阅读说明：本技术 一种利用核桃粕制备二肽基肽酶ⅳ抑制活性肽的方法及其应用 (Method for preparing dipeptidyl peptidase IV inhibiting active peptide by using walnut meal and application thereof ) 是由 孔祥珍 张丽娜 华欲飞 宋伟光 张彩猛 陈业明 李兴飞 于 2020-05-18 设计创作，主要内容包括：一种利用核桃粕制备二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽的方法及其应用,属于植物蛋白质深加工技术领域。本发明以脱脂核桃粕为原料,首先对其进行醇洗、酸洗和高速剪切处理,加入碱性蛋白酶水解得到酶解液；经脱盐和干燥得到二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽。本发明方法制备的核桃肽具有良好的降血糖和抗氧化功能活性,产品得率和蛋白质含量高,实现了核桃粕的深加工和综合利用,对于提高其附加值具有重要意义。(A method for preparing dipeptidyl peptidase IV inhibiting active peptide by using walnut meal and application thereof belong to the technical field of plant protein deep processing. The invention takes the degreased walnut dregs as the raw material, firstly carries out alcohol washing, acid washing and high-speed shearing treatment on the degreased walnut dregs, and adds alkaline protease for hydrolysis to obtain enzymatic hydrolysate; desalting and drying to obtain the dipeptidyl peptidase IV inhibiting active peptide. The walnut peptide prepared by the method has good activity of reducing blood sugar and resisting oxidation, high product yield and high protein content, realizes deep processing and comprehensive utilization of walnut meal, and has important significance for improving the added value of the walnut meal.)

一种利用核桃粕制备二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽的方法及其 应用

技术领域

本发明涉及一种利用核桃粕制备二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽的方法及其应用，属于植物蛋白质深加工技术领域。

背景技术

糖尿病（DM）是一种与高血糖相关的代谢性疾病，是全球范围内的常见病。糖尿病有两种类型，胰岛素依赖型糖尿病（I型糖尿病）和非胰岛素依赖型糖尿病（II型糖尿病）。I型糖尿病（T1DM）是由于自身免疫反应破坏了胰岛β细胞而导致胰腺无法分泌胰岛素而引起的。II型糖尿病（T2DM）是由胰岛素产生不足或人体无法利用产生的胰岛素引起的复杂疾病。II型糖尿病发病率呈逐步上升趋势，大约占诊断病例的90%~95%，给社会、健康和经济造成沉重负担。目前尚未发现可以治愈T2DM的药物。现有药物主要通过控制血糖水平的升高，增加机体对胰岛素的敏感性以及减少高血糖症对机体造成的损害来发挥作用。

二肽基肽酶IV（DPP-IV）是一种丝氨酸蛋白酶，广泛分布在人体的许多组织中，负责肠降血糖素激素胰高血糖素样肽1（GLP-1）和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽（GIP）的降解和失活。DPP-IV抑制剂可以延长GLP-1和GIP的作用，从而刺激胰岛素分泌来调节血糖水平，因此成为治疗T2DM的最新手段。现在一些化学合成的DPP-IV抑制剂，例如西他列汀、维达列汀和沙格列汀等，是临床上治疗糖尿病的有效药物，但是，这些药物价格昂贵，治疗糖尿病的同时会产生副作用，长期安全性尚未确立。所以，从天然食物蛋白质中提取具有DPP-IV抑制作用的活性成分，具有重大意义。目前，食源性植物蛋白肽已经表现出对DPP-IV的抑制作用。

核桃在我国的栽培面积和产量均位于世界前列，自身丰富的生理活性组分使其具有健脑益智的功效。核桃蛋白含有大量的精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸，精氨酸作为一氧化氮（NO）合成的前体，在调控人体生理活动方面起着重要作用，其生成的NO有利于促进血管舒张和增强机体免疫活性；谷氨酸具有改善神经机能的作用，通过在体内参与γ-氨基丁酸（GABA）的合成，进而促进大脑的能量代谢，增加氧供给量。核桃蛋白营养价值独特，而且含有丰富的生物活性肽序列，是开发活性多肽的良好来源。

近年来，核桃油的市场需求量不断增加，脱脂核桃粕作为核桃油加工副产品，蛋白含量高达50%以上，但是由于蛋白质深加工技术的局限，核桃粕通常被用作饲料或者肥料，造成核桃资源的浪费。因此，通过酶解技术制备具有抗氧化活性和DPP-IV抑制活性的核桃多肽，不仅有利于拓宽核桃蛋白的应用范围并促进天然抗氧化剂和降血糖食品的开发。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种利用核桃粕制备二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽的方法及其应用，通过此方法制备的活性肽得率和蛋白质含量较高，具有良好的抗氧化活性和二肽基肽酶Ⅳ抑制活性。

本发明的技术方案，一种利用核桃粕制备二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽的方法，其特征在于步骤如下：

（1）醇洗：对脱脂核桃粕进行醇洗处理，得到醇洗核桃粕；

（2）酸洗：对醇洗核桃粕进行酸洗处理，得到核桃蛋白凝乳；

（3）剪切：将核桃蛋白凝乳与去离子水混合，进行高速剪切处理；

（4）水解：加入碱性蛋白酶在一定条件下进行酶水解得到粗酶解液；

（5）后处理：粗酶解液经脱盐与干燥后得到粉状的二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽。

进一步地，步骤（1）中，取脱脂核桃粕粉加入4~6倍体积、体积浓度为85%的乙醇溶液，在40~50℃的条件下搅拌洗涤0.5~2 h，之后抽滤；取出滤饼在30~40℃干燥以除去残余乙醇，得到醇洗核桃粕。

进一步地，步骤（2）中，将步骤（1）制备所得醇洗核桃粕与去离子水混合，配制成质量浓度为10%~15%的悬浮液，调节pH 4.5~6.5，常温下搅拌1 h，3000~5000 r/min离心15~30min，收集沉淀；重复上述步骤进行酸洗2~4次，收集沉淀，得到核桃蛋白凝乳。

进一步地，步骤（3）中，将步骤（2）制备所得的核桃蛋白凝乳与去离子水混合，配制成质量浓度为8%~12%的悬浮液，调节pH为8.0~9.0，温度50~65℃，剪切时间为4~10 min，剪切速度为8000~12000 r/min。

进一步地，步骤（4）中，向步骤（3）所得高速剪切处理后的核桃蛋白悬浮液添加碱性蛋白酶，加酶量E/S为1.5%~3%，酶解过程维持温度50~65℃和pH 8.0~9.0恒定，酶解4~6 h后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10 min，3000~5000 r/min离心20 min，所得上清液即为粗酶解液。

进一步地，步骤（5）脱盐时，物料质量浓度为2%~5%，pH为6.0~8.0，纳滤膜的截留分子量MWCO为150~300 Da，操作温度为20~30℃，压力在0.4~0.7 MPa之间，循环3~6次，收集截留液。

进一步地，步骤（5）干燥时，对纳滤后收集的滤出液通过喷雾干燥得到粉状的二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽。

所述方法制备得到的二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽的应用，将其应用于制备降血糖或抗氧化产品中。

所述方法制备的核桃二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽，色泽良好，得率大于65%，蛋白质含量高于80%，分子量小于2000 Da的肽段占到80%以上。

所述方法制备的核桃二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽具有良好的二肽基肽酶Ⅳ抑制活性（IC₅₀不高于1.0 mg/mL）和抗氧化活性包括：体外DPPH自由基清除活性（IC₅₀不高于0.20mg/mL）、ABTS自由基清除活性（IC₅₀不高于50 μg/mL）和羟基自由基清除活性（IC₅₀不高于1.5 mg/mL）。

分析方法：

1、蛋白质含量的测定：半微量凯氏定氮法（GB5009.5-2016）；

2、肽得率的测定：肽粉总得率（%）= 核桃肽粉蛋白质量×100/核桃粕中总蛋白质量；

3、肽的分子量测定：采用凝胶色谱法对制备的肽产品进行分子量分布的测定。将待测样品配置为5~10 mg/mL的浓度，在10000 r/min的转速下离心10 min，过0.22 μm醋酸纤维素微孔滤膜后取20 μL进色谱柱TSK-gel G2000 SW_XL（7.8 mm×300 mm）进行分析检测。柱子之前已由流动相（乙腈、水、TFA体积比为45:55:0.1）平衡。检测波长及柱温分别为214 nm、30℃，流动相流速为0.5 mL/min，每个样品的时间为45 min。分子量分布标准物采用：细胞色素C（12500 Da）、抑菌肽（6500 Da）、杆菌肽（1450 Da）、GGAT（450 Da）、GGG（189 Da）。

4、二肽基肽酶Ⅳ抑制活性的测定：在96孔酶标板中，将25 μL样品（溶解在pH 8.0，100 mmol/L Tris-HCl缓冲液中）与25 μL Gly-Pro-PNA（1.6 mmol/L）混合，在37℃孵育10min，加入50 μL DPP-Ⅳ（8 U/L）溶液启动反应，37℃反应60 min，然后添加100 μL乙酸钠缓冲液（1 mol/L，pH 4.0）终止反应，于405 nm处测量吸光度。以Tris-HCl缓冲液代替DPP-Ⅳ溶液作为空白组，以Tris-HCl缓冲液代替样品作为对照组。DPP-Ⅳ抑制率计算公式为：

式中：

A_s：样品反应体系在405 nm处的吸光值；

A_b：空白组在405 nm处的吸光值；

A_c：对照组在405 nm处的吸光值。

5、抗氧化活性的测定：

DPPH自由基清除活性测定方法为：在96孔酶标板中，将100 μL核桃肽溶液与等体积的0.2 mmol/L DPPH溶液混合，在室温下避光反应30 min，并使用酶标仪（Bio-Rad）在517 nm处读取吸光度。以多肽浓度和DPPH自由基清除活性做回归曲线，建立回归方程，计算IC₅₀值，即清除50%的DPPH自由基时对应的肽浓度。

ABTS自由基清除活性测定方法为：将7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L过硫酸钾溶液（终浓度）混合，然后在室温下避光反应12~16 h产生ABTS自由基阳离子（ABTS^•+）。使用前，将ABTS^•+溶液用10 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）稀释至734 nm处的吸光度为0.70 ±0.02。将50 μL样品与150 μL ABTS^•+溶液合并，在30℃下避光反应30 min，然后在734 nm处测定吸光度。以多肽浓度和ABTS自由基清除活性做回归曲线，建立回归方程，计算IC₅₀值，即清除50%的ABTS自由基时对应的肽浓度。

羟基自由基清除活性测定方法为：将1.0 mL样品与1.0 mL 3 mmol/L FeSO₄溶液和1.0 mL 3 mmol/L水杨酸-乙醇溶液混合。然后，加入1.0 mL 6 mmol/L的H₂O₂溶液，在37℃下避光反应30 min，在510 nm处测定吸光度以多肽浓度和羟基自由基清除活性做回归曲线，建立回归方程，计算IC₅₀值，即清除50%的羟基自由基时对应的肽浓度。

本发明的有益效果：本发明制备所得的二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽其抗氧化和二肽基肽酶Ⅳ抑制活性强，产品得率和蛋白质含量较高。本发明适合工业化生产，制得的活性多肽具有良好的功能特性及一定的生理功能，可以应用于食品、饲料、保健品、医药及日用化工等诸多领域。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明进行进一步阐述。

实施例1

（1）醇洗：取脱脂核桃粕粉加入6倍体积、体积浓度为85%的乙醇溶液，在50℃的条件下搅拌洗涤1 h，之后抽滤；取出滤饼在40℃干燥以除去残余乙醇，即得醇洗核桃粕。

（2）酸洗：将醇洗核桃粕与去离子水混合，配制成质量浓度为10%的悬浮液，调节pH4.5，搅拌1 h，3000 r/min离心20 min，收集沉淀；酸洗4次，收集沉淀，得到核桃蛋白凝乳。

（3）剪切：将核桃蛋白凝乳与去离子水混合，配制成质量浓度为10%的悬浮液，调节pH为9.0，温度55℃，剪切时间为5 min，剪切速度为10000 r/min。

（4）水解：接着添加碱性蛋白酶（E/S=2.0%），酶解过程维持温度（55℃）和pH（9.0）恒定，酶解5 h后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10 min，3000 r/min离心20 min，所得上清液即为粗酶解液。

（5）后处理：采用纳滤对所制备的粗酶解液进行脱盐处理，采用截留分子量（MWCO）为150 Da的纳滤膜，物料浓度为5%，pH为7.0，操作温度为20℃、操作压力为0.4 MPa，循环6次，收集截留液，进行灭菌喷雾干燥处理，得到粉状的二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽。

二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽的得率为76.74%，蛋白质含量为85.12%，相对分子质量小于2000 Da的肽占81.6%。体外对二肽基肽酶Ⅳ抑制活性的IC₅₀值为0.90 mg/mL。抗氧化活性包括：体外清除DPPH自由基、ABTS自由基和羟基自由基的IC₅₀分别为0.109 mg/mL、39.890μg/mL和1.174 mg/mL。

实施例2

（1）醇洗：取脱脂核桃粕粉加入5倍体积、体积浓度为85%的乙醇溶液，在45℃的条件下搅拌洗涤1.5 h，之后抽滤；取出滤饼在40℃干燥以除去残余乙醇，即得醇洗核桃粕。

（2）酸洗：将醇洗核桃粕与去离子水混合，配制成质量浓度为10%的悬浮液，调节pH5.0，搅拌1 h，3000 r/min离心20 min，收集沉淀；酸洗3次，收集沉淀，得到核桃蛋白凝乳。

（3）剪切：将核桃蛋白凝乳与去离子水混合，配制成质量浓度为9%的悬浮液，调节pH为8.5，温度55℃，剪切时间为6 min，剪切速度为9000 r/min。

（4）水解：得到核桃蛋白悬浮液，添加碱性蛋白酶（E/S=2.0%），酶解过程维持温度（55℃）和pH（8.5）恒定，酶解5 h后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10 min，4000 r/min离心20 min，所得上清液即为粗酶解液。

（5）后处理：采用纳滤对所制备的粗酶解液进行脱盐处理，采用截留分子量（MWCO）为150 Da的纳滤膜，物料浓度为3%，物料pH为7.0，操作温度为20℃、操作压力为0.4 MPa，循环3次，收集截留液，进行灭菌喷雾干燥处理，得到粉状的二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽。

二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽的得率为72.35%，蛋白质含量为82.65%，相对分子质量小于2000 Da的肽占80.98%。体外对二肽基肽酶Ⅳ抑制活性的IC₅₀值为0.92 mg/mL。抗氧化活性包括：体外清除DPPH自由基、ABTS自由基和羟基自由基的IC₅₀分别为0.125 mg/mL、42.832μg/mL和1.125 mg/mL。

实施例3

（1）醇洗：取脱脂核桃粕粉加入5倍体积、体积浓度为85%的乙醇溶液，在40℃的条件下搅拌洗涤2.0 h，之后抽滤；取出滤饼在35℃干燥以除去残余乙醇，即得醇洗核桃粕。

（2）酸洗：将醇洗核桃粕与去离子水混合，配制成质量浓度为10%的悬浮液，调节pH5.5，搅拌1 h，4000 r/min离心20 min，收集沉淀；酸洗2次，收集沉淀，得到核桃蛋白凝乳。

（3）剪切：将核桃蛋白凝乳与去离子水混合，配制成质量浓度为10%的悬浮液，调节pH为9.0，温度60℃，剪切时间为5 min，剪切速度为12000 r/min，得到核桃蛋白悬浮液。

（4）水解：添加碱性蛋白酶（E/S=1.5%），酶解过程维持温度（60℃）和pH（9.0）恒定，酶解5 h后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10 min，3000 r/min离心20 min，所得上清液即为粗酶解液。

（5）后处理：采用纳滤对所制备的粗酶解液进行脱盐处理，采用截留分子量（MWCO）为300 Da的纳滤膜，物料浓度为4%，物料pH为7.0，操作温度为20℃、操作压力为0.4 MPa，循环6次，收集截留液，进行灭菌喷雾干燥处理，得到粉状的二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽。

二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽的得率为70.25%，蛋白质含量为84.65%，相对分子质量小于2000 Da的肽占80.16%。体外对二肽基肽酶Ⅳ抑制活性的IC₅₀值为0.91 mg/mL。抗氧化活性包括：体外清除DPPH自由基、ABTS自由基和羟基自由基的IC₅₀分别为0.118 mg/mL、38.187μg/mL和1.102 mg/mL。

实施例4

（1）醇洗：取脱脂核桃粕粉加入4倍体积、体积浓度为85%的乙醇溶液，在45℃的条件下搅拌洗涤2h，之后抽滤；取出滤饼在40℃干燥以除去残余乙醇，即得醇洗核桃粕。

（2）酸洗：将醇洗核桃粕与去离子水混合，配制成质量浓度为10%的悬浮液，调节pH6.0，搅拌1 h，5000 r/min离心15 min，收集沉淀；酸洗3次，收集沉淀，得到核桃蛋白凝乳。

（3）剪切：将核桃蛋白凝乳与去离子水混合，配制成质量浓度为12%的悬浮液，调节pH为9.0，温度65℃，剪切时间为5min，剪切速度为11000 r/min，得到核桃蛋白悬浮液。

（4）水解：添加碱性蛋白酶（E/S=1.8%），酶解过程维持（65℃）和pH（9.0）恒定，酶解5 h后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10 min，4500 r/min离心20 min，所得上清液即为粗酶解液。

（5）后处理：采用纳滤对所制备的粗酶解液进行脱盐处理，采用截留分子量（MWCO）为150 Da的纳滤膜，物料浓度为3%，物料pH为7.0，操作温度为25℃、操作压力为0.6 MPa，循环5次，收集截留液，进行灭菌喷雾干燥处理，得到粉状的二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽。

二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽的得率为67.55%，蛋白质含量为83.27%，相对分子质量小于2000 Da的肽占82.42%。体外对二肽基肽酶Ⅳ抑制活性的IC₅₀值为0.94 mg/mL。抗氧化活性包括：体外清除DPPH自由基、ABTS自由基和羟基自由基的IC₅₀分别为0.115 mg/mL、42.357μg/mL和1.180 mg/mL。

实施例5

（1）醇洗：取脱脂核桃粕粉加入4.5倍体积、体积浓度为85%的乙醇溶液，在50℃的条件下搅拌洗涤0.5 h，之后抽滤；取出滤饼在30℃干燥以除去残余乙醇，即得醇洗核桃粕。

（2）酸洗：将醇洗核桃粕与去离子水混合，配制成质量浓度为15%的悬浮液，调节pH5.3，搅拌1 h，3000 r/min离心30 min，收集沉淀；酸洗2次，收集沉淀，得到核桃蛋白凝乳。

（3）剪切：将核桃蛋白凝乳与去离子水混合，配制成质量浓度为8%的悬浮液，调节pH为9.0，温度60℃，剪切时间为5min，剪切速度为8000 r/min，得到核桃蛋白悬浮液。

（4）水解：添加碱性蛋白酶（E/S=3%），酶解过程维持温度（60℃）和pH（9.0）恒定，酶解5 h后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10 min，5000 r/min离心20 min，所得上清液即为粗酶解液。

（5）后处理：采用纳滤对所制备的粗酶解液进行脱盐处理，采用截留分子量（MWCO）为150 Da的纳滤膜，物料浓度为4%，物料pH为7.0，操作温度为30℃、操作压力为0.5 MPa，循环6次，收集截留液，进行灭菌喷雾干燥处理，得到粉状的二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽。

二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽的得率为73.65%，蛋白质含量为84.05%，相对分子质量小于2000 Da的肽占80.39%。体外对二肽基肽酶Ⅳ抑制活性的IC₅₀值为0.95 mg/mL。抗氧化活性包括：体外清除DPPH自由基、ABTS自由基和羟基自由基的IC₅₀分别为0.112 mg/mL、40.021μg/mL和1.165 mg/mL。

对比实施例1

取脱脂核桃粕粉与去离子水按料液比1:10（w/v）混合，调节pH为9.0，室温搅拌60 min，3000 r/min离心20 min，收集上清液调节pH为4.5，室温搅拌60 min，3000 r/min离心20min，收集沉淀与去离子水混合，配制成质量浓度为10%的悬浮液，调节pH为9.0，温度55℃，添加碱性蛋白酶（E/S=2.0%），酶解过程维持温度（55℃）和pH 9.0恒定，酶解5h后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10 min，3000 r/min离心20 min，所得上清液即为粗酶解液。

采用纳滤对所制备的粗酶解液进行脱盐处理，采用截留分子量（MWCO）为150 Da的纳滤膜，物料浓度为5%，物料pH为7.0，操作温度为20℃、操作压力为0.4 MPa，循环6次，收集截留液，进行灭菌喷雾干燥处理，得到粉状的二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽。

二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽的得率为52.50%，蛋白质含量为87.12%，相对分子质量小于2000Da的肽占79.86%。体外对二肽基肽酶Ⅳ抑制活性的IC₅₀值为1.25 mg/mL。抗氧化活性包括：体外清除DPPH自由基、ABTS自由基和羟基自由基的IC₅₀分别为0.16 mg/mL、60.05 μg/mL和1.325 mg/mL。

对比实施例2

取脱脂核桃粕粉与去离子水混合，配制成质量浓度为10%的悬浮液，调节pH为9.0，温度55℃，添加碱性蛋白酶（E/S=2.0%），酶解过程维持温度（55℃）和pH 9.0恒定，酶解5 h后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10 min，3000 r/min离心20 min，所得上清液即为粗酶解液。

采用纳滤对所制备的粗酶解液进行脱盐处理，采用截留分子量（MWCO）为150 Da的纳滤膜，物料浓度为5%，物料pH为7.0，操作温度为20℃、操作压力为0.4 MPa，循环6次，收集截留液，进行灭菌喷雾干燥处理，得到粉状的二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽。

二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽的得率为63.31%，蛋白质含量为65.00%，相对分子质量小于2000 Da的肽占68.87%。体外对二肽基肽酶Ⅳ抑制活性的IC₅₀值为1.85 mg/mL。抗氧化活性包括：体外清除DPPH自由基、ABTS自由基和羟基自由基的IC₅₀分别为0.21 mg/mL、75.15μg/mL和1.526 mg/mL。

从上述可以看出，对比实施例1先采用传统碱提酸沉工艺制备核桃蛋白，然后酶法水解制备的核桃二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽，其肽得率显著降低；对比实施例2直接以核桃粕为原料未经处理直接酶水解制备核桃二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽，虽提高了肽得率，但蛋白质含量显著降低。可见，本发明提供的利用核桃粕制备二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽的方法，具有明显的优势，产品得率和蛋白质含量高，并且具有良好的降血糖和抗氧化功能活性。