的物质的接触角显着减小,从而具有能够提高表面改性效率并且电极能够重复使用多次的优点。此外,在本发明的所述电极用于NADH测量用生物传感器的情况下,在没有干扰现象的情况下保持高水平的灵敏度和选择性,从而在存在极少量的测量物质而必须进行预处理过程的血液或血清中也能够容易地测量目标对象。此外,在所述电极用于NADH测量用生物传感器的情况下,能够连续且实时地测量细胞活度而能够应用于细胞毒性评估领域,并且能够测量丧失了线粒体功能的死细胞中的细胞活度。(The present invention relates to an electrode for a biosensor for measuring NADH and a method for manufacturing the same, in which current flow is stable at the time of electropolymerization reaction, and a contact angle of a modified substance is remarkably reduced, thereby having advantages that surface modification efficiency can be improved and the electrode can be repeatedly used several times. Further, in the case where the electrode of the present invention is used for a biosensor for measuring NADH, a high level of sensitivity and selectivity is maintained without interference phenomenon, so that a target object can be easily measured also in blood or serum in which a pretreatment process is necessary in the presence of an extremely small amount of a measuring substance. Further, in the case where the electrode is used for a biosensor for measuring NADH, the cell activity can be continuously measured in real time, and can be applied to the field of cytotoxicity assessment, and the cell activity in dead cells that have lost mitochondrial function can be measured.)

用于NADH测量的生物传感器用电极及其制造方法

技术领域

本发明涉及生物传感器用电极及其制造方法，具体地，涉及用于NADH(NAD的还原态，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原态)测量用生物传感器的电极及其制造方法。

背景技术

随着生物技术的发展，对更快、更准确的分析技术的要求和需求正逐渐增多。在这些分析技术中，最近进行了许多关于生物传感器的研究。特别地，通过模拟生物功能来应用电子工程，对生物传感器的需求不断增加，该生物传感器是能够感测来自外部的物理或化学刺激的生物装置。这些生物传感器因对测量对象的选择性或灵敏度非常高而备受关注。

迄今为止，已经对生物传感器进行了各种研究，并且这些生物传感器可以分为利用酶、菌类以及诸如动植物的组织的生物材料。它可以分为识别特定分子并引起与其浓度成比例的物理或化学变化的部分以及将这些物质的化学变化转换为电信号位点的部分。该生物传感器尤其能够选择性地识别样品中的特定分子并且不需要单独的纯化，因此具有检测时间非常短和准确性非常高的优点。

基于电化学的生物传感器将电化学方法的分析能力与生物识别的特异性结合在一起。即，通过在电极表面固定或包含酶、抗原、抗体或生化物质等生物特异性试剂，通过电流或电位的变化来检测生物识别现象。在这种基于电化学的生物传感器中，电极本身的电阻和发生电化学反应的表面特性非常重要。

此外，维持作为负责生命活动中必不可少的ATP合成的细胞的小器官的线粒体的稳态在生命活动中非常重要，在发生异常时，可能引起同时多发性疾病，例如代谢紊乱和脑中风。为了确认所述线粒体的功能，常用的是线粒体内呼吸时产生的辅酶。尤其是，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide,NAD)是细胞中发现的重要辅酶之一，被广泛用于细胞呼吸中的糖酵解和TCA循环中，相当于所述NAD的还原态的NADH(Reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide)中存储的还原电位通过电子传输系统转换为ATP或用于同化反应。

因此，尽管许多研究集中在NADH反应的基础科学应用上，但是在常规吸光法的情况下，血液中NADH测量具有非常严重的干扰现象，而灵敏度低且选择性显著降低，样品消耗量非常多，预处理过程复杂，因此难以容易地进行测量。而且，相关技术的WST-1和MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)分析方法相当于如下方式：在施用化学物质后，诱导NADH因子和显色反应，从而在特定波长下测量吸光度，但是该方式需要大量样品，反应时间长，并且由于分解能力较差而不适用于连续和实时监测。另外，为了通过电化学方法测量NADH，在诱导酶反应或放入作为活跃地进行电子传输的催化材料的钌或氰离子的介体后，测量NADH的氧化还原电流，但是在这种情况下，由于通常在1000mV以上的电压值下发生氧化和还原，因此电极表面受损，并且不可能重复测量，并且分解能力显着降低。

发明内容

技术问题

本发明人发现如下事实从而完成了本发明：在用4-氨基苯硫酚对生物传感器用电极的表面进行改性的过程中，通过在施加循环伏安法的步骤中改变施加电压时浸入溶液的浓度的步骤来制备，从而不仅显着地提高了改性效率，而且具有高灵敏度和选择性，并且能够重复使用多次。

在本发明中，提供一种用于生物传感器的电极制造方法，包括：

步骤a)：用硫酸洗涤电极；

步骤b)：将所述步骤a)的电极放入4-氨基苯硫酚中并培养，然后浸入第一溶液中并施加电压；以及

步骤c)：将所述步骤b)的电极浸入第二溶液中并施加电压。

在本发明中，所述步骤b)的第一溶液可以是摩尔浓度为90mM至100mM的磷酸盐缓冲液。

此外，在本发明中，所述步骤c)的第二溶液可以是摩尔浓度为5mM至15mM的磷酸盐缓冲液。

在本发明中，在所述步骤b)和所述步骤c)中，可以通过循环伏安法施加电压。

此外，在本发明中，在所述步骤b)和所述步骤c)中，可以通过循环伏安法以0.8V至-0.4V电位进行扫描。

此外，在本发明中，所述电极可以是选自由金、铝、铂、镍、石墨烯、银纳米线膜、金属栅格和铟锡氧化物构成的组中的一者以上。

在本发明中，所述用于生物传感器的电极可以用于测量NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原态)。

提供一种用于生物传感器的电极，所述电极通过根据本发明的制造方法制造并且用于测量NADH。

提供一种生物传感器，包括根据本发明的电极。

在下文中，将详细描述根据本发明的用于测量所述NADH的生物传感器用电极。

在本发明的一实现例中，提供一种用于生物传感器的电极制造方法，包括：步骤a)：用硫酸洗涤电极；步骤b)：将所述步骤a)的电极放入4-氨基苯硫酚(4-ATP)中并培养，然后浸入第一溶液中，然后施加电压；以及步骤c)：将所述步骤b)的电极浸入第二溶液中，然后施加电压。

在本发明中，所述步骤a)中用硫酸洗涤电极的步骤可以为1小时至3小时，优选为2小时，但不限于此。当洗涤所述电极少于1小时且超过3小时时，不能充分地进行电极表面的蚀刻。

在本发明中，所述用于生物传感器的电极可以用于测量NADH。

在本发明中，所述“生物传感器(Biosensor)”是指一种分析装置，其将物理化学检测器与能够与生物元素或分析物反应的物质结合在一起，并用于搜索分析物。通过对敏感的生物元素、生物分离的样品等进行工程设计，可以转换信号，从而更易于测量和量化与分析对象物质相互作用而产生的信号。为了本发明的目的，可以与所述分析物反应的物质可以是用于测量NADH的N-苯基醌二亚胺。

此外，在本发明中，在所述步骤a)中，所述硫酸的摩尔浓度可以为5mM至15mM，优选为10mM，但不限于此。在硫酸的摩尔浓度小于5mM以及大于15mM的情况下，电极的表面可能不能被充分蚀刻或电极可能被腐蚀。

在本发明中，所述“4-氨基苯硫酚”是有机物质，其能够形成作为自发地涂覆在电极表面上的规则有序的有机分子膜的自组装单层，可以通过在NADH氧化和还原过程中产生的电子改变所述4-氨基苯硫酚的NH₂的状态的过程来测量样品中NADH的含量。

在本发明中，所述第一溶液和第二溶液可以是磷酸盐缓冲液(PBS)。为了本发明的目的，所述第一溶液可以是摩尔浓度为90mM至100mM的磷酸盐缓冲液，所述第二溶液可以是摩尔浓度为5mM至15mM的磷酸盐缓冲液，但不限于此。如上所述，当通过改变第一溶液和第二溶液的摩尔浓度进行电聚合反应时，通过稳定电流流动，N-苯基醌二亚胺与电极之间的接触角可以从48减小至39而且电极可以重复使用多达20次。另外，在本发明中，在所述第一溶液的摩尔浓度小于90mM以及大于100mM的情况下，不能充分产生亚胺，并且在所述第二溶液的摩尔浓度小于5mM以及大于15mM的情况下，不能如本发明所期望的那样充分减小接触角。

在本发明中，当如上所述使N-苯基醌二亚胺的接触角减小时，显着增加可结合至电极表面的N-苯基醌二亚胺，从而与NADH的反应变得活跃，这导致电极的灵敏度，从而在样品内存在极少量的NADH的情况下也能够进行检测。

在本发明中，所述“循环伏安法”是能够直接掌握电极表面上正在发生的反应的方法之一，在与时间成比例地改变电位时，多次重复将流动电流记录为电流-电位曲线的方法而进行电位扫描。为了本发明的目的，在所述步骤b)和步骤c)中施加电压的步骤可以通过循环伏安法进行，优选以0.8V至-0.4V电位进行扫描，但不限于此。

在本发明的一具体例中，根据本发明的所述电极可以为选自由金、铝、铂、镍、石墨烯、银纳米线膜、碳、金属栅格和铟锡氧化物构成的组中的一者以上。优选地，所述电极可以为金，但不限于此。

在本发明的另一实现例中，提供一种用于生物传感器的电极，所述电极通过根据本发明的制造方法制造并且用于测量NADH。

在本发明的所述用于生物传感器的电极中，与电极、生物传感器、循环伏安法、第一溶液和第二溶液有关的内容与在所述制造方法中描述的内容重复，并且以下省略详细描述。

在本发明的又一实现例中，提供一种生物传感器，包括根据本发明的电极。

在本发明的所述生物传感器中，与电极、生物传感器、循环伏安法、第一溶液和第二溶液有关的内容与在所述制造方法中描述的内容重复，并且以下省略详细描述。

在本发明中，出于本发明的目的，所述生物传感器可以更适合于测量NADH。

除了根据本发明的电极之外，本发明的所述生物传感器还可以包括通常可以被包括在生物传感器中的生物转换器、放大器、加工机械以及包括屏幕的电子系统等。

在本发明的一具体例中，所述生物传感器通过如下过程测量样品内的NADH值，通过在样品中所含的NADH的氧化过程中产生的电子，使与电极表面结合的N-苯基醌二亚胺的亚胺转化为胺，然后再次转化为亚胺，同时测量产生的电子并变更为能够量化的值。通过诸如wst-1或MTT分析法的显色反应，通过与线粒体内的脱水酶反应而测量NADH的氧化还原反应的相关技术的情况下，必须以线粒体的完整功能为前提，但是通过上述测量方法，在通过根据本发明的制造方法制造的电极中，所述生物传感器的测量方法相应于主要反应而不是酶反应，因此不需要脱水酶，因此通过细胞死亡时释放到培养液中的NADH的定量测量能够测量细胞活度。

图7是使用根据本发明的生物传感器的样品中的NADH测量过程的示意图，下面将参考该图进行详细描述。

如图7的(a)所示，为了测量血液中NADH的存在与否，在提取目标对象的样品之后，不进行单独的样品预处理过程，通过包括根据本发明的所述电极的生物传感器可以执行测量放出的电子的量并将其量化的过程。

另外，如图7的(b)所示，为了测量响应于细胞死亡而产生的NADH的量，将目标细胞的培养液施加至包括根据本发明的电极的生物传感器后，测量放出的电子的量并将其量化，从而可以测量细胞死亡的程度。

与现有技术的电极相比，通过根据本发明的上述制造方法制造的电极，具有显着更高的N-苯基醌二亚胺的结合度，因此具有高灵敏度而能够测量样品中所含的少量NADH，如如上所述过程，即使不进行单独的样品预处理也能够进行测量。

有益效果

在通过根据本发明的方法制造的电极中，不仅在电聚合反应时电流流动稳定，而且接触角也显着减小，从而能够提高表面改性效率。此外，通过该过程，生物传感器中使用的电极可以重复使用多次。

另外，在根据本发明的电极用于生物传感器的情况下，在没有干扰现象的情况下保持灵敏度和选择性，从而在不进行与极少量相应的预处理过程的血液或血清中也能够测量目标对象，并且能够连续且实时地测量细胞活度，并且可以应用于细胞毒性领域。另外，能够通过测量丧失了线粒体功能的死细胞中分泌到血清中的NADH来测量细胞活度。

附图说明

图1示出了根据本发明的一实施例的电极的改性表面的示意图和亲水性程度的测量结果。

图2示出了根据本发明的一实施例的测量在表面改性时出现的亚胺的接触角的图。

图3示出了根据本发明的一实施例的根据磷酸盐缓冲液的浓度的循环伏安法测量结果。

图4示出了根据本发明的一实施例的通过SEM对电极的表面执行图像分析的结果。

图5示出了根据本发明的一实施例的通过SEM对电极的表面上执行图像分析的结果。

图6示出了根据本发明的一实施例的使用电极的各浓度的NADH测量值。

图7的(a)和(b)示出了根据本发明的一实施例的使用NADH测量用生物传感器的NADH测量过程的示意图。

具体实施方式

在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅旨在更具体地说明本发明，对于本领域的普通技术人员而言显而易见的是，根据本发明的主旨，本发明的范围不受这些实施例限制。

实施例

[制造例]用于NADH测量的生物传感器用电极的制造

通过执行以下步骤来制造适于用于NADH测量的生物传感器的电极。

用摩尔浓度为10mM的硫酸(H₂SO₄)洗涤金(Au)电极。然后，为了形成自组装膜，将所述电极浸入以10mM的摩尔浓度制备的4-氨基苯硫酚中，然后培养2小时。其后，将所述电极浸入摩尔浓度为100mM(高浓度)的磷酸盐缓冲液中，通过循环伏安法从0.8V向-0.4V电位进行电压扫描，通过上述过程形成N-苯基醌二亚胺(以下称为“NPQD”)。将形成有所述NPQD的电极浸入摩尔浓度为10mM(低浓度)的磷酸盐缓冲液后，施加与在所述100mM磷酸盐缓冲液中形成NPQD的步骤相同的电压来再次进行电压扫描，最终制造根据本发明的电极。

[比较例]电极制造

为了与上述制造例进行比较，仅使用高浓度的磷酸盐缓冲液来进行对电极表面进行改性的过程。具体地，用摩尔浓度为10mM的硫酸(H₂SO₄)洗涤金(Au)电极。然后，为了形成自组装膜，将所述电极浸入以10mM的摩尔浓度制备的4-氨基苯硫酚中，然后培养2小时。其后，将所述电极浸入摩尔浓度为100mM(高浓度)的磷酸盐缓冲液中，通过循环伏安法从0.8V向-0.4V电位进行电压扫描，通过上述过程形成NPQD。

[实施例1]4-氨基苯硫酚接触角测量

确认在根据所述制造例的电极的表面上形成的NPQD的接触角的变化。具体地，在室温和46％的湿度条件下将10μl的蒸馏水滴在所述制备例的电极上之后，对每个电极拍照并通过IMAGE J软件利用由制造商提供的方法测量分析接触角，其结果在图1和图2中示出。

如图1和图2所示，可知，与制备例的表面结合的NPQD可以以更多的量与该表面结合，由此电极的表面被转化为具有更大的亲水性。特别地，如图2所示，比较例和仅结合4-氨基苯硫酚的情况下的接触角几乎没有变化，而在制造例的情况下，接触角从55°显着降低到39°。

通过以上结果可以看出，根据本发明的制造例可以通过与高浓度和低浓度的磷酸盐缓冲液的两个反应步骤显着降低NPQD的接触角，从而使表面亲水。

[实施例2]测量比较电流值稳定性

为了比较高浓度的磷酸盐缓冲液(100mM)和低浓度的磷酸盐缓冲液(10mM)的电流值的稳定性，使用CH1040C系列多电位计设备利用由制造商提供的协议进行电化学分析，其结果如图3所示。

如图3所示，在高浓度的磷酸盐缓冲液中测量的电流值比较不稳定，而在10mM的低浓度的磷酸盐缓冲液中其电流值非常稳定。

从以上结果可以看出，在根据本发明的制造例的制造中，通过在高浓度和低浓度的条件下改变步骤来进行聚合反应，可以使电流值稳定。

[实施例3]电极表面测量

当在包括制造例和比较例的生物传感器中多次测量NADH时，用扫描电子显微镜(SEM)测量电极表面的变化，其结果示于图4和5。然而，为了进行扫描电子显微镜测量，以10nm的厚度对电极执行喷镀(sputter)过程。

另外，使用生物传感器对NADH进行测量是通过以下过程进行的：测量通过将包含NADH的样品添加至生物传感器并随后施加-600mV的电压10秒而产生的电流的最终值。

如图4所示，在比较例中，发现在参考电极(RE)和工作电极(WE)两个部位都很好地产生了NPQD，但是在重复使用20次之后进行测量的情况下，在参考电极和工作电极两个部位中在多次用于NADH测量的情况下，表面会迅速变质。

相反，如图5所示，在制造例的情况下，不仅在参考电极和工作电极两个部位中均良好地产生了NPQD，而且即使在重复使用20次之后进行测量，表面的变质程度也显著低。

通过以上结果，可以看出，作为本发明的制造例的电极，在应用于生物传感器时，可以在测量中多次重复使用。

[实施例4]NADH灵敏度测量结果

为了比较制备例和比较例的NADH测量灵敏度，通过与所述实施例3的方法相同的方法测量样品内的NADH，其结果示于图6。

如图6所示，在制造例的情况下，100μM的NADH测量值对应于约140％，相反，在比较例的情况下，测量的值对应于110％，在制造例的情况下，140μM的NADH测量值对应于约155％，相反，在比较例的情况下，对应于约120％，这是显著低的程度。

通过以上结果可知，与比较例相比，使用根据本发明的制备例的电极对NADH进行测量时，灵敏度显著高。

上面详细描述了本发明，但是本发明的权利范围不限于此，对于本领域的普通技术人员而言显而易见的是，在不脱离权利要求中所阐述的本发明的技术思想的范围内，可以进行各种修改和变型。